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治疗与化疗诱发的周围神经病变相关的神经性疼痛

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本发明涉及治疗化疗诱发的周围神经病变的方法。尤其，上述方法提供如下的新方法：给药对人肝细胞生长因子(HGF)蛋白进行编码的核酸构建体，由此，减轻与化疗诱发的周围神经病变相关的神经性疼痛。本申请还提供可有效治疗神经性疼痛的核酸构建体、药理学组合物以及核酸构建体的给药方法。

著录项

公开/公告号CN112533642A

专利类型发明专利
公开/公告日2021-03-19

原文格式PDF
申请/专利权人赫利世弥斯株式会社;
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申请/专利号CN201980032948.6
发明设计人李政勋;李那姸;
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申请日2019-05-16
分类号A61K48/00(20060101);A61P25/04(20060101);A61K38/18(20060101);A61P25/00(20060101);
代理机构11038 中国贸促会专利商标事务所有限公司;
代理人郑天松
地址韩国首尔
入库时间 2023-06-19 10:18:07

说明书

技术领域

本发明涉及治疗通过化疗诱发的周围神经病变的方法。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年5月17日提交且申请号为第62/673048号的美国专利申请利益及优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

序列表

本申请包括通过EFS-Web提交的序列表，其全部内容通过引用结合在本申请中。在2019年5月14日创建的ASCII副本的名称为37238US_CRF_sequencelisting.txt，大小为81920字节(bytes)。

背景技术

化疗诱发的周围神经病变(Chemotherapy-induced peripheral neuropathy，CIPN)为特定癌症治疗的常见副作用，对于患者的长期生活质量有相当大的影响。化疗诱发的周围神经病变的症状有非正常感觉(异常感觉)、无感觉、平衡问题及疼痛。具体症状根据给药的化疗的种类不同，通常，患有化疗诱发的周围神经病变的患者发生神经性疼痛(neuropathic pain)的风险很高。

以诱发化疗诱发的周围神经病变及相关疼痛而周知的化学治疗剂包括铂类似物(platinum analog)、抗微管蛋白(紫杉烷(taxane)、长春花生物碱(vinca alkaloid)、艾日布林(eribulin))、蛋白酶体抑制剂(硼替佐米(bortezomib)、卡非佐米(carfilzomib))、免疫调节剂(沙利度胺(thalidomide)、来那度胺(lenalidomide)、泊马度胺(pomalidomide))以及通常并不视为化学治疗剂的新的生物学制剂(阿仑单抗(alemtuzumab)、易普利姆玛(ipilimumab)、本妥昔单抗(brentuximab))的一部分。这种制剂中的一部分，例如，奥沙利铂(oxaliplatin)、顺氯氨铂(cisplatin)及长春新碱(vincristine)诱发在治疗结束之后持续发展的症状。

管理化疗诱发的周围神经病变的主要目标之一为，对确切的病态生理学知之甚少。尤其，多种化学治疗剂具有以不同的病态生理学机制诱发化疗诱发的周围神经病变的可能性。尽管持续努力阐明确切的病态生理学，但尚无临床相关的适当的治疗性干预措施。

通过与其他种类的神经性疼痛相似的方式，即，物理疗法、如按摩及针灸的辅助疗法(complementary therapy)及药物治疗的组合管理与化疗诱发的周围神经病变相关的神经性疼痛。已经使用或建议使用如加巴喷丁(gabapentin)、普瑞巴林(pregabalin)、卡马西平(carbamazepine)、三环抗抑郁药(tricyclic antidepressant)、氧可酮(oxycodone)、吗啡(morphine)、美沙酮(methadone)、曲马多(tramadol)、度洛西汀(duloxetine)及文拉法辛(venlafaxine)的多种药物。但是，这些治疗法均未显示出减轻化疗诱发的周围神经病变的疼痛的真正功效，而且药物本身具有副作用。

近来，Kessler及其同事报告了在糖尿病周围神经病变中对于非病毒性肝细胞生长因子(HGF)基因治疗的成功的双盲的安慰剂-对照人2期临床试验(Kessler et al.,Annals Clin.Transl.Neurology 2(5):4650478(2015))。若向糖尿病周围神经病变患者的小腿肌肉注入用于表达人肝细胞生长因子的两个同种型的质粒VM202(pCK-肝细胞生长因子-X7)，则显著减少疼痛，经过2日的治疗足以改善3个月的生活质量并缓解症状。但是，尚未证明该治疗法可有效减轻化疗诱发的周围神经病变的疼痛。

因此，需要研发可有效治疗尚未明确病因机制和病态生理学机制的与化疗诱发的周围神经病变相关的疼痛的药物。尤其，需要评价VM202(pCK-肝细胞生长因子-X7)是否有效减轻化疗诱发的周围神经病变的疼痛。

发明内容

技术问题

根据一部分实施方式，本发明涉及如下的方法：给药对人肝细胞生长因子蛋白进行编码的核酸构建体(construct)，由此，治疗与神经病变-诱发治疗剂暴露相关的神经性疼痛。

上述方法可包括向之前暴露在治疗剂的对象体(subject)给药第一治疗有效剂量(first therapeutically effective amount)的对人肝细胞生长因子蛋白的两个同种型(isoform)进行编码的核酸构建体(nucleic acid construct)的步骤，上述核酸构建体包含：包含人肝细胞生长因子基因的外显子(exon)1至外显子4的第一序列或第一序列的简并序列(degenerate sequence)；包含人肝细胞生长因子基因的内含子(intron)4的第二序列或第二序列的片段(fragment)；以及包含人肝细胞生长因子基因的外显子5至外显子18的第三序列或第三序列的简并序列。

在一部分实例中，上述神经病变-诱发治疗剂为化疗药物。上述化疗药物选自由植物碱(plant alkaloid)、紫杉烷、埃博霉素(epothilone)、蛋白酶体抑制剂(proteasomeinhibitor)、免疫调节剂(immunomodulator)及抗肿瘤生物制剂(antineoplasticbiologic)组成的组中。在一部分实例中，化学药物为长春新碱、硼替佐米、紫杉醇(paclitaxel)或顺氯氨铂。

在一部分实例中，上述对象体为人类患者。在一部分实例中，上述对象体患有癌症(cancer)。

在一部分实例中，在给药第一治疗有效剂量的核酸构建体的步骤之后，上述方法还包括在一周以上之后向对象体再次给药核酸构建体的步骤。在一部分实例中，在给药第一治疗有效剂量的核酸构建体之后的至少2周、3周、4周、5周或10周后执行上述再次给药的步骤。在一部分实例中，在给药第一治疗有效剂量的核酸构建体之后的至少10日、15日、20日、30日、40日、50日或100日后执行上述再次给药的步骤。在一部分实例中，在给药第一治疗有效剂量的核酸构建体的步骤与上述再次给药的步骤之间，不向上述对象体给药核酸构建体。

在一部分实例中，上述第一序列及上述第三序列没有内含子。在一部分实例中，肝细胞生长因子的两个同种型包括全长肝细胞生长因子(full-length HGF，flHGF)及缺失变体肝细胞生长因子(deleted variant HGF，dHGF)。全长肝细胞生长因子(flHGF)可包含序列1的多肽。缺失变体肝细胞生长因子(dHGF)可包含序列2的多肽。

在一部分实例中，上述第一序列包含序列3的多核苷酸。在一部分实例中，上述第二序列包含序列6的多核苷酸。在一部分实例中，上述第三序列包含序列4的多核苷酸。

在一部分实例中，上述核酸构建体包含序列13的多核苷酸。在一部分实例中，上述核酸构建体还包含pCK载体。

在一部分实例中，上述给药第一治疗有效剂量的核酸构建体的步骤或上述再次给药的步骤包括一个以上的核酸构建体的洁柔内注射(intramuscular injection)。在一部分实例中，上述核酸构建体的第一治疗有效剂量的剂量在1μg至100mg之间、10μg至50mg之间、100μg至10mg之间、1mg至25mg之间或1mg至10mg之间。

根据一部分其他实施方式，本发明涉及对用于治疗与神经病变-诱发治疗剂暴露相关的神经性疼痛的人肝细胞生长因子进行编码的核酸构建体。上述核酸构建体可包含：包含人肝细胞生长因子基因的外显子1至外显子4的第一序列或上述第一序列的简并序列；包含人肝细胞生长因子基因的内含子4的第二序列或上述第二序列的片段；以及包含人肝细胞生长因子基因的外显子5至外显子18的第三序列或上述第三序列的简并序列。根据另一实施方式，本发明提供包含对用于治疗与神经病变-诱发治疗剂暴露相关的神经性疼痛的人肝细胞生长因子进行编码的核酸构建体的药剂学组合物。

技术方案

详细说明

1.定义

除非另行定义，在本说明书使用的所有技术术语及科学术语具有本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的含义。如在本说明书中使用，以下术语具有如下的含义。

在本说明书中使用的术语“肝细胞生长因子的同种型(isoform of HGF)”意味着具有与在动物自然产生的肝细胞生长因子多肽的氨基酸序列相同至少80％的氨基酸序列的多肽。上述术语包括具有与任意全长(fulllength)野生型肝细胞生长因子多肽相同至少80％的氨基酸序列的多肽，包括具有与自然产生的肝细胞生长因子等位基因变体、剪接变体或缺失变体相同至少80％的氨基酸序列的多肽。在本发明中可优选使用的肝细胞生长因子的同种型包括选自由全长肝细胞生长因子(同义词，fHGF)、缺失变体肝细胞生长因子、神经激肽1(Neurokinin-1，NK1)、神经激肽2(NK2)以及神经激肽4(NK4)组成的组中的两个以上的同种型。根据本发明的更优选实例，在本说明书记载的方法中使用的肝细胞生长因子的同种型包括全长肝细胞生长因子及缺失变体肝细胞生长因子。

本发明的术语“人全长肝细胞生长因子”、“全长肝细胞生长因子(flHGF)”及“全长肝细胞生长因子(fHGF)”为了指代由人肝细胞生长因子蛋白的氨基酸1至728组成的蛋白质而在本申请中互换使用。在序列1中提供全长肝细胞生长因子的序列。

本发明的术语“人全长肝细胞生长因子”及“缺失变体肝细胞生长因子”为了指代通过人肝细胞生长因子基因的选择性剪接生成的肝细胞生长因子蛋白的缺失变体而在本申请中互换使用。具体地，“人全长肝细胞生长因子”或“缺失变体肝细胞生长因子”意味着在从全长肝细胞生长因子序列开始的α链的第一三环结构域(kringle domain)中缺失5个氨基酸(F、L、P、S以及S)的人肝细胞生长因子蛋白。人全长肝细胞生长因子为723个氨基酸长度。在序列2中提供人全长肝细胞生长因子的氨基酸序列。

在本说明书中使用的术语“治疗”意味着(a)抑制神经性疼痛、(b)缓解神经性疼痛以及(c)消除神经性疼痛的所有行为。在一部分实例中，本发明的组合物可通过神经细胞的生长或抑制神经细胞凋亡来治疗神经性疼痛。

在本说明书中使用的术语“治疗有效剂量(therapeutically effective dose)”或“有效剂量(effective amount)”意味着给药并实现所要的效果的剂量或量。在本发明的方法的脉络中，治疗有效剂量为可有效减轻与化疗诱发的周围神经病变相关的神经性疼痛的量。

在本说明书中使用的术语“充足的量”意味着足以实现所要的效果的量。

在本说明书中使用的术语“简并序列(degeneratesequence)”意味着提供从参照核酸序列翻译的氨基酸序列相同的氨基酸序列而能够翻译的核酸序列。

2.其他解释规则(Other interpretational conventions)

本说明书中提及的范围对于包括所提及的端点在内的范围内所有值的简称。例如，1至50的范围包括由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49及50组成的组中的任意数字、数字的组合或子范围。

除非另行提出，则涉及具有一个以上的立体中心的化合物是指各个立体异构体及其的立体异构体的所有组合。

3.治疗与化疗诱发的周围神经病变相关的神经性疼痛的方法

根据第一实施方式，本发明的方法为了治疗与化疗诱发的周围神经病变相关的神经性疼痛而提出。在典型实例中，上述方法包括向暴露在诱发周围神经病变的治疗剂的对象体给药治疗有效剂量的表达人肝细胞生长因子蛋白的两个同种型的步骤。

3.1.表达两个肝细胞生长因子同种型的核酸构建体

在本说明书中记载的方法中，核酸构建体表达人肝细胞生长因子蛋白的至少两个同种型。在一部分实例中，上述核酸构建体表达两个同种型。在典型实例中，上述核酸构建体表达全长肝细胞生长因子及缺失变体肝细胞生长因子中的至少一个。在特定实例中，上述核酸构建体表达全长肝细胞生长因子及缺失变体肝细胞生长因子两者。

全长肝细胞生长因子及缺失变体肝细胞生长因子共享各种生物学功能，但是，在免疫学特性和各种生物学特性实施方式有所不同。例如，在人脐带静脉内皮细胞、动脉平滑肌细胞及NSF-60(小鼠骨髓母细胞)中促进脱氧核糖核酸(DNA)合成的方面，相比于缺失变体肝细胞生长因子，全长肝细胞生长因子分别示出高约20倍、10倍及2倍的活性。相反，在促进LLC-PK1(猪肾上皮细胞)、OK(美洲负鼠肾上皮细胞)及小鼠间质细胞的脱氧核糖核酸的合成的方面，相比于全长肝细胞生长因子，缺失变体肝细胞生长因子分别示出高约3倍及2倍的活性。并且，相比于缺失变体肝细胞生长因子，全长肝细胞生长因子在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中示出高约70倍的溶解度。几种抗-缺失变体肝细胞生长因子单克隆抗体仅识别缺失变体肝细胞生长因子，这意味着全长肝细胞生长因子与缺失变体肝细胞生长因子的三维结构不同。

3.1.1.表达序列

在一部分实例中，构建体包含与各个同种型编码序列(codingsequence，CDS)有关的表达调节序列，表达肝细胞生长因子的两个以上的同种型。在一部分实例中，例如，上述构建体以(1)表达调节序列-(2)第一同分异构物(isomer)编码序列-(3)内部核糖体进入位点(IRES，internal ribosomal entry site)-(4)第二同分异构物编码序列-(5)转录终止序列的顺序在两个编码序列之间包含内部核糖体进入位点。内部核糖体进入位点使得翻译从内部核糖体进入位点序列开始来允许表达关注单一构建体的两个基因。在追加实例中，为了在给药的对象体中诱导肝细胞生长因子的一个以上的同种型的表达而一同使用分别对肝细胞生长因子的单一同种型进行编码的多个构建体。

在优选实例中，本发明的方法包括选择性剪接部位，由此，使用同时表达肝细胞生长因子的两个以上的不同类型的同种型，即，全长肝细胞生长因子及缺失变体肝细胞生长因子的构建体。作为参照包括在本说明书的美国专利第7812146号中已证明，通过选择性剪接对肝细胞生长因子的两个同种型(全长肝细胞生长因子及缺失变体肝细胞生长因子)进行编码的构建体的表达效率比对肝细胞生长因子的一个同种型(全长肝细胞生长因子或缺失变体肝细胞生长因子中的一个)进行编码的构建体的表达效率更高(几乎高250倍)。在典型实例中，上述构建体包含：(i)包含人肝细胞生长因子基因的外显子1至外显子4的第一序列或上述第一序列的简并序列；(ii)包含人肝细胞生长因子基因的内含子4的第二序列或上述第二序列的片段；以及(iii)包含人肝细胞生长因子基因的外显子5至外显子18的第三序列或上述第三序列的简并序列。可通过外显子4与外显子5之间的选择性剪接从上述构建体生成肝细胞生长因子的两个同种型(全长肝细胞生长因子及缺失变体肝细胞生长因子)。

在一部分实例中，上述构建体包含内含子4的全序列。在一部分实例中，上述构建体包含内含子4的片段。在优选实例中，上述构建体包含选自由序列7至序列14组成的组中的核苷酸序列。序列7的核苷酸序列为7113bp，与包含内含子4的全序列的构建体相应。序列8至14的核苷酸序列与包含内含子4的多种片段的构建体相应。

为了诱导全长肝细胞生长因子及缺失变体肝细胞生长因子两者的表达，内含子4的多种片段可向外显子4与外显子5之间插入。例如，可使用(i)序列7的核苷酸483-2244及核苷酸3168-5438；(ii)序列7的核苷酸483-2244及核苷酸4168-5438；(iii)序列7的核苷酸483-2244及核苷酸5117-5438；(iv)序列7的核苷酸483-728及核苷酸2240-5438；(v)序列7的核苷酸483-728及核苷酸3168-5438；(vi)序列7的核苷酸483-728及核苷酸4168-5438；或(vii)序列7的核苷酸483-728及核苷酸5117-5438。

因此，在本发明的方法中使用的构建体包含：(i)(外显子1至外显子4)-(序列7的核苷酸483-5438)-(外显子5至外显子18)；(ii)(外显子1至外显子4)-(序列7的核苷酸483-2244及核苷酸3168-5438)-(外显子5至外显子18)；(iii)(外显子1至外显子4)-(序列7的核苷酸483-2244及核苷酸4168-5438)-(外显子5至外显子18)；(iv)(外显子1至外显子4)-(序列7的核苷酸483-2244及核苷酸5117-5438)-(外显子5至外显子18)；(v)(外显子1至外显子4)-(序列7的核苷酸483-728及核苷酸2240-5438)-(外显子5至外显子18)；(vi)(外显子1至外显子4)-(序列7的核苷酸483-728及核苷酸3168-5438)-(外显子5至外显子18)；(vii)(外显子1至外显子4)-(序列7的核苷酸483-728及核苷酸4168-5438)-(外显子5至外显子18)；或(viii)(外显子1至外显子4)-(序列7的核苷酸483-728及核苷酸5117-5438)-(外显子5至外显子18)。

将包含与人肝细胞生长因子的外显子1至外显子18及人肝细胞生长因子基因的内含子4相应的互补脱氧核糖核酸(cDNA)或其片段的多种核酸构建体命名为“肝细胞生长因子-X”，后接唯一编号。如下述表1的总结，申请人所生成并试验的肝细胞生长因子-X包含具有序列7至序列14的核苷酸序列的肝细胞生长因子-X1、肝细胞生长因子-X2、肝细胞生长因子-X3、肝细胞生长因子-X4、肝细胞生长因子-X5、肝细胞生长因子-X6、肝细胞生长因子-X7以及肝细胞生长因子-X8，但并不局限于此。

表1

申请人先前已证明，如其全部内容通过引用结合在本申请中的美国专利第7812146号所公开的内容，肝细胞生长因子-X7示出最高的表达效率。因此，包含肝细胞生长因子-X7的核酸构建体可用于本发明的方法的优选实例中。

在本发明中使用的肝细胞生长因子同种型的氨基酸序列及核苷酸序列还可包含实质上与野生型人肝细胞生长因子同种型的序列相同的氨基酸序列及核苷酸序列。当野生型人肝细胞生长因子同种型的氨基酸序列或核苷酸序列最大限度地与一个序列整列时，实质相同性包含具有至少80％的相同性的序列，更优选地，包含具有至少90％的相同性的序列，并且，最优选地，包含具有至少95％相同性的序列。用于比较的序列整列方法在本领域众所周知。多种程序及整列算法记载于如下文献：Smith及Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)；Needleman及Wunsch,J.Mol.Bio.48:443(1970)；Pearson及Lipman,Methods inMol.Biol.24:307-31(1988)；Higgins及Sharp,Gene 73:15237-44(1988)；Higgins及Sharp,CABIOS 5:151-3(1989),Corpet et al.,Nuc.Acids Res.16:10881-90(1988)；Huang et al.,Comp.Appl.BioSci.8:155-65(1992)；以及Pearson et al.,Meth.Mol.Biol.24:307-31(1994)。美国国家生物技术信息中心(NCBI)生物大分子序列比对搜索工具(BLAST，Basic Local Alignment Search Tool)[Altschul 20et al.,J.Mol.Biol.215:403-10(1990)]可利用于包括用于与序列分析程序blastp、blasm、blastx、tblastn及tblastx联接的互联网和美国国家生物技术信息中心(NCBI，NationalCenter for Biological Information,Bethesda,Md.)在内的多个来源。可在美国国立卫生研究院(NIH，National Institute of Health)隶属美国国家生物技术信息中心的官方网站查找与通过使用生物大分子序列比对搜索工具及程序来确定序列识别的方法有关的说明。

3.1.2载体(vector)

在本发明的方法中使用的构建体通常包含具有以可操作的方式与表达的序列连接的一个以上的调节序列(例如，启动子或增强子)的载体。调节序列调节肝细胞生长因子的同种型的表达。

优选地，对肝细胞生长因子蛋白的一个以上的同种型进行编码的多核苷酸在表达构建体中以可操作的方式与启动子连接。上述术语“以可操作的方式连接(operativelylinked)”意味着核酸表达调节序列(例如，启动子、信号序列或转录因子结合部位的阵列)与第二核酸序列之间的功能性连接，上述表达调节序列影响与第二序列相应的核酸的转录和/或翻译。

在典型实例中，为了调节多核苷酸的转录，优选地，与多核苷酸连接的启动子可在动物启动，更优选地，与多核苷酸连接的启动子可在哺乳动物细胞启动，包括源于哺乳动物细胞的基因组(genome)或哺乳动物病毒的启动子，例如，巨细胞病毒(CMV，cytomegalovirus)启动子、腺病毒晚期启动子、牛痘病毒(vaccinia virus)7.5K启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV tk)启动子、呼吸道合胞病毒(RSV)启动子、EF1-α启动子、金属硫蛋白(metallothionein)启动子、β-肌动蛋白启动子、人白细胞介素-2(IL-2)基因启动子、人干扰素(IFN)基因启动子、人白细胞介素-4(IL-4)基因启动子、人淋巴毒素基因启动子以及人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因启动子，但并不局限于此。更优选地，本发明中有用的启动子为人巨噬细胞(hCMV)的立即早期(IE，immediate early)基因或EF1-α启动子，最优选地，为源于包含跨越抗胸腺细胞球蛋白(ATG)起始密码子之前的序列的外显子1及外显子2序列的全序列的人巨噬细胞立即早期基因的启动子/增强子及源于5'-UTR(非翻译区，untranslated region)的启动子。

在本发明中使用的表达盒包含多腺苷酸化序列，例如，牛生长激素终止子(Gimmi,ER,et al.,Nucleic Acids Res.17:6983-6998(1989))、源于猿猴病毒40的多腺苷酸化序列(Schek,N,et al.,Mol.Cell Biol.12:5386-5393(1992))、人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)多聚腺苷酸(polyA)(Klasens,BIF,et al.,Nucleic Acids Res.26:1870-1876(1998))、β-珠蛋白多聚腺苷酸(Gil,A.et al.,Cell 49:399-406(1987))、单纯疱疹病毒胸苷激酶多聚腺苷酸(Cole,CN及TP Stacy,Mol.Cell.5Biol.5:2104-2113(1985))或多瘤病毒多聚腺苷酸(Batt,D.Band GG Carmichael,Mol.Cell.Biol.15:4783-4790(1995))，但并不限定于此。

3.1.2.1.非病毒载体(Non-viral Vector)

在一部分实例中，核酸构建体为可表达肝细胞生长因子的两个以上的同种型的非病毒载体。

在典型实例中，非病毒载体为质粒。通常，在优选实例中，上述质粒为pCK、pCP、pVAX1或pCY。尤其，在优选实例中，上述质粒为pCK，可在WO 2000/040737及Lee etal.Biochem.Biophys.Res.Comm.272:230–235(2000)查找详细事项，其全部内容通过引用结合在本申请中。上述pCK载体具有序列5的多核苷酸。转化为pCK的大肠杆菌(E.coli)根据布达佩斯条约于2003年3月21日保藏于韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center ofMicroorganisms，KCCM)(保藏编号：KCCM-10476)。

尤其，在优选实例中，包含肝细胞生长因子-X7表达序列的pCK质粒在本发明的方法中用作核酸构建体。在优选一实例中，pCK-肝细胞生长因子-X7(也称为VM202)根据布达佩斯条约以保藏编号KCCM-10361保藏于韩国微生物保藏中心(以转化为上述质粒的大肠杆菌菌株的形态)。

3.1.2.2.病毒载体(viral vector)

在另一实例中，在本领域公知的多种病毒载体可用于传递并表达本发明的肝细胞生长因子蛋白的一个以上的同种型。例如，通过使用逆转录酶病毒(retrovirus)、慢病毒(lentivirus)、腺病毒(adenovirus)或腺相关病毒(adeno-associated virus)研发的载体可用于本发明的一部分实例。

(a)逆转录酶病毒

可携带较大的外源基因的逆转录酶病毒将其基因组整合为宿主基因组，并具有广泛的宿主谱，因此，用作病毒基因传递载体。

为了构建逆转录病毒载体，本发明的多核苷酸代替特定病毒序列来向病毒基因组插入，由此，生成具有复制缺陷(replication-defective)的病毒。为了生产病毒体(virion)，构建了没有长末端重复(LTR，long terminal repeat)及W成分且包含gag、pol以及env基因的包装(packaging)细胞株(Mann et al.,Cell,33:153-159(1983))。在包含本发明的多核苷酸的重组质粒的情况下，长末端重复及W向该细胞株导入，W序列使重组质粒的核糖核酸(RNA)转录物包装于病毒粒子，之后，分泌到培养基(Nicolas及Rubinstein"Retroviralvectors",In:Vectors:A survey of molecular cloning vectors and theiruses,Rodriguez and Denhardt(eds.),Stoneham:Butterworth,494-513(1988))。之后，收集包含重组逆转录酶病毒的培养基，选择性浓缩来用于向基因传递。

已报告使用第二代逆转录病毒载体的成功的基因传递。在Kasahara et al.(Science,266:1373-1376(1994))中，红细胞生成素(EPO，erythropoietin)序列向外皮(envelope)部位插入，最终制备了生成具有新的结合特性的嵌合蛋白的莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus)的变体。本基因传递系统可根据第二代逆转录病毒载体的构建战略构建。

(b)慢病毒

慢病毒还可用于本发明的一部分实例中。慢病毒为逆转录酶病毒的亚纲(subclass)。但是，慢病毒可整合到非分裂细胞(non-dividing cell)的基因组，相反，逆转录酶病毒仅能够感染分裂细胞。

慢病毒载体在转化为多个质粒的包装细胞株生成，通常在HEK293生成。上述质粒包含(1)对如衣壳(capsid)及逆转录酶(reverse transcriptase)的病毒体蛋白进行编码的包装质粒以及(2)包含待传递至靶的外源基因的质粒。

当病毒进入细胞时，核糖核酸形态的基因组(viral genome)被逆转录来生成脱氧核糖核酸，之后，通过病毒整合酶(integrase)插入至基因组。因此，与慢病毒载体一同传递的外源物质可残留在基因组，当分裂时，传递至细胞的后代。

(c)腺病毒

腺病毒为中等大小的基因组，由于操作的容易性、高滴度(titer)、宽靶细胞范围及高感染性，通常用作基因传递系统。在病毒基因组的两侧末端包含作为病毒脱氧核糖核酸复制及包装所需的顺式(cis)要素的100-200bp末端反向重复(ITR，invertedterminalrepeat)。El区(ElA及ElB)对负责病毒基因组的转录调节的蛋白质和集中细胞基因进行编码。E2区(E2A及E2B)的表达导致用于复制病毒脱氧核糖核酸的蛋白质的合成。

在目前为止研发的腺病毒载体中，通常使用E1区缺失的复制缺陷(replicat ionincompetent)腺病毒。在腺病毒载体缺失的E3区可提供对于转基因(transgene)的插入部位(Thimmappaya,B.et al.,Cell,31:543-551(1982)；及Riordan,JR et al.,Science,245:1066-1073(1989))。因此，优选地，装饰(decroin)-编码核苷酸序列插入至缺失的E1区(ElA区和/或ElB5区，优选地，ElB区)或缺失的E3区中的一个。本发明的多核苷酸可插入至缺失的E4区。病毒基因组序列中提及的术语“缺失(deletion)”包括全部缺失及部分缺失。在自然中，腺病毒可包装野生型基因组的约105％，可额外提供提供约2kb的脱氧核糖核酸容量(Ghosh-Choudhury et al.,EMBO J.'6:1733-1739(1987))。与之相关地，插入至腺病毒的上述外缘序列还可插入至腺病毒野生型基因组。

上述腺病毒可以为公知的血清型(serotype)或亚组(subgroup)A-F中的一种。C亚组的腺病毒5型为用于构建本发明的腺病毒基因传递系统的最优选的起始物质。已公知诸多与腺病毒5型有关的生化信息及遗传信息。通过腺病毒基因传递系统传递的外源基因为附加体(episome)，对于宿主细胞具有遗传毒性(genotoxicity)。因此，利用腺病毒基因传递系统的基因治疗相当安全。

(d)腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)

腺相关病毒可感染非分裂细胞及多种类型的细胞，可用于构建本发明的基因传递系统。在美国专利第5139941号及第4797368号详细说明腺相关病毒载体的使用及制备。

在LaFace et al.,Viology,162:483486(1988)、Zhou et al.,Exp.Hematol.(NY),21:928-933(1993)、Walsh et al,J.Clin.Invest.,94:1440-1448(1994)及Flotteet al.,Gene Therapy,2:29-37(1995)公开作为基因传递系统的与腺相关病毒有关的研究结果。通常，重组腺相关病毒通过对包含在侧面具有两个腺相关病毒末端反复(terminalrepeat)(McLaughlin et al.,1988；Samulski et al.,1989)的目标基因(即，将传递的目标核苷酸序列及装饰基因)的质粒及包含没有末端反复的野生型腺相关病毒编码序列的表达质粒(McCarty et al.,J.Viral.,65:2936-2945(1991))进行共转染(cotransfection)来制备。

(e)其他病毒载体

其他病毒载体可在本发明中用作基因传递系统。如牛痘病毒(vacciniavirus)(Puhlmann M.et al.,Human Gene Therapy 10:649-657(1999)；Ridgeway,"Mammalianexpression vectors,"In:Vectors:A survey of molecule cloning vector and itsuses.Rodriguez及Denhardt,eds.Stoneham:Butterworth,467-492(1988)；Baichwal及Sugden,"Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses:Transientand stable expression of transferred genes"In:Kucherlapati R,ed.Genetransfer.New York:Plenum Press,117-148(1986)及Coupar et al.,Gene,68:1-10(1988))、慢病毒(Wang G.et al.,J.Clin.Invest.104(11):RS 5-62(1999))及单纯疱疹病毒(Chamber R.,et al.,Proc.Natl.10 15Acad.Sci USA 92:1411-1415(1995))的源于病毒的载体可用于本发明的传递系统，来向细胞传递本发明的所有多核苷酸。

3.2.化疗诱发的周围神经病变-诱发治疗剂

在多种实例中，哺乳动物已接触的神经病变-诱发治疗剂为化疗药物。

在特定实例中，化疗药物为铂(platinum)类似物。在特定实例中，上述药物为顺氯氨铂、卡铂(carboplatin)或奥沙利铂。在特定实例中，上述化疗药物为抗有丝分裂剂(anti-mitotic agent)。在特定实例中，上述药物为紫杉烷。在特定实例中，上述紫杉烷为紫杉醇(paclitaxel，

对象体包括暴露在化疗药物或将要暴露在化疗药物的非人类哺乳动物及人类。

3.3.给药顺序

在典型实例中，核酸构建体向先前暴露在神经病变-诱发治疗剂的对象体给药。在一部分实例中，核酸构建体与神经病变-诱发治疗剂一同向对象体给药。在一部分实例中，核酸构建体在对象体暴露在神经病变-诱发治疗剂之前给药。在一部分实例中，核酸构建体在暴露在化疗药物之前和之后均给药。

在一部分实例中，上述方法还包括在给药步骤之后的一周之后再次向哺乳动物给药脱氧核糖核酸的步骤。在一部分实例中，在给药步骤之后的至少2周、3周、4周、5周或10周后执行再次给药的步骤。在一部分实例中，在给药步骤之后的至少10日、15日、20日、30日、40日、50日或100日后执行再次给药的步骤。在一部分实例中，在给药步骤与再次给药的步骤之间不向哺乳动物给药核酸构建体。

3.4.传递方法

在本说明书中记载的方法中，为了给药用于表达肝细胞生长因子的一个以上的同种型的多核苷酸构建体，可使用多种传递方法。

3.4.1.注射(Injection)

在典型实例中，核酸构建体通过液体药剂学组合物的注射给药。

通常，在优选实例中，多核苷酸构建体通过肌肉注射给药。通常，多核苷酸构建体通过肌肉注射向疼痛部位或与患者所感知的疼痛部位接近的位置给药。在一部分实例中，多核苷酸构建体向对象体的手、脚、腿或胳膊的肌肉给药。

在一部分实例中，构建体向皮下(subcutaneously)或皮内(intradermally)注射。

在一部分实例中，多核苷酸构建体通过血管内(intravascular)传递给药。在特定实例中，构建体通过逆行静脉注射(retrograde intravenous injection)进行注射。

3.4.2.电穿孔法(Electroporation)

在一部分情况下，在注入后执行电穿孔来改善质粒脱氧核糖核酸的细胞体内(invivo)的转化效率。因此，在一部分实例中，在注射后通过电穿孔给药多核苷酸。在特定实例中，电穿孔通过使用TriGrid

3.4.3.超声波穿孔发(Sonoporation)

在一部分实例中，超声波穿孔发为了提高本发明的构建体的转化效率而使用。超声波穿孔发通过使用超声波使细胞膜暂时具有渗透性，由此允许脱氧核糖核酸的细胞内吸收。多核苷酸构建体可整合在微泡内，以全身循环给药之后，可接着执行超声波的外部适用。超声波诱导靶组织内的微泡的空化(cavitation)，由此导致构建体的释放及转染(transfection)。

3.4.4.磁转染(Magnetofection)

在一部分实例中，磁转染(magnetofection)为了提高本发明的构建体的转化效率而使用。上述构建体在磁性(magnetic)纳米粒子耦合后给药。若适用高梯度的外部磁铁，则复合物被靶捕捉并固定。多核苷酸构建体可通过交联分子的酶切断、电荷相互作用或矩阵的分解释放。

3.4.5.脂质体(Liposome)

在一部分实例中，本发明的多核苷酸可通过脂质体传递。脂质体在磷脂在过量的水性媒介物中悬浮时自发形成。如Nicolau and Sene,Biochim.Biophys.Acta,721:185-190(1982)及Nicolau et al.,Methods Enzymol.,149:157-176(1987)所记述，脂质体-媒介物核酸传递非常成功。通过使用脂质体来转染动物细胞的可购买的试剂的例包括脂质体(Lipofectamine，Gibco BRL)。捕获本发明的多核苷酸的脂质体通过如内吞作用(endocytosis)、吸附(adsorption)及融合(fusion)的机制与细胞相互作用后，向细胞内传递序列(sequence)。

3.4.6.转染

在为了传递对肝细胞生长因子进行编码的多核苷酸而使用病毒载体的情况下，多核苷酸序列可通过本领域公知的多种病毒感染方法向细胞内传递。在上述说明中提及的参照文献中记述使用病毒载体的宿主细胞的感染。

优选地，本发明的药剂学组合物可非口服给药。在非口服给药的情况下，可利用静脉注射、腹腔注射(intraperitoneal injection)、肌肉注射、皮下注射(subcutaneousinjection)或局部注射(local injection)。例如，上述药剂学组合物可通过逆行静脉注射(retrograde intravenous injection)注射。

优选地，本发明的药剂学组合物可向肌肉内给药。在一部分实例中，上述给药以受到神经性疼痛的影响的肌肉为靶。

3.5.剂量(Dose)

多核苷酸构建体以治疗有效剂量给药。在本说明书中记载的方法中，上述治疗有效剂量为可有效减轻对象体的神经性疼痛的剂量。

在本说明书中记载的方法的一部分实例中，多核苷酸构建体以1μg至200mg、1mg至200mg、1mg至100mg、1mg至50mg、1mg至20mg或5mg至10mg的总剂量给药。在一部分实例中，多核苷酸构建体以2mg、4mg、8mg、16mg、32mg或64mg的总剂量给药。

在多种实例中，上述总剂量被分为多个单独注射剂量。在一部分实例中，上述总剂量被分为多个相同的注射剂量。在一部分实例中，上述总剂量被分为不相同的注射剂量。在多种分割的剂量的实例中，上述总剂量向4个、8个、16个、24个、32个或64个不同的注射部位给药。在一部分实例中，每个注射部位的注射剂量在0.1mg至5mg之间。在特定实例中，每个注射部位的注射剂量为0.1mg、0.15mg、0.2mg、0.25mg、0.3mg、0.35mg、0.4mg、0.45mg、0.5mg或1mg。

在典型的分割的剂量的实例中，多个注射剂量在彼此的一小时之内给药。在一部分实例中，多个注射剂量均在彼此的1.5小时、2小时、2.5小时或3小时之内给药。

在上述方法的多种实例中，多核苷酸构建体的总剂量以一个单一剂量给药或分为多个注射剂量来向对象体给药仅一次。在另一实例中，多核苷酸构建体在初始给药数日之后再次给药。在一部分实例中，多核苷酸构建体在初始给药的约3日、5日、10日、15日、20日、25日、30日或35日后再次给药。在一部分实例中，多核苷酸构建体在初始给药后的1/2周、1周、2周、3周、4周、5周、7周、9周或10周后再次给药。在一部分实例中，多核苷酸在初始给药后的1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月或10个月后再次给药。在一部分实例中，后续总剂量与初始总剂量相同。在一部分实例中，后续剂量与初始总剂量不同。在一部分实例中，药剂学组合物2个月给药1次、1个月给药1次、1个月给药2～4次、1周给药1次或2周给药1次。

在一部分实例中，通过1次、2次、3次或4次访问向多个注射部位给药总剂量的多核苷酸构建体的步骤可包括单一循环(cycle)。尤其，通过2次访问向多个注射部位给药32mg、16mg、8mg或4mg的多核苷酸构建体的步骤可包括单一循环。2次访问可间隔3日、5日、7日、14日、21日或28日。

在一部分实例中，可反复上述循环。上述循环可反复2次、3次、4次、5次、6次或6次以上。在一部分实例中，上述循环可在之前循环之后反复1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或10个月以上。

在一部分实例中，在后续循环给药的总剂量与在之前循环给药的总剂量相同。在一部分实例中，在后续循环给药的总剂量与在之前循环给药的总剂量不同。

在一部分实例中，多核苷酸构建体向每个患部(affected site)(例如，受影响的四肢(affectedlimb))给药8mg的剂量，均分为多个注射及多个访问，在任意一次访问中，多个注射分别在单独的注射部位执行。在特定实例中，脱氧核糖核酸构建体向每个患部给药8mg的剂量，均分为在第0日向每个部位给药4mg的第一计量和在第14日向每个部位给药4mg的第二剂量，第一剂量及二剂量分别均分为多个注射剂量。在一部分实例中，向每个患部给药8mg的可构成循环，上述循环可反复1次、2次、3次或3次以上。

给药的实际量、给药速度及时间-搓成可根据所治疗的疼痛的性质及严重程度不同。在典型实例中，多核苷酸构建体以能够有效减轻神经性疼痛的量(amount)给药。在一部分实例中，上述量(amount)可在给药1周以内有效减轻神经性疼痛。在一部分实例中，上述量在给药2周、3周或4周以内有效减轻神经性疼痛。在一部分实例中，为了诱导肝细胞生长因子的两个同种型，即，对长肝细胞生长因子进行编码的第一构建体及对缺失变体肝细胞生长因子进行编码的第二构建体的表达，一同给药两个不同类型的构建体。在一部分实例中，为了诱导全长肝细胞生长因子及缺失变体肝细胞生长因子两者的表达，传递对全长肝细胞生长因子及缺失变体肝细胞生长因子两者进行编码的单一构建体。

根据普通技术人员所公知的常规技术，如上所述，药剂学组合物可与药剂学上可接受的载体和/或运载体(vehicle)一同剂型化，最终可提供多种形态的单位容剂量态及多重剂量形态。作为剂型(formulation)的非限制性例，包括油性或水性媒介物中的溶液(solution)、悬浮液(suspension)或乳剂(emulsion)、提取物(extract)、酏剂(elixir)、粉末(powder)、颗粒(granule)、片剂(tablet)以及胶囊(capsule)，但并不局限于此)，还可包括分散剂(dispersion agent)或稳定剂(stabilizer)。

3.6.变体(Variation)

可选择性使用体内(in vivo)和/或体外(in vitro)分析，由此，有助于确认最佳容量范围。并且，用于急性的准确剂量根据化疗药物、给药凸镜及状态的严重程度不同，需根据医生的判断和各个对象体的情况确定。可通过外推法(extrapolation)从源于体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线推定有效剂量。

在一部分实例中，上述方法还包括诊断化疗诱发的周围神经病变及疼痛状态的步骤。诊断可包括通过神经传导研究的肌电图检查、用于评价皮肤神经分布的皮肤活检以及用于组织病理学评价的神经及肌肉活检。

多核苷酸构建体可根据将要治疗的状态同时给药或依次给药、单独给药或与其他治疗组合来给药。

4.药剂学组合物

在典型实例中，核酸构建体以液体药剂学组合物给药。

4.1.适合注射的药剂学组合物及单位剂量形态

为了静脉(intravenous)注射、肌肉(intramuscular)注射、皮内注射或皮下注射，核酸构建体为没有发热源(pyrogen-free)、具有适当的pH值、等渗性及稳定性的可非口服的水溶液形态。例如，普通技术人员可使用如氯化钠注射液(Sodium ChlorideInjection)、林格注射液(Ringer’s Injection)、乳酸钠林格注射液(Lactated Ringer’sInjection)的等渗性运载体容易制备适合的溶液。根据需求，可包含保鲜剂(preservative)、稳定剂(stabilizer)、缓冲剂(buffer)、抗氧化剂(antioxidant)和/或其他添加剂(additive)。

在多种实例中，核酸构建体以0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml或1mg/ml的浓度存在于液体组合物。在一部分实例中，单位剂量形态为包含0.01mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml或1mg/ml浓度的2ml的药剂学组合物的小瓶(vial)。

在一部分实例中，单位剂量形态为小瓶、安瓶、瓶或事先填充的注射器。在一部分实例中，单位机灵形态包含0.01mg、0.1mg、0.2mg、0.25mg、0.5mg、1mg、2.5mg、5mg、8mg、10mg、12.5mg、16mg、24mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg或200mg的本发明的多核苷酸。

在典型实例中，单位剂量形态的药剂学组合物为液体形态。在多种实例中，单位剂量形态包含0.1ml至50ml之间的药剂学组合物。在一部分实例中，单位剂量形态包含0.25ml、0.5ml、1ml、2.5ml、5ml、7.5ml、10ml、25ml或50ml的药剂学组合物。

在特定实例中，在适合皮下、皮内或肌肉给药的单位剂量形态实例中，单位剂量形态为包含1ml的药剂学组合物的小瓶，包括事先加载的注射器(preloaded syringe)、自动注射器(auto-injector)及自动注射笔(auto-inject pen)，分别包含所记载的上述药剂学组合物的事先确定的量。

在多种实例中，单位剂量形态为注射器及包含事先确定的量的药剂学组合物的事先加载的注射器。在特定事先加载的注射器的实例中，注射器适合皮下给药。在特定实例中，注射器适合自我给药(self-administration)。在特定实例中，事先加载的注射器为一次性注射器。

在多种实例中，事先加载的注射器包含约0.1ml至约0.5ml的药剂学组合物。在特定实例中，注射器包含约0.5ml的药剂学组合物。在具体实例中，注射器包含约1.0ml的药剂学组合物。在特定实例中，注射器包含约2.0ml的药剂学组合物。

在特定实例中，单位剂量形态为自动注射笔。自动注射笔包括包含在本说明书中记载的药剂学组合物的自动注射笔。在一部分实例中，自动注射笔传递事先确定的体积的药剂学组合物。在另一实例中，自动注射笔以传递使用人员所设定的体积的药剂学组合物的方式构成。

在多种实例中，自动注射笔包含约0.1ml至约5.0ml的药剂学组合物。在具体实例中，自动注射笔包含约0.5ml的药剂学组合物。在特定实例中，自动注射笔包含约1.0ml的药剂学组合物。在另一实例中，自动注射笔包含约5.0ml的药剂学组合物。

4.2.冷冻干燥的脱氧核糖核酸剂型

在一部分实例中，本发明的核酸构建体以从冷冻干燥的剂型重构的液体组合物给药。在具体实例中，其全部内容通过引用结合在本申请中的美国专利第8389492号所公开的冷冻干燥的脱氧核糖核酸剂型在重构后使用。

在一部分实例中，本发明的核酸构建体在冷冻干燥之前与包含碳水化合物及盐的特定赋形剂(excipient)一同制剂化。用作诊断剂或治疗剂的脱氧核糖核酸的冷冻干燥的剂型的稳定性为包含稳定化量的碳水化合物的水溶液，可在冷冻干燥之前使脱氧核糖核酸制剂化来增加。

本发明的脱氧核糖核酸剂型的碳水化合物为如蔗糖(sucrose)、葡萄糖(glucose)、乳糖(lactose)、海藻糖(trehalose)、阿拉伯糖(arabinose)、戊糖(pentose)、核糖(ribose)、木糖(xylose)、半乳糖(galactose)、己糖(hexose)、艾杜糖(idose)、甘露糖(mannose)、塔罗糖(talose)、庚糖(heptose)、果糖(fructose)、葡萄糖酸(gluconicacid)、山梨醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、甲基a-吡喃葡萄糖苷(methyl a-glucopyranoside)、麦芽糖(maltose)、异抗坏血酸(isoascorbic acid)、抗坏血酸(ascorbic acid)、内酯(lactone)、山梨糖(sorbose)、葡萄糖二酸(glucaric acid)、赤藓糖(erythrose)、苏阿糖(threose)、阿洛糖(allose)、阿卓糖(altrose)、古洛糖(gulose)、赤藓酮糖(erythrulose)、核酮糖(ribulose)、木酮糖(xylulose)、阿洛酮糖(psicose)、塔格糖(tagatose)、葡糖醛酸(glucuronic acid)、半乳糖醛酸(galacturonic acid)、甘露糖醛酸(mannuronic acid)、葡萄糖胺(glucosamine)、半乳糖胺(galactosamine)、神经氨酸(neuraminic acid)、阿拉伯聚糖(arabinan)、聚果糖(fructan)、脱氧半乳聚糖(fucan)、半乳聚糖(galactan)、聚半乳糖醛酸(galacturonan)、葡聚糖(glucan)、甘露聚糖(mannan)、木聚糖(xylan)、果聚糖(levan)、褐藻糖胶(fucoidan)、角叉菜胶(carrageenan)、半乳糖醛酸(galactocarolose)、果胶(pectin)、果胶酸(pectic acid)、直链淀粉(amylose)、普鲁兰多糖(pullulan)、糖原(glycogen)、支链淀粉(amylopectin)、纤维素(cellulose)、右旋糖酐(dextran)、环糊精(cyclodextrin)、石耳素(pustulan)、甲壳素(chitin)、琼脂糖(agarose)、角蛋白(keratin)、软骨素(chondroitin)、皮肤素(dermatan)、透明质酸(hyaluronic acid)、海藻酸(alginic acid)、黄原胶(xantham gum)或淀粉(starch)的单糖类、寡糖类或多糖类。

在一系列的实例中，碳水化合物为甘露醇或蔗糖。

冷冻干燥之前的碳水化合物溶液可仅与水中的碳水化合物相应或包含缓冲液。这种缓冲液的例包括磷酸缓冲盐溶液、HEPES、TRIS或TRIS/EDTA。通常，碳水化合物溶液以约0.05％至约30％蔗糖，通常以0.1％至约15％蔗糖，如0.2％至约5％、10％或15％蔗糖，优选地，约0.5％至10％蔗糖之间，1％至5％蔗糖、1％至3％蔗糖，以及最优选地，约1.1％蔗糖的最终浓度与脱氧核糖核酸结合。

本发明的脱氧核糖核酸剂型的盐为NaC1或KCl。根据特定实施方式，上述盐为NaCl。根据追加实施方式，脱氧核糖核酸剂型的盐以选自由约0.001％至约10％之间、约0.1％至5％之间、约0.1％至4％之间、约0.5％至约2％之间、约0.8％至1.5％之间、约0.8％至1.2％w/v之间组成的组中的量存在。在特定实例中，脱氧核糖核酸剂型的盐以约0.9％w/v的量存在。

从冷冻干燥的剂型重构的液体组合物的最终浓度可具有为约1ng/mL至约30mg/mL的质粒。例如，本发明的剂型可具有约1ng/mL、约5ng/mL、约10ng/mL、约50ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL、约1μg/mL、约5μg/mL、约10μg/mL、约50μg/mL、约100μg/mL、约200μg/mL、约400μg/mL、约500μg/mL、约600μg/mL、约800μg/mL、约1mg/mL、约2mg/mL、约2.5mg/mL、约3mg/mL、约3.5mg/mL、约4mg/mL、约4.5mg/mL、约5mg/mL、约5.5mg/mL、约6mg/mL、约7mg/mL、约8mg/mL、约9mg/mL、约10mg/mL、约20mg/mL或约30mg/mL的质粒的最终浓度。在本发明的特定实例中，脱氧核糖核酸的的最终浓度为约100μg/mL至约2.5mg/mL。在本发明的特定实例中，脱氧核糖核酸的最终浓度为约0.5mg/mL至1mg/mL。

本发明的脱氧核糖核酸剂型在本领域公知的标准条件下进行冷冻干燥。本发明的脱氧核糖核酸剂型的冷冻干燥方法可包括：步骤(a)，将装入脱氧核糖核酸剂型，例如，包含质粒脱氧核糖核酸、盐及碳水化合物的脱氧核糖核酸剂型的容器(container)，例如，小瓶加载至冷冻干燥器，上述质粒脱氧核糖核酸包含肝细胞生长因子基因或其变体，上述冷冻干燥器具有约5℃至约-50℃的起始温度；步骤(b)，将脱氧核糖核酸剂型冷却至零下的温度(例：-10℃至-50℃)；以及步骤(c)，实质上干燥脱氧核糖核酸剂型。普通技术人员可考虑影响冷冻干燥媒介变数，例如，使用的冷冻干燥机械的类型、使用的脱氧核糖核酸量以及使用的容器的大小的因素来调整本发明的脱氧核糖核酸剂型的冷冻干燥条件，例如，温度及持续时间。

装入冷冻干燥的脱氧核糖核酸剂型的容器之后可在多种温度(例如，室温至约-180℃，优选为约2-8℃至约-80℃，更优选为约-20℃至约-80℃，以及最优选为约-20℃)条件下长时间密封并保存。根据特定实施方式，冷冻干燥的脱氧核糖核酸剂型没有失去显著活性，优选地，在至少6个月的时间内可从约2-8℃至约-80℃为止的温度范围内稳定。质粒脱氧核糖核酸剂型的稳定储存还可与研究或如基于质粒的治疗的使用前长期稳定的形态储存质粒氧核糖核酸相应。储存时间可以为数个月、1年、5年、10年、15年或最大20年。优选地，制剂至少在约3年的时间内稳定。

在本发明的方法中重构的冷冻干燥的脱氧核糖核酸的浓度根据包括将要传递的剂型的量、对象体的年龄及体重、传递方法及途径以及传递的抗原的免疫原性的诸多因素调整。

附图说明

图1示出作为核酸构建体的以VM202周知的pCK-肝细胞生长因子-X7的结构。pCK载体包含(1)源于人巨细胞病毒立即早期基因的启动子/增强子及5'UTR(外显子1、内含子A及一部分的外显子2)(“人巨细胞病毒立即早期启动子”)、(2)ColE1复制原点(“ColE1”)以及(3)卡那霉素抗性基因(“Kanr”)。肝细胞生长因子-X7插入物(“肝细胞生长因子-X7”)为包含人肝细胞生长因子的外显子1至18及人肝细胞生长因子基因的内含子4的片段的互补脱氧核糖核酸。具有肝细胞生长因子-X7插入物的3'末端的框内融合的序列要素对多聚腺苷酸尾(poly-A tail，“pA”)进行编码。pCK-肝细胞生长因子-X7通过选择性剪接(alternative splicing)表达肝细胞生长因子723及肝细胞生长因子728两者。

图2a示出用于实现对于紫杉醇诱发的神经性疼痛的pCK-肝细胞生长因子-X7的效果的实验步骤的概要。具体地，通过腹腔(intraperitoneal，i.p.)注射向9周龄的Balb/c雌性小鼠给药1mg/kg的紫杉醇，在1周的时间内每日给药。第一轴向肌肉注射200μg的质粒脱氧核糖核酸、pCK或pCK-肝细胞生长因子-X7。每周使用冯·弗雷的灯丝(Von Frey'sfilament)检查机械性痛觉超敏(mechanical allodynia)来确定疼痛症状的严重程度。图2b提供从在图2a中简要示出的实验获取的数据。具体地，图2b提供从给药紫杉醇的小鼠中测定的缩足(paw withdrawal)反应(频率(％))数据。缩足频率(paw withdrawalfrequency)在给药pCK-肝细胞生长因子-X7的组中显著减少，但是，在给药没有肝细胞生长因子-X7插入物的pCK载体的对照组中未减轻。

图3a示出用于实验对于长春新碱-诱发神经性疼痛的pCK-肝细胞生长因子-X7的效果的实验步骤的概要，具体地，向5周龄的Balb/c雄性小鼠给药200μg/kg的长春新碱，在2周的时间内通过腹腔注射给药，在第一轴给药200μg的pCK-肝细胞生长因子-X7。通过冯·弗雷的灯丝测试确定它们的疼痛水平。图3b提供从在图3a中简要示出的实验获取的数据。具体地，图3b提供在给药长春新碱的小鼠中测定的缩足反应(频率(％))数据。缩足频率在给药pCK-肝细胞生长因子-X7的组中显著减少，在给药没有肝细胞生长因子-X7插入物的pCK载体的对照组中未减轻。

图4a示出用于实验对于硼替佐米诱发的神经性疼痛的pCK-肝细胞生长因子-X7的效果的实验步骤的概要。具体地，通过腹腔注射向7周龄的C57BL6雄性小鼠给药0.4mg/kg的硼替佐米，在2周的时间内1周给药3次，在第二轴给药200μg的pCK-肝细胞生长因子-X7。通过冯·弗雷的灯丝测试确定它们的疼痛水平。图4b提供从在图4a中简要示出的实验获取的数据。具体地，图4b提供从给药硼替佐米的小鼠中测定的缩足反应(频率(％))数据。缩足频率在给药pCK-肝细胞生长因子-X7的组中显著减少，在给药没有肝细胞生长因子-X7插入物的pCK载体的对照组中未减轻。

图5a为示出用于实验对于顺氯氨铂-诱发神经性疼痛的pCK-肝细胞生长因子-X7的效果的实验步骤的概要。具体地，通过腹腔注射向9周龄的C57BL6雄性小鼠给药2.3mg/kg的顺氯氨铂，在2周的时间内每2日给药1次，在第一轴给药200μg的pCK-肝细胞生长因子-X7。通过冯·弗雷的灯丝测试确定它们的疼痛水平。图5b提供从在图5a简要示出的实验获取的数据。具体地，图5b提供从给药顺氯氨铂的小鼠中测定的缩足反应(频率(％))数据。缩足频率在给药pCK-肝细胞生长因子-X7的组中显著减少，在给药没有肝细胞生长因子-X7插入物的pCK载体的对照组中未减轻。

上述附图仅以例示的目的通过图示出本发明的多种实施例。普通技术人员可理解的是，可从以下说明容易识别可在不超出在本说明书中说明的本发明的原理使用在本说明书中例示的结构及方法的应对实施例。

具体实施方式

实施例

以下实施例向普通技术人员提供制备并使用本发明的方法的完整公开及说明而提供，并不限制本发明人视作他们的发明的范围，以下实验并不表示所有或唯一所执行的实验。关于所使用的数字(例：量、温度等，为保障准确性而努力，但是，需考虑哟部分实验误差及偏差。除非另行表示，部分(parts)为重量份(partsby weight)，分子量(molecularweight)为重均分子量(weight average molecular weight)，温度为摄氏温度(degreesCelsius)，压力为大气压或周围大气压(near atmospheric)。标准简称可用作，例如，bp，碱基对(base pair)；kb，千碱基(kilobase)；pl，微微升(picoliter)；s或sec，秒钟(second)；min，分钟(minute)；h或hr，时间(hour)；aa，氨基酸(amino acid)；nt，核苷酸(nucleotide)等。

除非另行指示，本发明的实施使用本领域技术内的蛋白质化学、生物化学、重组脱氧核糖核酸技术及药理学的常规方法。

实施例1：制备对肝细胞生长因子的同种型进行编码的核酸构建体

使用在美国专利第7812146号记载的对肝细胞生长因子的同种型进行编码的多种构建体。

例如，pCK载体使用可表达肝细胞生长因子的同种型的载体。两者均如其全部内容通过引用结合在本申请中的Lee et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.272:230(2000)；WO 2000/040737中的详细记载，两者均以可在人巨细胞病毒(human cytomegalovirus)的增强子/启动子下调节基因，例如，肝细胞生长因子基因的表达的方式构成pCK载体。尤其，在pCK载体克隆对血管内皮生长因子(VEGF)进行编码的互补脱氧核糖核酸，由此制备pCK-血管内皮生长因子，转化为pCK-血管内皮生长因子的大肠杆菌于1999年12月27日保藏在韩国微生物保藏中心(保藏编号：KCCM-10179)。pCK载体包含序列5的多核苷酸。pCK载体用于人体临床试验，并确认其安全性和功效(Henry et al.,Gene Ther.18:788(2011))。

对肝细胞生长因子的同种型进行编码的多种序列用于生成肝细胞生长因子构建体。尤其，生成与人肝细胞生长因子的外显子1至外显子18及人肝细胞生长因子基因的内含子4相应的互补脱氧核糖核酸或包含其片段的构建体。在上述构建体中，内含子4向互补脱氧核糖核酸的外显子4与外显子5之间。

在一部分情况下，构建体包含内含子4的全序列。在一部分情况下，构建体包含内含子4的片段。例如，构建体可包含选自由序列7至序列14组成的组中的核苷酸序列。序列7的核苷酸序列为7113bp，相当于包含内含子4的全序列的构建体。序列8至14的核苷酸序列相当于包含内含子4的片段的构建体。

因此，可在本申请中提供的方法中使用的构建体具有如下的结构：(i)(外显子1至外显子4)-(序列7的核苷酸483-5438)-(外显子5至外显子18)；(ii)(外显子1至外显子4)-(序列7的核苷酸483-2244及核苷酸3168-5438)-(外显子5至外显子18)；(iii)(外显子1至外显子4)-(序列7的核苷酸483-2244及核苷酸4168-5438)-(外显子5至外显子18)；(iv)(外显子1至外显子4)-(序列7的核苷酸483-2244及核苷酸5117-5438of 8)-(外显子5至外显子18)；(v)(外显子1至外显子4)-(序列7的核苷酸483-728核苷酸2240-5438)-(外显子5至外显子18)；(vi)(外显子1至外显子4)-(序列7的核苷酸483-728及核苷酸3168-5438)-(外显子5至外显子18)；(vii)(外显子1至外显子4)-(序列7的核苷酸483-728及核苷酸4168-5438)-(外显子5至外显子18)；或(viii)(外显子1至外显子4)-(序列7的核苷酸483-728及核苷酸5117-5438)-(外显子5至外显子18)。

在本说明书中，将包含人肝细胞生长因子的内含子4或其片段的混合肝细胞生长因子基因命名为“肝细胞生长因子-X”。肝细胞生长因子-X分别包含具有序列7至序列14的核苷酸序列的肝细胞生长因子-X1、肝细胞生长因子-X2、肝细胞生长因子-X3、肝细胞生长因子-X4、肝细胞生长因子-X5、肝细胞生长因子-X6、肝细胞生长因子-X7以及肝细胞生长因子-X8(参照上述表1)。

先前已证明，肝细胞生长因子的两个同种型(即，全长肝细胞生长因子及缺失变体肝细胞生长因子)可从各自的构建体通过外显子4与外显子5之间的选择性剪接生成。并且，在多种肝细胞生长因子构建体中，肝细胞生长因子-X7示出肝细胞生长因子的两个同种型(即，全长肝细胞生长因子及缺失变体肝细胞生长因子)的最高水平的表达。

在pCK载体克隆的肝细胞生长因子-X7用于测试在本申请中提供的治疗方法的功效。如在美国专利第7812146号所公开，转化为pCK-肝细胞生长因子-X7的大肠杆菌(Escherichia coli)Top10F'于2002年3月12日以保藏编号KCCM-10361保藏。

实施例2：对于通过紫杉醇(紫杉烷)诱发的周围神经病变的小鼠模型的p CK-肝细胞生长因子-X7的治疗效果

紫杉醇(paclitaxel，PTX)为尤其以Taxol的品牌名销售的化疗药物。紫杉醇用于治疗包括卵巢癌(ovarian cancer)、乳房癌(breast cancer)、肺癌(lung cancer)、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、宫颈癌(cervical cancer)及胰腺癌(pancreatic cancer)在内的各种类型的癌症。紫杉醇属于紫杉系列的药物，在细胞分裂过程中，妨碍微小管(microtubule)的正常功能来起作用。药物的常见副作用包括周围神经病变(peripheralneuropathy)和神经性疼痛。

使用小鼠模型来研究对于通过紫杉醇诱发的神经性疼痛的pCK-肝细胞生长因子-X7的治疗效果。如图2a所示，通过腹腔注射向9周龄的雌性Balb/c小鼠给药紫杉醇，在1周的时间内每日给药。在开始化疗注射后的1周后，通过冯·弗雷的灯丝测试(Von Frey’sfilament test)评价了痛觉超敏(allodynia)水平，将示出35％以上的缩足频率(pawwithdrawal frequency)反应的小鼠选择为研究实验对象。将在第0周未接受化学治疗剂的进行假处理的动物(sham-treated animal)用作对照组。

通过肌肉注射向实验动物给药(i)200μg的pCK-肝细胞生长因子-X7或(ii)作为对照组的没有肝细胞生长因子-X7载荷(payload)的200μg的pCK载体中的一个。在之后的5周内的每周测试机械性痛觉超敏。并且，在图2a对在本说明书中提供的实验协议进行摘要。

如图2b所示，进行假处理的动物(Sham)在实验过程中一直示出低水平的疼痛。相反，进行紫杉醇处理的动物示出在第一周增加的缩足频率(paw withdrawal frequency)，在研究时间内，缩足频率维持的高(未显示数据)。在第一周，将进行紫杉醇处理的动物分为两组，对一组注射pCK-肝细胞生长因子-X7，向作为对照组的另一组注射pCK载体。

在注射pCK-肝细胞生长因子-X7的情况下，紫杉醇处理的动物的缩足频率显著减少，在注射pCK的情况下，缩足频率无变化。此结果教示，相比于对照组动物(假处理或pCK处理)，进行pCK-肝细胞生长因子-X7处理的动物的疼痛减轻。这种数据教示，pCK-肝细胞生长因子-X7的肌肉注射在紫杉醇诱发的神经性疼痛中具有显著的疼痛缓解效果。

实施例3：对于通过长春新碱(植物碱)诱发的周围神经病变的小鼠模型的pCK-肝细胞生长因子-X7的治疗效果

以醛基长春碱(leurocristine)而周知的长春新碱为尤其以Oncovin的品牌名销售的化疗药物。长春新碱分类为植物碱。长春新碱用于治疗包括急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia)、急性髓性白血病(acute myeloid leukemia)、霍奇金病(Hodgkin’s disease)、神经母细胞瘤(neuroblastoma)及小细胞肺癌(small cell lungcancer)在内的各种类型的癌症。长春新碱部分性地与微管蛋白结合，由此防止在中期(metaphase)细胞分离染色体。之后，细胞经历细胞凋亡(apoptosis)。长春新碱以抑制白血球生成和成熟而周知。药物的常见副作用包括神经性疼痛。

通过小鼠模型研究对于通过长春新碱诱发的神经性疼痛的pCK-肝细胞生长因子-X7的治疗效果。如图3a所示，通过腹腔注射向5周龄的雄性Balb/c小鼠注射长春新碱，在2周的时间内每日给药。在开始化疗注射后的1周后，通过冯·弗雷的灯丝测试评价了痛觉超敏水平，将示出35％以上的缩足频率反应的小鼠选择为研究实验对象。在第0周未接受化学治疗剂的进行假处理的动物用作对照组。

通过肌肉注射向实验动物给药(i)200μg的pCK-肝细胞生长因子-X7或(ii)作为对照组的没有肝细胞生长因子-X7载荷的200μg的pCK载体中的一个。在之后的4周之内每周测试机械性痛觉超敏。在图3a对在本说明书中提供的实验协议进行摘要。

如图3b所示，进行假处理的动物在实验过程中一直示出低水平的疼痛。相反，进行长春新碱处理的动物的锁足频率在第一周增加，在研究时间内，缩足频率维持的高(未显示数据)。在第一周，将进行长春新碱的动物分为两组，对一组注射pCK-肝细胞生长因子-X7，向作为对照组的另一组注射pCK载体。

在注射pCK-肝细胞生长因子-X7的情况下，进行长春新碱处理的动物的缩足频率显著减少，在注射pCK的情况下，缩足频率无变化。此结果教示，相对比喻对照组动物(仅进行pCK载体处理)，进行pCK-肝细胞生长因子-X7处理的动物的疼痛减轻。这种数据教示，pCK-肝细胞生长因子-X7的肌肉给药在长春新碱-诱发神经性疼痛中具有显著的疼痛缓解效果。

实施例4：对于通过硼替佐米(蛋白酶体抑制剂)诱发的周围神经病变的小鼠模型的pCK-肝细胞生长因子-X7的治疗效果

硼替佐米为为了治疗癌症而最初用于人类的治疗用蛋白酶体抑制剂。硼替佐米在30％的患者中与伴随患者的疼痛的周围神经病变相关。

通过使用小鼠模型研究对于通过硼替佐米诱发的神经性疼痛的pCK-肝细胞生长因子-X7的治疗效果。如图4a所示，通过腹腔注射向7周龄的雄性C57BL/6小鼠注射硼替佐米，在2周的时间内一周注射3次。在开始化疗注射后的1周后，通过冯·弗雷的灯丝测试评价了痛觉超敏水平，将示出35％以上的缩足频率反应的小鼠选择为研究实验对象。将在第0周未接受化学治疗剂的进行假处理的动物用作对照组。

通过肌肉注射向实验动物给药(i)200μg的pCK-肝细胞生长因子-X7或(ii)作为对照组的没有肝细胞生长因子-X7载荷的200μg的pCK载体中的一个。从开始化疗注射后的1周之后开始，每周测试机械性痛觉超敏。在图4a对在本说明书中提供的实验协议进行摘要。

如图4b所示，进行假处理的动物在实验过程中一直示出低水平的疼痛。相反，进行硼替佐米处理的动物在第一周示出增加的缩足频率，在研究时间内，缩足频率维持的高(未显示数据)。在第2周，将进行硼替佐米处理的动物分为两组，对一组注射pCK-肝细胞生长因子-X7，向作为对照组的另一组注射pCK载体。

在注射pCK-肝细胞生长因子-X7的情况下，进行硼替佐米处理的动物的缩足频率显著减少，在注射pCK的情况下，缩足频率无变化。这种数据教示，pCK-肝细胞生长因子-X7的肌肉给药在硼替佐米-诱发神经性疼痛中提供显著的疼痛缓解效果。

实施例5：对于通过顺氯氨铂(铂类似物)诱发的周围神经病变的小鼠模型的pCK-肝细胞生长因子-X7的治疗效果

顺氯氨铂为用于治疗包括睾丸癌(testicular cancer)、卵巢癌(ovariancancer)、宫颈癌(cervical cancer)、乳房癌(breast cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、头颈癌(head and neck cancer)、食道癌(esophageal cancer)、肺癌(lung cancer)、间皮瘤(mesothelioma)、脑肿瘤(brain tumor)及神经母细胞瘤(neuroblastoma)在内的多种癌症的化疗药物。周围神经病变为顺氯氨铂的严重副作用，相比于化疗药物，并不常见。

使用小鼠模型来研究对于通过顺氯氨铂诱发的神经性疼痛的pCK-肝细胞生长因子-X7的治疗哦效果。如图5a所示，通过腹腔注射向9周龄的雄性C57BL/6小鼠注射顺氯氨铂，在2周的时间内每2日注射1次。在开始化疗注射后的1周后，通过冯·弗雷的灯丝测试评价痛觉超敏水平，将示出35％以上的缩足频率反应的小鼠选择为研究实验对象。将在第0周未接受化学治疗剂的进行假处理的动物用作对照组。

通过肌肉注射向实验动物给药(i)200μg的pCK-肝细胞生长因子-X7或(ii)作为对照组没有肝细胞生长因子-X7载荷的200μg的pCK载体中的一个。在之后的3周内每周测验机械性痛觉超敏。在图5a对在本说明书中提供的实验协议进行摘要。

如图5b所示，进行假处理的动物在实验过程中一直示出低水平的疼痛。相反，进行顺氯氨铂处理的动物示出在第一周增加的缩足频率，在研究时间内，缩足频率维持的高(未显示数据)。在第一周，将进行顺氯氨铂处理的动物分为两组，对一组注射pCK-肝细胞生长因子-X7，向作为对照组的另一组注射pCK载体。

在注射pCK-肝细胞生长因子-X7的情况下，进行顺氯氨铂处理的动物的缩足频率显著减少，在注射pCK的情况下，缩足频率无变化。这种数据教示，pCK-肝细胞生长因子-X7的肌肉注射在顺氯氨铂-诱发神经性疼痛中具有显著的疼痛缓解效果。

表2

序列

文献的引用合并(INCORPORATION BY REFERENCE)

在本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请书及其他文件中，各自的个别出版物、专利、专利申请书及其他文件在所有目的作为参照结合在本申请中，与个别显示文件的相同程度，在所有目的其全部内容通过引用结合在本申请中。

等同技术方案(EQUIVALENTS)

例示并说明多种具体实施例，上述说明书并不时限制性。可理解的是，可在不超出(多个)本发明的思想(spirit)及范围的范围内进行多种变更。若检讨本说明书，则普通技术人员可明确理解多种变形。

序列表

<110> VIROMED CO., LTD.

<120> 治疗与化疗诱发的周围神经病变相关的神经性疼痛

<130> 33730-37238/WO

<150> US 62/673,048

<151> 2018-05-17

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 728

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu

1 5 10 15

Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln

20 25 30

Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr

35 40 45

Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val

50 55 60

Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu

65 70 75 80

Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys

85 90 95

Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe

100 105 110

Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys

115 120 125

Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys

130 135 140

Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His

145 150 155 160

Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr

165 170 175

Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser

180 185 190

Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu

195 200 205

Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp

210 215 220

His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro

225 230 235 240

His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp

245 250 255

Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr

260 265 270

Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys

275 280 285

Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu

290 295 300

Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile

305 310 315 320

Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu

325 330 335

His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn

340 345 350

Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr

355 360 365

Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp

370 375 380

Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met

385 390 395 400

Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp

405 410 415

Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala

420 425 430

Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His

435 440 445

Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys

450 455 460

Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu

465 470 475 480

Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val

485 490 495

Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg

500 505 510

Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp

515 520 525

Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr

530 535 540

Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys

545 550 555 560

Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly

565 570 575

Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp

580 585 590

Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu

595 600 605

Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn

610 615 620

Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu

625 630 635 640

Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu

645 650 655

Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp

660 665 670

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675 680 685

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690 695 700

Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile

705 710 715 720

Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser

725

<210> 2

<211> 723

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu

1 5 10 15

Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln

20 25 30

Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr

35 40 45

Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val

50 55 60

Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu

65 70 75 80

Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys

85 90 95

Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe

100 105 110

Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys

115 120 125

Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys

130 135 140

Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His

145 150 155 160

Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg

165 170 175

Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu Val Arg

180 185 190

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195 200 205

Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp His Thr Glu Ser Gly

210 215 220

Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro His Arg His Lys Phe

225 230 235 240

Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys Arg

245 250 255

Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro His

260 265 270

Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys Ala Asp Asn Thr Met

275 280 285

Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gln Gly Gln

290 295 300

Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile Trp Asn Gly Ile Pro

305 310 315 320

Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu His Asp Met Thr Pro

325 330 335

Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro

340 345 350

Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Ile Arg

355 360 365

Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp Met Ser His Gly Gln

370 375 380

Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser Gln

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Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val Asn Gly Ile Pro Thr

485 490 495

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545 550 555 560

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565 570 575

Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp Phe Val Ser Thr Ile

580 585 590

Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu Lys Thr Ser Cys Ser

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Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln His

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His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu Ile Cys Ala Gly Ala

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Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu

660 665 670

Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu Gly Val Ile Val Pro

675 680 685

Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly Ile Phe Val Arg Val

690 695 700

Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile Leu Thr Tyr Lys Val

705 710 715 720

Pro Gln Ser

<210> 3

<211> 482

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 3

atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60

ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120

gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180

accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240

ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300

ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360

aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420

tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480

ag 482

<210> 4

<211> 1675

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 4

cctacaggaa aactactgtc gaaatcctcg aggggaagaa gggggaccct ggtgtttcac 60

aagcaatcca gaggtacgct acgaagtctg tgacattcct cagtgttcag aagttgaatg 120

catgacctgc aatggggaga gttatcgagg tctcatggat catacagaat caggcaagat 180

ttgtcagcgc tgggatcatc agacaccaca ccggcacaaa ttcttgcctg aaagatatcc 240

cgacaagggc tttgatgata attattgccg caatcccgat ggccagccga ggccatggtg 300

ctatactctt gaccctcaca cccgctggga gtactgtgca attaaaacat gcgctgacaa 360

tactatgaat gacactgatg ttcctttgga aacaactgaa tgcatccaag gtcaaggaga 420

aggctacagg ggcactgtca ataccatttg gaatggaatt ccatgtcagc gttgggattc 480

tcagtatcct cacgagcatg acatgactcc tgaaaatttc aagtgcaagg acctacgaga 540

aaattactgc cgaaatccag atgggtctga atcaccctgg tgttttacca ctgatccaaa 600

catccgagtt ggctactgct cccaaattcc aaactgtgat atgtcacatg gacaagattg 660

ttatcgtggg aatggcaaaa attatatggg caacttatcc caaacaagat ctggactaac 720

atgttcaatg tgggacaaga acatggaaga cttacatcgt catatcttct gggaaccaga 780

tgcaagtaag ctgaatgaga attactgccg aaatccagat gatgatgctc atggaccctg 840

gtgctacacg ggaaatccac tcattccttg ggattattgc cctatttctc gttgtgaagg 900

tgataccaca cctacaatag tcaatttaga ccatcccgta atatcttgtg ccaaaacgaa 960

acaattgcga gttgtaaatg ggattccaac acgaacaaac ataggatgga tggttagttt 1020

gagatacaga aataaacata tctgcggagg atcattgata aaggagagtt gggttcttac 1080

tgcacgacag tgtttccctt ctcgagactt gaaagattat gaagcttggc ttggaattca 1140

tgatgtccac ggaagaggag atgagaaatg caaacaggtt ctcaatgttt cccagctggt 1200

atatggccct gaaggatcag atctggtttt aatgaagctt gccaggcctg ctgtcctgga 1260

tgattttgtt agtacgattg atttacctaa ttatggatgc acaattcctg aaaagaccag 1320

ttgcagtgtt tatggctggg gctacactgg attgatcaac tatgatggcc tattacgagt 1380

ggcacatctc tatataatgg gaaatgagaa atgcagccag catcatcgag ggaaggtgac 1440

tctgaatgag tctgaaatat gtgctggggc tgaaaagatt ggatcaggac catgtgaggg 1500

ggattatggt ggcccacttg tttgtgagca acataaaatg agaatggttc ttggtgtcat 1560

tgttcctggt cgtggatgtg ccattccaaa tcgtcctggt atttttgtcc gagtagcata 1620

ttatgcaaaa tggatacaca aaattatttt aacatataag gtaccacagt catag 1675

<210> 5

<211> 3756

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的多核苷酸

<400> 5

cgcgttgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60

atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120

cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180

tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240

tacatcaagt gtatcatatg ccaagtccgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300

ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tacgggactt tcctacttgg cagtacatct 360

acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacacc aatgggcgtg 420

gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt 480

tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taataacccc gccccgttga 540

cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga 600

accgtcagat cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga agacaccggg 660

accgatccag cctccgcggc cgggaacggt gcattggaac gcggattccc cgtgccaaga 720

gtgacgtaag taccgcctat agactctata ggcacacccc tttggctctt atgcatgcta 780

tactgttttt ggcttggggc ctatacaccc ccgcttcctt atgctatagg tgatggtata 840

gcttagccta taggtgtggg ttattgacca ttattgacca ctcccctatt ggtgacgata 900

ctttccatta ctaatccata acatggctct ttgccacaac tatctctatt ggctatatgc 960

caatactctg tccttcagag actgacacgg actctgtatt tttacaggat ggggtcccat 1020

ttattattta caaattcaca tatacaacaa cgccgtcccc cgtgcccgca gtttttatta 1080

aacatagcgt gggatctcca cgcgaatctc gggtacgtgt tccggacatg ggctcttctc 1140

cggtagcggc ggagcttcca catccgagcc ctggtcccat gcctccagcg gctcatggtc 1200

gctcggcagc tccttgctcc taacagtgga ggccagactt aggcacagca caatgcccac 1260

caccaccagt gtgccgcaca aggccgtggc ggtagggtat gtgtctgaaa atgagctcgg 1320

agattgggct cgcaccgctg acgcagatgg aagacttaag gcagcggcag aagaagatgc 1380

aggcagctga gttgttgtat tctgataaga gtcagaggta actcccgttg cggtgctgtt 1440

aacggtggag ggcagtgtag tctgagcagt actcgttgct gccgcgcgcg ccaccagaca 1500

taatagctga cagactaaca gactgttcct ttccatgggt cttttctgca gtcaccgtcc 1560

ttgacacgaa gcttggtacc gagctcggat ccactagtcc agtgtggtgg aattctgcag 1620

atatccagca cagtggcggc cgctcgagtc tagagggccc gtttaaaccc gctgatcagc 1680

ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt 1740

gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca 1800

ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga 1860

ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggagtcgaaa ttcagaagaa ctcgtcaaga 1920

aggcgataga aggcgatgcg ctgcgaatcg ggagcggcga taccgtaaag cacgaggaag 1980

cggtcagccc attcgccgcc aagctcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc 2040

tgatagcggt ccgccacacc cagccggcca cagtcgatga atccagaaaa gcggccattt 2100

tccaccatga tattcggcaa gcaggcatcg ccatgggtca cgacgagatc ctcgccgtcg 2160

ggcatgctcg ccttgagcct ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcttcg 2220

tccagatcat cctgatcgac aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga 2280

tgtttcgctt ggtggtcgaa tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt 2340

gcatcagcca tgatggatac tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc 2400

cccggcactt cgcccaatag cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagcaca 2460

gctgcgcaag gaacgcccgt cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gtcttgcagt 2520

tcattcaggg caccggacag gtcggtcttg acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac 2580

agccggaaca cggcggcatc agagcagccg attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat 2640

agcctctcca cccaagcggc cggagaacct gcgtgcaatc catcttgttc aatcatgcga 2700

aacgatcctc atcctgtctc ttgatcagat cttgatcccc tgcgccatca gatccttggc 2760

ggcaagaaag ccatccagtt tactttgcag ggcttcccaa ccttaccaga gggcgcccca 2820

gctggcaatt ccggttcgct tgctgtccat aaaaccgccc agtctagcta tcgccatgta 2880

agcccactgc aagctacctg ctttctcttt gcgcttgcgt tttcccttgt ccagatagcc 2940

cagtagctga cattcatccg gggtcagcac cgtttctgcg gactggcttt ctacgtgaaa 3000

aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt 3060

tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt 3120

tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt 3180

ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag 3240

ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta 3300

gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat 3360

aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg 3420

ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg 3480

agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac 3540

aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga 3600

aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt 3660

ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta 3720

cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatg 3756

<210> 6

<211> 4956

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 6

gtaagaacag tatgaagaaa agagatgaag cctctgtctt ttttacatgt taacagtctc 60

atattagtcc ttcagaataa ttctacaatc ctaaaataac ttagccaact tgctgaattg 120

tattacggca aggtttatat gaattcatga ctgatattta gcaaatgatt aattaatatg 180

ttaataaaat gtagccaaaa caatatctta ccttaatgcc tcaatttgta gatctcggta 240

tttgtgaaat aataacgtaa acttcgttta aaaggattct tcttcctgtc tttgagaaag 300

tacggcactg tgcaggggga gaggttgatt gtgaaaaatc agaggtagat gagaatctta 360

ctgagggctg agggttcttt aaccttggtg gatctcaaca ttggttgcac attaaaatca 420

cctgctgcaa gcccttgacg aatcttactt agaagatgac aacacagaac aattaaatca 480

gaatctctgg ggagaatagg gcaccagtat tttttgagct cccaccatga ttccaaagtg 540

cagccaaatt tgagaaccac tgctaaaagc tcaagcttca gattgaccag cttttccatc 600

tcacctatcg cctaaagacc aaattggata aatgtgttca ttacgacaga tgggtactat 660

ttaaagatga gtaaacacaa tatacttagg ctcgtcagac tgagagtttt aatcatcact 720

gaggaaaaac atagatatct aatactgact ggagtattag tcaaggctta tttcacacac 780

aattttatca gaaaccaaag tagtttaaaa cagctctccc cttattagta atgcattgga 840

gggtttactt taccatgtac cttgctgagc actgtacctt gttaatctca tttacttgta 900

atgagaacca cacagcgggt agttttattg gttctatttt acctacatga caaaactgaa 960

gcataaaaac acttagtaag ttttcagtgt catgcacaac taggaagtga catggccaga 1020

atataagccc agtcaccatc actctataac ctgcgctttt aacaacttca gggcatgaca 1080

catttggccg gtcagtagaa cccatgctgt gatttgtttt tgcagtggtg gtgatgactg 1140

ccttgttgaa tccacttttt attctattcc attttgggga cacaattctg caagatgatt 1200

cttcattagg aaacagagat gagttattga ccaacacaga aagaaaaaga gtttgttgct 1260

ccacactggg attaaaccta tgatcttggc ctaattaaca ctagctagta agtgtccaag 1320

ctgatcatct ctacaacatt tcaataacag aaaacaacaa ttttcaaaat tagttactta 1380

caattatgta gaaatgcctc taaaacacag tattttcctt atattacaaa aacaaaaatt 1440

ataattggtt ttgtcctctt ttgagagttt gcatggtgtt actccctgca tagtgaagaa 1500

aacattttat ttaagtagat ggatctaagt ttttcatgaa caaaggaatg acatttgaaa 1560

tcaatcctac cctagtccag gagaatgcat tagattaacc tagtagaggt cttatttcac 1620

cctgagtttt ctatgatcgt gattctctgc tggaggagta attgtgaaat agatctctct 1680

gggaactggc ttcctagtcc aatcagctct tttaccaatg aacacttcct tgtgatatag 1740

atgtttatgg ccgagaggat ccagtatatt aataaaatcc ctttttgtat tcaatgaggg 1800

aaacacataa ttttcatcaa ttagcagctt attggaatat ctgcatgatg gtttaacact 1860

tttaagtgtt gactaaagat taattttaca gaaaatagaa aaagaaatat gtttctgtct 1920

ggaggaatga tttattgttg acccctaaat tgaaatattt tactagtggc ttaatggaaa 1980

gatgatgaaa gatgatgaaa ttaatgtaga agcttaacta gaaaatcagg tgacctgata 2040

tctacatctg tatccttcat tggccaccca gcattcatta atgaatcaga tgatggaata 2100

gatcaagttt cctaggaaca cagtgaatat taaaagaaaa caaagggagc ctagcaccta 2160

gaagacctag tttatatttc aaagtatatt tggatgtaac ccaattttaa acatttcctc 2220

acttgtctct cttaaagcct tgccaacagc aaggacagag aaccaaaaat agtgtatata 2280

tgaataaatg cttattacag aatctgctga ctggcacatg ctttgtgtgt aatgggttct 2340

cataaacact tgttgaatga acacacataa gtgaaagagc atggctaggc ttcatccctt 2400

ggtcaaatat ggggtgctaa agaaaagcag gggaaataca ttgggacact aacaaaaaaa 2460

aacagttaat ttaggtaaaa gataaaatac accacagaat gaagaaaaga gatgacccag 2520

actgctcttt aaccttcatg tcctagagag gtttttgata tgaattgcat tcagaattgt 2580

ggaaaggagc ccatcttttc tcttcatttt gattttatta actccaatgg gggaatttta 2640

ttcgtgtttt ggccatatct acttttgatt tctacattat tctctcttcc tttctacctg 2700

tatttgtcct aataaattgt tgacttatta attcactact tcctcacagc ttttttttgg 2760

ctttacaaat ccactggaaa ggtatatggg tgtatcactt tgtgtatttc ggtgtgcatg 2820

tgtagagggg acaaaaatcc tctctcaaac tataaatatt gagtatttgt gtattgaaca 2880

tttgctataa ctactaggtt tcttaaataa tcttaatata taaaatgata tagaaaaagg 2940

gaaattatag ttcgtattat tcatctaagt gaagagatta aaacccaggg agtaaataaa 3000

ttgtctaagg actaaggttg tatactattt aggtgataga tatggggcaa ccgtatgggt 3060

tttatgatta acaaataaac ttctcaccac tctaccatat caacttttcc ataaaagaga 3120

gctatagtat tctttgctta aataaatttg attagtgcat gacttcttga aaacatataa 3180

agcaaaagtc acatttgatt ctatcagaaa agtgagtaag ccatggccca aacaaaagat 3240

gcattaaaat attctggaat gatggagcta aaagtaagaa aaatgacttt ttaaaaaagt 3300

ttactgttag gaattgtgaa attatgctga attttagttg cattataatt tttgtcagtc 3360

atacggtctg acaacctgtc ttatttctat ttccccatat gaggaatgct agttaagtat 3420

ggatattaac tattactact tagatgcatt gaagttgcat aatatggata atacttcact 3480

ggttccctga aaatgtttag ttagtaataa gtctcttaca ctatttgttt tgtccaataa 3540

tttatatttt ctgaagactt aactctagaa tacactcatg tcaaaatgaa agaatttcat 3600

tgcaaaatat tgcttggtac atgacgcata cctgtatttg ttttgtgtca caacatgaaa 3660

aatgatggtt tattagaagt ttcattgggt aggaaacaca tttgaatggt atttactaag 3720

atactaaaat ccttggactt cactctaatt ttagtgccat ttagaactca aggtctcagt 3780

aaaagtagaa ataaagcctg ttaacaaaac acaaactgaa tattaaaaat gtaactggat 3840

tttcaaagaa atgtttactg gtattacctg tagatgtata ttctttatta tgatcttttg 3900

tgtaaagtct ggcagacaaa tgcaatatct aattgttgag tccaatatca caagcagtac 3960

aaaagtataa aaaagacttg gccttttcta atgtgttaaa atactttatg ctggtaataa 4020

cactaagagt agggcactag aaattttaag tgaagataat gtgttgcagt tactgcactc 4080

aatggcttac tattataaac caaaactggg atcactaagc tccagtcagt caaaatgatc 4140

aaaattattg aagagaataa gcaattctgt tctttattag gacacagtag atacagacta 4200

caaagtggag tgtgcttaat aagaggtagc atttgttaag tgtcaattac tctattatcc 4260

cttggagctt ctcaaaataa ccatataagg tgtaagatgt taaaggttat ggttacactc 4320

agtgcacagg taagctaata ggctgagaga agctaaatta cttactgggg tctcacagta 4380

agaaagtgag ctgaagtttc agcccagatt taactggatt ctgggctctt tattcatgtt 4440

acttcatgaa tctgtttctc aattgtgcag aaaaaagggg gctatttata agaaaagcaa 4500

taaacaaaca agtaatgatc tcaaataagt aatgcaagaa atagtgagat ttcaaaatca 4560

gtggcagcga tttctcagtt ctgtcctaag tggccttgct caatcacctg ctatctttta 4620

gtggagcttt gaaattatgt ttcagacaac ttcgattcag ttctagaatg tttgactcag 4680

caaattcaca ggctcatctt tctaacttga tggtgaatat ggaaattcag ctaaatggat 4740

gttaataaaa ttcaaacgtt ttaaggacag atggaaatga cagaatttta aggtaaaata 4800

tatgaaggaa tataagataa aggatttttc taccttcagc aaaaacatac ccactaatta 4860

gtaaaattaa taggcgaaaa aaagttgcat gctcttatac tgtaatgatt atcattttaa 4920

aactagcttt ttgccttcga gctatcgggg taaaga 4956

<210> 7

<211> 7113

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述: 合成的多核苷酸

<400> 7