一种硫酸葡聚糖钠诱导白色念珠菌预先定植的结肠炎模型的构建方法

技术领域

本发明属于实验用动物模型构建技术领域，涉及一种硫酸葡聚糖钠诱导白色念珠菌预先定植的结肠炎模型的构建方法。

背景技术

日本学者于1985年首次应用葡聚糖硫酸钠（Dextran Sulfate Sodium Salt，DSS）制备了鼠溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC）模型，此后该方法广泛用于筛选治疗炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease，IBD）的新方法和临床前新药物的开发，也用于研究IBD的发病机制。与健康人相比，UC患者肠道真菌数量更多，种类更丰富，其中最常见的是念珠菌属的改变。Zwolinska-Wcislo等通过培养法发现UC患者粪便中真菌增多，肠道念珠菌属定植率更高，在肠黏膜上定植的念珠菌中91%为白念珠菌。Ott等分析了47名对照和57例IBD患者结肠黏膜样本的真菌，用DGGE法发现与对照组相比IBD患者消化道念珠菌属（特别是杜氏念珠菌和近平滑念珠菌）增多，表明真菌生态失调与该疾病相关。有数据表明在肠道炎症过程中粪便菌群移植（FMT）可能通过减少念珠菌丰度和肠道真菌诱导的促炎反应而发挥作用。Rakoff等研究证明宿主先天免疫和肠道微生物之间的相互作用是决定DSS诱导的肠道发病机制的关键。该模型的建立可用于研究先天性免疫系统在结肠炎发生的作用，为研究宿主遗传、肠道先天免疫、微生物、饮食和其他环境因素之间的相互作用的机制提供支持。

DSS诱发结肠炎模型的常见用途包括研究先天免疫系统如何参与肠道炎症，以及寻找在损伤期间/之后维持或重建上皮完整性的重要环节。肠道黏膜免疫紊乱以及肠道菌群失调与溃疡性结肠炎的发病有密切关系，一旦肠道菌群发生比例失调或者定位转移，就会加重肠道疾病、促进人体过快衰老，甚至导致癌症的发生。

发明内容

本发明的目的在于提供一种硫酸葡聚糖钠诱导白色念珠菌预先定植的结肠炎模型的构建方法。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种硫酸葡聚糖钠诱导白色念珠菌预先定植的结肠炎模型的构建方法，包括下列步骤：

步骤1：将浓度为0.8-1.2×10

步骤2：给予小鼠自由饮用质量分数为3% 的硫酸葡聚糖钠水溶液7 d，期间断绝其他饮水，且每隔1 d更换新鲜的质量分数为3% 的硫酸葡聚糖钠水溶液；

步骤3：然后连续4天，每天上午9时给予白念株菌灌胃，1.0×10

优选的技术方案为：小鼠为C57BL/6小鼠或BALB/c小鼠。

优选的技术方案为：步骤1中，浓度为0.8-1.2×10

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：

葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎模型的肠道病变与人类病理形态最为近似。采用自由饮用DSS（MW:36000~50000）水溶液的方法建立动物模型，简单易行；模型成功率高，实验重复性强且成本较低。白念珠菌在人体消化道最为常见易定植，过度增殖使肠道菌群失调。本模型的建立对于研究UC的病因、发病机制以及新的治疗方法具有重要意义，加强我们对肠道真菌与宿主免疫系统具体关联的研究。

附图说明

图1左为空白组小鼠正常肛门，右为空白组小鼠结肠组织。

图2左为对照组（仅DSS诱导）小鼠红肿肛门，右为对照组小鼠结肠组织。

图3左为模型组小鼠红肿肛门，右为模型组小鼠结肠组织。

图4为各组小鼠粪便中白念株菌含量。

图5为各组小鼠不同脏器白念株菌含量。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

请参阅图1-5。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例1：一种硫酸葡聚糖钠诱导白色念珠菌预先定植的结肠炎模型的构建方法

一种硫酸葡聚糖钠诱导白色念珠菌预先定殖的结肠炎模型及其构建方法，包括以下技术步骤。

（1）模型小鼠的要求

构建模型的小鼠的要求：C57BL/6或BALB/c，雌性，6-8周。

满足SPF级维持鼠营养需要，各项营养指标全面合理。经过钴-60辐照灭菌，无沙门氏菌等致病菌，菌落总数在国家标准范围内，适用于SPF级大、小鼠的饲喂。

所述的SPF，即Specific Pathogen Free，指无特定病原体动物，是指除清洁动物应排除的病原外，不携带主要潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原的实验动物。

（2）小鼠的UC定植

UC模型建立前，给予适当含量的白色念珠菌灌胃培养。用接种环将沙氏平板上的白念珠菌单菌落轻轻挑出并接种至事先配置好的液体沙氏培养基中，于 37℃恒温培养箱培养培养12 h后取出，将菌液浓度调整成适当浓度（例如：1.0×10

（3）白色念珠菌灌胃培养

白色念珠菌的要求：白念珠菌接种于装有液态沙氏培养基的锥形瓶中，置于37 ℃恒温摇床中培养12 h。取出，离心收集后将菌液含量调整至1×10

灌胃培养的具体方式：将小鼠灌胃针连接至 1ml 一次性注射器，抽取定量（约0.2-0.5mL/只）菌液；将小鼠全身固定于手心，并保持头颈部平直，将灌胃针针头沿小鼠嘴角角缓慢推入口腔插入胃内，将菌液缓慢推入。

（4）硫酸葡聚糖钠（DSS）灌胃培养

给予小鼠自由饮用3% DSS水溶液7 d（期间断绝其他饮水，饮食自由），每隔1 d更换新鲜的DSS溶液。

（5）模型的构建

雌性C57小鼠常规饲养观察。状态稳定后，接连4天上午9时给予白念株菌灌胃，1.0×10

（6）模型的应用方法

应用于白念株菌与溃疡性结肠炎作用机制的研究及有效药物的筛查与发现；引发学者对肠道真菌群在疾病中所扮演角色的探究。

（1）模型构建过程，每天及时给待造模小鼠更换新鲜的DSS饮用水（每天每只小鼠约5mL DSS饮用水）；每天称体重前使用粪便隐血试剂盒记录便血情况。注意：为减少DSS饮用水洒漏，建议使用滚珠防漏饮水瓶；建议2-3天更换新的蓬松垫料。

（2）模型具体使用，雌性C57小鼠饲养状态稳定后，连续4天于每天上午9点对小鼠灌胃白念株菌处理，每只1.0×10

（3）模型使用时，动物房内尽量保持12:12的明暗交替时间且动物房一切人为活动保持安静，以保证小鼠正常稳定的生理状态；垫料需经消毒灭菌处理，除去潜在的病原体和有害物质，一般以木屑和玉米芯（加工粉碎除尘后使用）为宜；若冬季饲养务必注意环境温度21～27℃为宜且空气应尽量保持新鲜，注意通风换气；笼内密度适宜（约保持在5只/笼）。

（4）建立 UC 动物模型的方法有很多，常见的有：转基因模型、基因敲除模型、化学药物诱导模型、组织移植模型等，其中多被研究者广泛使用的是化学药物DSS法诱导UC模型。这主要由于其制作简单、成功率高，易形成以黏膜溃疡为特征的急性溃疡性结肠炎，具有与人类疾病相似的病变反应和临床表现。对比其他造模方法，该方法简单易行；模型成功率高，实验重复性强且造价较低。

（7）模型的病理学和结肠组织学变化的评估方法

UC的显微镜下特征可以概括为：隐窝结构异常，上皮细胞异常，炎症浸润。 隐窝异常包括：隐窝分支增多，肠隐窝扭曲，隐窝萎缩以及表面不规则。上皮异常主要包括黏蛋白耗损和潘氏细胞化生。炎症浸润主要指基底层浆细胞和淋巴细胞数目的增多，固有层中性粒细胞以及嗜酸性粒细胞数量的增多。

UC组织学严重程度的评估根据细胞浸润情况和组织结构改变来评价：根据HE染色，在组织学严重程度表现的基础上分为0-4级。0级：正常组织；1级：黏膜轻度炎症，以单核细胞为主，上皮破坏少；2级：比1级严重的多发性炎症， 包括单核细胞和少量中性粒细胞，隐窝腺体远离基底膜，杯状细胞黏蛋白减少；3级：比2级更严重的多发性炎症，包括黏膜下层单核细胞和中性粒细胞浸润，隐窝脓肿和黏蛋白消耗，上皮破坏和一些溃疡的形成；4级：隐窝消失, 以中性粒细胞为主的严重的黏膜炎症。

本模型基于白念株菌预定植的前提，由DSS诱导溃疡性结肠炎，模拟了一种饮食结构不当而菌群失调的小鼠肠炎模型。白色念珠菌靠单糖而繁衍，所以长期摄取富含单糖的食物和高量酵母的食物如酒精饮料、蔗糖、糖蜜、花生、乳酪、以及土豆、玉米、红薯等食物易引起白色念珠菌的异常增殖。作为条件致病性真菌，其异常增殖将直接导致机体免疫力下降和真菌负荷增加。近来研究发现溃疡性结肠炎常与菌群失调相关联，因此建立白念株菌失调的溃疡性结肠炎模型有助于研究白念株菌与溃疡性结肠炎间的相互作用及作用机制，为人类疾病做出相应贡献。

溃疡性结肠炎是属于炎症性肠病的一种慢性非特异性肠病，其发病后病程较长，易反复。机制尚不明确，是多种因素相互作用的结果。有研究发现，肠道内真菌分布异常与炎症性肠病尤其是 UC 的发生有着很大关联。UC 患者肠道中可检测出显著高于正常人群的真菌含量，其中数量最多的白色念珠菌会在固有免疫低下的 UC 患者肠道内定植，并在体内传播感染。白色念珠菌为条件致病性真菌靠单糖而繁衍，常寄生于人的皮肤、口腔、阴道和肠道粘膜处。随着免疫功能低下或免疫缺陷的病人日益增多，其感染率不断增加。而机体免疫力下降和真菌负荷增加时，肠道和其他部位的正常真菌菌群就可能成为病原菌，引起真菌感染性疾病，甚至是致命性侵袭性真菌感染。因此，本模型是以实际需求为前提建立的。

以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。