具有肥胖预防或治疗效果的新的长双歧杆菌菌株或鼠李糖乳杆菌菌株及其用途

【技术领域】

本公开涉及具有肥胖预防或治疗效果的新的长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)菌株或鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株及其用途。

【背景技术】

随着近年来的经济现代化，生活水平的提高，脂肪和糖的摄入量增加，纤维的摄入量减少，特别是由于外出就餐文化的建立，偏好高蛋白饮食的现象显著。相反，现实是由于几乎没有体力活动的现代人的生活方式，肥胖人口正迅速增加。随着高热量食物的摄入增加和纤维摄入减少，肥胖，特别是腹部肥胖，正成为严重的社会问题。肥胖(obesity)是指脂肪组织过度增加的状态，并且由于肥胖引起的体重增加主要是由于脂肪增加。达到肥胖状态的机制是，当摄取过量的糖时，食物中所含的糖被消化成单糖，单糖又通过小肠被吸收入体内，因此血糖水平升高，并因此刺激胰岛素分泌，其中胰岛素作用于脂肪细胞以接受血液中的单糖并将它们转化成脂肪。

肥胖的危害不仅是由于脂肪组织压迫腹部，经常引起便秘、消化不良、胃肠紊乱，而且也是许多成人疾病的危险因素。已知肥胖与糖尿病、高血压、冠状动脉疾病和癌症直接相关，并且WHO将肥胖定义为21世纪的慢性疾病。预计其在韩国的患病率在2030年将增加到超过50％，因此，预计国家和个人的经济负担将显著增加。因此，在韩国和国外，许多关注和投资正投入到预防和治疗肥胖的研究中。

小鼠脂肪细胞3T3-L1是已经分化成仅成熟为白色脂肪细胞的细胞，并且是肥胖研究中最广泛使用的细胞系。在本公开中，研究了乳酸菌培养基对乳酸菌培养基褐变的影响(褐变(Browning)：蓄积能量的白色脂肪细胞消耗能量并转化为维持放热反应和热稳态的褐色脂肪细胞的过程)。此外，分析小鼠C3H10T1/2间充质干细胞中褐色脂肪细胞因子和米色脂肪细胞因子特异性基因的表达模式，允许在新的范例下开发用于预防和治疗肥胖的组合物。

在这一点上，在韩国专利1778734中，公开了“从长双歧杆菌KACC 91563中分离的ESBP和使用该ESBP的抗过敏组合物”。韩国专利1401530公开了“产生共轭亚油酸的长双歧杆菌菌株及其用途”。然而，上述文献没有公开根据本公开的“通过诱导米色脂肪细胞和褐色脂肪细胞的形成而具有预防或治疗肥胖效果的长双歧杆菌菌株或鼠李糖乳杆菌菌株及其用途”。

【发明内容】

【技术问题】

本公开基于上述需求而得到。与在减少白色脂肪细胞数量方面鉴定抗肥胖效果的常规方法不同，根据本公开，成熟为最广泛用于肥胖研究白色脂肪细胞的、且已分化完成的前体脂肪细胞3T3-L1，被长双歧杆菌DS0956菌株和鼠李糖乳杆菌DS0508菌株培养基中的每一者处理，以研究所述处理对3T3-L1脂肪细胞褐变的效果(褐变(Browning)：蓄积能量的白色脂肪细胞消耗能量并转化为维持放热反应和热稳态的褐色脂肪细胞的过程)。

结果，用根据本公开的乳酸菌长双歧杆菌DS0956菌株和鼠李糖乳杆菌DS0508菌株培养基中的每一者处理，促进了白色脂肪细胞3T3-L1中米色脂肪细胞和褐色脂肪细胞特异性基因的表达。此外，还证实了该处理促进小鼠C3H10T1/2间充质干细胞中米色脂肪细胞特异性基因的表达和褐色脂肪细胞特异性基因的表达。

此外，基于通过将根据本公开的长双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌菌株或其培养基施用于高脂肪饮食诱导的肥胖小鼠来研究肥胖的抑制或改善效果的结果，证实了与阴性对照相比抑制显著体重增加的效果，以及在小鼠白色脂肪细胞中，产热特异性基因或褐色脂肪细胞/米色脂肪细胞特异性基因的增加的表达水平和诱导的效果。此外，还证实了总胆固醇和低密度脂蛋白(LDL)的降低作用，提示肥胖小鼠模型的脂质代谢特征的总体改善。

基于上述事实，证实长双歧杆菌菌株和鼠李糖乳杆菌菌株通过激活与体内脂肪细胞氧化相关的基因表达，氧化体内脂肪，并大大减少体内脂肪细胞代谢和脂肪细胞积累，并且显著改善施用该菌株的动物的脂质代谢特征。因此，完成了本公开。

【技术方案】

为了实现这些目的，本公开提供了一种新的长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)菌株或鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)菌株。

此外，本公开提供了用于预防或治疗肥胖的药物组合物，所述组合物包含选自由菌株、菌株的培养基、培养基的浓缩物、培养基的干燥物(dried material)和培养基的提取物组成的组中的至少一种作为活性成分。

此外，本发明提供了一种用于预防或改善肥胖的保健功能性食品组合物，该组合物包含选自由菌株、菌株的培养基、培养基的浓缩物、培养基的干燥物产物和培养基的提取物组成的组中的至少一种作为活性成分。

此外，本发明提供一种用于预防或改善肥胖的饲料组合物，所述组合物包含选自由菌株、菌株的培养基、培养基的浓缩物、培养基的干燥物和培养基的提取物组成的组中的至少一种作为活性成分。

【发明的有益效果】

根据本公开的每种乳酸菌长双歧杆菌菌株和鼠李糖乳杆菌菌株的处理引起仅应成熟为白色脂肪细胞的3T3-L1的褐变。特别是，我们证实，与未处理的对照相比，该处理具有显著提高白色脂肪细胞3T3-L1和小鼠间充质干细胞C3H10T1/2细胞中米色脂肪细胞和棕色脂肪细胞特异性基因表达的效果。

此外，我们证实了当对受试者施用根据本公开的乳酸菌长双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌菌株或培养基时，由于摄入高脂饮食而引起的体重增加得到抑制，并且与产热相关的基因和棕色脂肪/米色脂肪细胞特异性基因的表达水平增加，从而减少了胆固醇和LDL等脂质成分的数量。

因此，乳酸菌长双歧杆菌菌株和鼠李糖乳杆菌菌株均显示出抗肥胖作用，因此可用作预防或治疗肥胖，改善脂质代谢以及相关产业的食品，药物或饲料。

【附图说明】

图1a显示了使用是前脂肪细胞的3T3-L1细胞从55种乳酸菌中选择具有抗肥胖功效的菌株的选择流程图。

图1b是使用TG(甘油三酸酯)定量，用1、5和10μl乳酸菌培养基首先处理后的选择结果。A，乳酸菌培养基1μl处理组；B，乳酸菌培养基5μl处理组；C，乳酸菌培养基10μl处理组；t，由于细胞毒性而从第二次筛查中排除。PA，阴性对照，前脂肪细胞，未经MDI分化培养基处理；MDI(M：甲基-异丁基-黄嘌呤D：地塞米松，I：胰岛素)脂肪细胞分化培养基处理的对照；阳性对照经过Rosi(罗格列酮)处理。Rosi是PPAR-γ激动剂。

图2a是显示与对照相比，所选的菌株培养基(#30和#51菌株)的甘油三酯(TG)相对积累量的比较图。PA、MDI和Rosi与图1b中所述相同。

图2b是当用选择的菌株培养基处理3T3-L1细胞时，通过TEM观察到的细胞的显微图像(5,000×放大率)。白色箭头表示脂滴(LD)。

图2c显示了所选菌株培养基(#30和#51菌株)的ORO染色(油红O染料)。第1，乳酸菌培养基1μl处理组；第2，乳酸菌培养基5μl处理组；第3，乳酸菌培养基10μl处理组；(-)未用MDI分化培养基处理的阴性对照；(+)，MDI分化培养基处理组；用Rosi(罗格列酮)处理的阳性对照。Rosi是PPAR-γ激动剂。#30和#51是指用所选的乳酸菌培养基进行的处理。

图3a显示了所选的乳酸菌培养基(菌株#30，菌株#51)对小鼠前脂肪细胞3T3-L1中褐色脂肪细胞特异性基因表达的影响，并显示了mRNA的相对表达水平比较。图3b显示了所选的乳酸菌培养基(菌株#30和#51)对小鼠间充质干细胞C3H10T1/2细胞中褐色脂肪细胞特异性表达基因的影响，并显示了基因mRNA的相对表达水平比较。MDI(M：甲基-异丁基-黄嘌呤，D：地塞米松，I：胰岛素)脂肪细胞分化培养基处理的阴性对照；用Rosi(罗格列酮)处理的阳性对照。Rosi是PPAR-γ激动剂。#30和#51是指用所选的乳酸菌培养基进行的处理。

图4a显示了所选的乳酸菌培养基(菌株#30，菌株#51)对小鼠前脂肪细胞3T3-L1中米色脂肪细胞特异性基因表达的影响，并显示了mRNA的相对表达水平比较。图4b显示了所选的乳酸菌培养基(菌株#30和#51)对小鼠间充质干细胞C3H10T1/2细胞中米色脂肪细胞特异性表达基因的影响，并显示了基因mRNA的相对表达水平比较。MDI(M：甲基-异丁基-黄嘌呤，D：地塞米松，I：胰岛素)脂肪细胞分化培养基处理的阴性对照；用Rosi(罗格列酮)处理的阳性对照。Rosi是PPAR-γ激动剂。#30和#51是指用所选的乳酸菌培养基进行的处理。

图5a是当用所选的乳酸菌培养基(菌株#30和#51)处理3T3-L1细胞时，基于mRNA的相对量的测量的脂解相关基因的表达水平的比较图。图5b是基于mRNA的相对量的测量的β氧化相关基因的表达水平的比较图。

图6证实了当将菌株#30和菌株#51的乳酸菌培养基应用于3T3-L1细胞时，PKA信号传导是否被激活。A证实PKA是否被磷酸化。B表示用H89作为PKA磷酸化抑制剂处理的结果。C为基于mRNA的相对量测量的H89处理导致的产热相关基因表达水平图。D至F是使用siPKAcat a1基于mRNA和蛋白质的量测量的，比较产热相关基因和脂肪细胞分化相关基因的表达水平的图。

图7证实了当用乳酸菌培养基#30和#51处理3T3-L1细胞时与脂解酶相关的基因表达的变化(左图，HSL S-660和HSL S-563分别指对Ser

图8显示给予乳酸菌菌株或培养基12周后，测得的高脂肪饮食诱导的肥胖小鼠的体重变化。(G1、高脂肪饮食非处理组；G2、高脂肪饮食给予组；G3、高脂肪饮食和微生物培养基给予组；G4、高脂肪饮食和鼠李糖乳杆菌GG细菌给予组；G5、高脂肪饮食和#30菌株培养基给予组；G6、高脂肪饮食和#51菌株培养基给予组；G7、高脂肪饮食和#30细菌给予组；G8、高脂肪饮食和#51细菌给予组。其它与上述相同)

图9显示在施用菌株或培养基12周后，高脂肪饮食诱导的肥胖小鼠中白色脂肪细胞的H&E(苏木精和曙红)染色结果。

图10显示对作为通过高脂肪饮食诱导肥胖的小鼠的受试者给予乳酸菌菌株或培养基12周后，高脂肪饮食诱导肥胖小鼠血液中葡萄糖、总胆固醇(T-chol)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)水平的变化。

图11显示在给予乳酸菌菌株或培养基12周后，具有高脂肪饮食诱导的肥胖的小鼠的白色脂肪细胞(WAT)、性腺白色脂肪细胞(性腺WAT)、腹膜白色脂肪细胞(腹膜WAT)和肠系膜白色脂肪细胞(肠系膜WAT)中产热特异性基因表达的变化。

图12a为给予乳酸菌菌株或培养基12周后，具有高脂肪饮食诱导的肥胖症的小鼠中包括M1巨噬细胞炎症相关细胞因子的基因的相对mRNA表达水平的比较图。

图12b显示在给予乳酸菌菌株或培养基12周后，具有高脂肪饮食诱导的肥胖症的小鼠中M2巨噬细胞特异性基因的相对mRNA表达水平的比较图。

【具体实施方式】

在下文中，将详细描述本公开。

根据本公开的一个方面提供了一种新的长双歧杆菌菌株或鼠李糖乳杆菌菌株。

长双歧杆菌菌株可以是长双歧杆菌DS0956，优选地，可以是保藏号为KCTC13505BP的长双歧杆菌DS0956菌株，但不限于此。长双歧杆菌DS0956菌株保藏在韩国生物科学和生物技术研究所，保藏号为KCTC13505BP，保藏于2018年3月26日。

鼠李糖乳杆菌菌株可以是鼠李糖乳杆菌DS0508，优选地，可以是保藏号为KCTC13504BP的鼠李糖乳杆菌DS0508菌株，但不限于此。鼠李糖乳杆菌DS0508菌株保藏在韩国生物科学和生物技术研究所，保藏号为KCTC13504BP，保藏于2018年3月26日。

在根据本公开的一个实施方案的菌株中，长双歧杆菌菌株或鼠李糖乳杆菌菌株意在诱导米色脂肪细胞和褐色脂肪细胞的形成，以促进抗肥胖效果。优选地，长双歧杆菌菌株或鼠李糖乳杆菌菌株以特定方式增加产热相关基因和褐色脂肪细胞相关基因在3T3-L1脂肪细胞和小鼠间充质干细胞C3H10T1/2中的表达，从而诱导米色脂肪细胞和褐色脂肪细胞的形成。更优选地，长双歧杆菌菌株或鼠李糖乳杆菌菌株增加Ucp1(解偶联蛋白1)、Pgc1a(过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1-α)、Prdm16(PR/SET结构域16)、Pparg(过氧化物酶体增殖物激活受体γ)、CD137、Fgf21(成纤维细胞生长因子21)、P2RX5(嘌呤能受体P2X 5)和Tbx1(T-box 1)基因的表达以诱导米色脂肪细胞和褐色脂肪细胞的形成。最优选地，长双歧杆菌菌株或鼠李糖乳杆菌菌株以特定方式增加产热相关基因Ucp1、Pgc1a、Prdm16和褐色脂肪细胞相关的CD137和Fgf21基因在3T3-L1脂肪细胞和小鼠间充质干细胞C3H10T1/2中的表达，从而诱导米色脂肪细胞和褐色脂肪细胞的形成。然而，本公开不限于此。CD137基因也称为TNFRSF9(TNF受体超家族成员9)。此外，在用根据本公开的长双歧杆菌菌株或鼠李糖乳杆菌菌株处理下，可以降低在白色脂肪细胞中特异性表达的Past1、Resistin或Sarpina3k基因的表达水平。

根据本公开的菌株增加了已经分化的白色脂肪细胞中褐色脂肪细胞或米色脂肪细胞特异性基因的表达，并且可以将白色脂肪细胞转化为褐色或米色脂肪细胞。因为褐色脂肪细胞和米色脂肪细胞的特征在于促进脂肪分解产生能量，所以根据本公开内容的菌株具有抑制或改善肥胖的作用。

此外，长双歧杆菌菌株或鼠李糖乳杆菌菌株增加与脂肪降解相关的基因Atgl、HSL、Pnin1或Pnin5基因的表达水平，或者也可增加与脂质的β-氧化相关的基因LCAD、MCAD、LCPT或Abhd5基因的表达水平。脂肪降解相关基因或β-氧化相关基因可促进分解和去除积累的脂肪的作用。因此，本发明的菌株通过减少脂肪的积累并抑制体重增加而具有抑制或改善肥胖的效果。

此外，长双歧杆菌菌株或鼠李糖乳杆菌菌株可以激活PKA信号传导。长双歧杆菌菌株或鼠李糖乳杆菌菌株可以激活PKA信号过程以增加磷酸化PKA、磷酸化AMPK和磷酸化转录调节因子CREB的量，从而增加与产热脂肪细胞分化相关的基因，即Ucp1、Pgc1a、Pparg或Ceba基因的表达，因此通过诱导白色脂肪细胞褐变而实现抑制或改善肥胖的效果。

当施用至肥胖受试者时，根据本公开的长双歧杆菌菌株或鼠李糖乳杆菌菌株通过改善脂质代谢特征具有改善或治疗肥胖的效果。为了证实根据本公开改善脂质代谢特征的效果，在本公开的一个具体实施例中，将长双歧杆菌或鼠李糖乳杆菌的菌株或培养基施用给具有高脂肪饮食诱导的肥胖的小鼠，以观察任何变化。结果显示，根据本公开的菌株和培养基具有抑制体重增加和增加小鼠白色脂肪细胞中产热相关基因、褐色脂肪细胞和米色脂肪细胞特异性基因的表达水平的作用。如上所述的基因表达水平的增加可以促进受试者的白色脂肪细胞转分化(transdifferentiation)为褐色脂肪细胞或米色脂肪细胞，从而抑制或改善肥胖症。另外，通过降低施用所述菌株或培养基的受试者中的脂质组分如胆固醇和LDL的量，可以改善脂质代谢。

此外，在本发明的另一个具体实施方案中，基于当将长双歧杆菌或鼠李糖乳杆菌的菌株或培养基施用于肥胖受试者时研究基因表达水平的结果，证实了在受试者的白色脂肪细胞中，炎症促进M1巨噬细胞标记物CD11c、CD68、IL-1b、Mcp1和TNF-a基因中的每一者的表达水平降低，而抗炎M2巨噬细胞标记物即Arg1和CD206基因的表达水平升高。因此，当给予具有肥胖的受试者本公开的菌株或培养基时，发生M1巨噬细胞的量降低且M2巨噬细胞的量增加的转化。因此，提示将该菌株或培养基给予肥胖受试者可促进抑制或改善肥胖的效果。

根据本公开的另一方面提供了包含乳酸菌的组合物。

所述乳酸菌包括长双歧杆菌或鼠李糖乳杆菌。

所述包含乳酸菌的组合物含有选自由菌株、菌株的培养基、培养基的浓缩物、培养基的干燥物和培养基的提取物组成的组中的至少一种作为有效成分。

根据本公开的包含乳酸菌的组合物可以制备成单位剂型，或者可以使用载体、赋形剂和/或添加剂，使用本公开所属技术领域的普通技术人员可以容易地进行的方法，通过制剂引入到多剂量容器中。在这方面，制剂可以是油或水介质中的溶液、悬浮液或乳液的形式，或者是提取物、粉末、颗粒、片剂、胶囊、凝胶(例如水凝胶)或冻干制剂的形式。添加剂，例如分散剂、稳定剂或冷冻保护剂，可以另外包含于其中。

具体地，当添加剂是冷冻保护剂时，菌株可以随冷冻保护剂冻干，并且可以以粉末形式使用。冷冻保护剂可以是脱脂奶粉、麦芽糊精、糊精、海藻糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、环糊精、甘油和/或蜂蜜。此外，可以将组合物与储存载体混合，并且可以将混合物吸收并干燥和固化以供使用。储存载体可以是硅藻土、活性炭和/或脱脂米糠。

根据本公开的包含乳酸菌的组合物可以通过混合选自由菌株、菌株的培养基、培养基的浓缩物、培养基的干燥物和培养基的提取物组成的组中的至少一种，与载体、赋形剂或添加剂中的任一种，来制备。

菌株、载体、赋形剂和添加剂的描述如上所述。当使用冷冻保护剂作为添加剂时，包含乳酸菌的组合物可以制备成冻干粉形式，通过将菌株和冷冻保护剂彼此混合制备混合物，并在-45℃至-30℃冷冻，在30℃至40℃干燥，并用混合器研磨混合物以获得冻干粉末。具体地，冷冻过程可以是在-45℃至-30℃的温度条件和5至50毫托的压力条件下真空冷冻混合物65至75小时的过程。

根据本公开的另一方面提供了包含乳酸菌的组合物用于预防、治疗或改善肥胖症的用途。

包含乳酸菌的组合物可以是药物产品、食品或饲料。当包含乳酸菌的组合物是药物产品时，该组合物可以是用于预防或治疗肥胖的药物组合物。当包含乳酸菌的组合物是食品时，该组合物可以是用于预防或改善肥胖的保健功能性食品组合物。当包含乳酸菌的组合物是饲料时，该组合物可以是用于预防或改善肥胖的饲料组合物。

本公开提供了一种用于预防或治疗肥胖的药物组合物，该组合物包含选自由菌株、菌株的培养基、培养基的浓缩物、培养基的干燥物和培养基的提取物组成的组中的至少一种作为活性成分。

如上所述的菌株，在根据本公开的一个实施方案中，药物组合物可以制备成单位剂型，或者可以使用药学上可接受的载体和/或赋形剂，使用本公开所属技术领域的普通技术人员可以容易地进行的方法，通过制剂引入到多剂量容器中。在这方面，制剂可以是油或水介质中的溶液、悬浮液或乳液的形式，或者是提取物、粉末、颗粒、片剂、胶囊或凝胶(例如水凝胶)的形式。制剂可以另外包含分散剂或稳定剂。

此外，包含在药物组合物中的菌株可以被载在药学上可接受的载体上，例如胶体悬浮体、粉末、生理盐水、脂质、脂质体、微球(microspheres)或纳米球颗粒。它们可以与载体(vehicle)复合(complexed)或连接(linked)，并且可以使用本领域已知的递送系统在体内递送，所述递送系统例如脂质、脂质体、微球、金、纳米颗粒、聚合物、缩合剂、多糖、聚氨基酸、树枝状聚合物、皂苷、吸附增强物质或脂肪酸。

另外，药学上可接受的载体可以包括乳糖、葡萄糖(dextrose)、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、橡胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等，它们通常用于制剂中。但是本公开不限于此。此外，除了上述组分之外，其中还可以包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。合适的药学上可接受的载体和制剂Remington's Pharmaceutical Sciences,19th ed.,1995中有详细描述。

本发明的药物组合物可以在临床施用时口服或胃肠外施用，并且可以以一般药物制剂的形式使用。即，根据本公开的药物组合物可以在实际临床施用期间以各种口服和肠胃外剂量形式施用。制剂可以使用稀释剂或赋形剂制备，例如通常使用的填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等。口服施用的固体制剂可以包括片剂，丸剂，散剂，颗粒剂，胶囊剂等。这些固体制剂可以通过将至少一种赋形剂，例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等与草药提取物或发酵的草药产品混合来制备。此外，除了简单的赋形剂之外，还使用润滑剂，如硬脂酸镁和滑石。口服施用的液体制剂可以包括悬浮液、液体溶液、乳液和糖浆。除了通常用作简单稀释剂的水和液体石蜡之外，其中还可以包含各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等。用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液、非水溶剂、悬浮液、乳液、冻干制剂和栓剂。丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)和可注射的酯(如油酸乙酯)可以用作非水溶剂和悬浮液。栓剂基质可以包括Witepsol、Macrogol、吐温61、可可脂、月桂精、甘油、明胶等。

根据本公开的药物组合物可以单独使用，或与手术、放射疗法、激素疗法、化学疗法和使用生物反应调节剂的方法组合使用，用于抑制和治疗肥胖。

根据本公开的组合物中包含的活性成分的浓度可以考虑治疗目的、患者的状况、所需的时间等来确定，并且不限于特定的浓度范围。根据本公开的药物组合物以药学上的有效量施用。在本公开中，术语“药学上的有效量”是指足以以适用于医学治疗的合理的效益/风险比治疗疾病的量。有效剂量水平可取决于包括疾病类型、其严重性、药物活性、对药物的敏感性、施用时间、施用途径和排泄速率、治疗持续时间、同时使用的药物和医学领域中公知的其它因素在内的因素。根据本公开的药物组合物可以作为单独的治疗剂施用，或者可以与由其它污染物引起的疾病的治疗剂，或用于改善皮肤老化的制剂组合施用，或者可以与常规治疗剂同时、分开或顺序施用，或者可以单次或多次施用。当考虑所有上述因素时，重要的是以最小量达到最大效果且没有副作用的量施用组合物。本领域技术人员可以容易地确定这种量。

具体地，根据本公开的药物组合物的有效量可以根据患者的年龄、性别、状况、体重、活性成分在体内的吸收、失活速率、排泄速率、疾病类型和与其组合使用的药物而变化，或者可以根据施用途径、肥胖症的严重程度、性别、体重、年龄等而增加或减少。例如，根据本发明的组合物可以每天每1kg患者体重约0.0001μg至500mg，例如0.01μg至100mg的量施用。此外，根据医生或药剂师的判断，组合物可以一天分开施用几次，例如，以规律的时间间隔一天施用2至3次。

本公开提供了一种用于预防或治疗肥胖的方法，所述方法包括向受试者施用所述药物组合物。

受试者可以是人或非人动物，并且可以处于非肥胖状态或处于肥胖状态。当受试者不处于肥胖状态时，可以通过以药学上的有效量向受试者施用药物组合物来预防肥胖。当受试者处于肥胖状态时，可以通过以药学上的有效量向受试者施用药物组合物来治疗肥胖。

药物组合物的制剂、其施用方法、其剂量和组合物中包含的活性成分的浓度如上所述。

此外，本发明提供了一种用于预防或改善肥胖的保健功能性食品组合物，该组合物包含选自由菌株、菌株的培养基、培养基的浓缩物、培养基的干燥物和培养基的提取物组成的组中的至少一种作为活性成分。

在根据本公开的一个实施方案的保健功能性食品组合物中，该保健功能性食品组合物可以抑制体重增加或脂肪积累。

当使用根据本公开的保健功能性食品组合物作为食品添加剂时，该保健功能性食品组合物可以以未改变的方式添加，或者可以与其他食品或食品原料一起使用，并且可以根据常规方法适当地使用。活性成分的量可以根据使用目的(预防或改善)适当地确定。通常，在制备食品或饮料时，基于原料的重量，根据本公开的保健功能性食品组合物可以以15重量份或更少，优选10重量份或更少的量添加。然而，为了健康目的长期食用，其量可以小于上述范围。因为没有安全性问题，所以活性成分可以以高于该范围的量使用。

对保健功能性食品的种类没有特别限制。可以添加所述保健功能性食品组合物的食品的实例可以包括肉、香肠、面包、巧克力、糖果(candy)、点心、糖果(confectionery)、比萨、拉面、其它面条、口香糖、包括冰淇淋的乳制品、各种汤、饮料、茶、饮品、酒精饮料和维生素复合物等。所述食品可以包括通常意义上的所有种类的健康食品。

此外，根据本公开的健康功能性食品组合物可以制备为食品，特别是功能性食品。根据本公开的功能性食品包含通常在食品制备期间添加的成分。其实例可以包括蛋白质、碳水化合物、脂肪、营养素和调味品。例如，当将食品制备为饮料时，其中可以包含天然碳水化合物或调味剂作为除活性成分之外的附加成分。天然碳水化合物可包括单糖(例如，葡萄糖、果糖等)、二糖(例如，麦芽糖、蔗糖等)、寡糖、多糖(例如，糊精、环糊精等)或糖醇(例如，木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等)。调味剂可以是天然调味剂(例如，奇异果甜蛋白(taumatin)、甜叶菊提取物等)和合成调味剂(例如，糖精、阿司巴甜(aspartame)等)。

除了所述保健功能性食品组合物之外，所述食品还可以包含各种营养素、维生素、电解质、调味剂、着色剂、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、用于碳酸饮料的碳酸化剂等。尽管添加成分的含量不是非常重要，但是该含量通常可以选自，根据本公开的保健功能性食品组合物为100重量份下的0.01至0.1重量份的范围。

此外，本发明提供了一种用于预防或改善肥胖的饲料组合物，所述组合物包含选自由菌株、菌株的培养基、培养基的浓缩物、培养基的干燥物和培养基的提取物组成的组中的至少一种作为活性成分。

如上所述的菌株，该组合物可以作为饲料添加剂组合物加入，以预防或改善肥胖。根据本公开的饲料添加剂可以是饲料管理法案下的辅助饲料。

在本公开中，术语“饲料”可以指动物食用、摄取和消化或适用的任何天然或人工饮食、一餐或一餐的成分。对饲料的种类没有特别限制。可以使用本领域常用的饲料。饲料的非限制性实例可以包括植物饲料，例如谷物、根果、食品加工副产物、藻类、纤维、药物副产物、油和脂肪、淀粉、瓜(gourd)或谷物副产物；和动物基饲料，如蛋白质、无机物、油、矿物质、单细胞蛋白质、浮游动物、食物等。这些可以单独使用或两种以上组合使用。

在下文中，将基于实施例详细描述本公开。然而，以下实施例仅意在具体示例本公开，并且根据本公开的内容不限于以下实施例。

地塞米松、IBMX(异丁基-1-甲基黄嘌呤)、胰岛素、罗格列酮(Rosi)、油红O染料、MTT(溴化-3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑)和4％甲醛，购自Sigma Aldrich(美国密苏里州圣路易)。

DMEM(Dulbecco Modified Eagle's Media)、新生牛血清(NBCS)和重组人BMP4，购自Gibco(美国纽约州格兰德艾兰)。胎牛血清购自AtlasBiologics(美国科罗拉多州柯林斯堡)。青霉素-链霉素溶液购自Hyclone Laboratories,Inc.(美国纽约州南洛根)。

为了分离各种乳酸菌，在绝对厌氧条件下使用MRS培养基。对于厌氧条件，使用N

为了对分离乳酸菌进行分子生物学鉴定，使用27F(5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTCA-3′：SEQ ID NO:3)和1492R(5′-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′：SEQ ID NO:4)作为靶向16S rRNA基因的通用引物。进行了16S rRNA基因的核苷酸序列分析。通过分析获得的核苷酸序列通过在EZbiocloud(http://www.ezbiocloud.net/)中的鉴定搜索来鉴定。

为了研究抗肥胖活性，使用5％CO

此外，C3H10T1/2小鼠间充质干细胞购自韩国细胞系库(KCLB-10226)，并在37℃下使用5％CO

为了发现用乳酸菌培养基处理的细胞中基因的表达，使用RNA提取试剂盒(美国加州瓦伦西亚Qiagen)，根据生产商的说明书从中提取总RNA。使用Scandrop Analytik JenaAG分光仪(德国Jena)测量其浓度。使用Maxime RT PreMix试剂盒(韩国iNtRONBiotechnology)将1μg RNA合成为cDNA。PCR反应在Veriti 96孔热循环仪(新加坡AppliedBiosystems)中进行。使用iQ

【表1】

本实验中使用的引物组

在通过让小鼠摄取高脂肪饮食诱导肥胖模型后，将肠微生物培养基或微生物细胞给予小鼠12周。检查其功效。本研究中使用的小鼠是3周龄的C57BL/6 SPF雄性小鼠。在进行了7天适应环境的小鼠中，只有健康的动物用于测试。使用45％kcal高脂肪饮食D12451(Research Diet)给小鼠喂食高脂肪饮食12周，以建立饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠模型。实验中所用的组的组成在下表2中说明。乳酸菌的施用量为10

【表2】

对于所有动物，每天观察一次一般症状直到尸检日，并且在测试期间每周五次测量体重和食物量。在测试期结束之后，以呼吸麻醉方式进行麻醉，并通过心脏血液收集从其中收集血液。从每组2只小鼠上切下脂肪部分，并储存在4％多聚甲醛溶液或RNA储存溶液(ThermoFisher)中。使用血细胞计数器(Beckman Coulter)进行血细胞分析。然后，将进行了血细胞分析的试样进行离心分离，由此得到血浆。然后，使用血浆分析样品的总胆固醇、HDL、LDL和葡萄糖。将包含在4％PFA溶液中的脂肪组织用于石蜡块制备。

该实验的所有数据表示为三个或更多个独立实验的平均值±标准偏差(SD)。除非另有说明，MDI处理的样品组用于鉴定与对照组相比数据的变化。使用学生t检验计算对照组和其它处理组的数据之间的显著差异。*P＝0.05，**P≤0.01，***P≤0.001。P值小于0.05被认为具有统计学意义。

为了观察使用55种乳酸杆菌菌株在3T3-L1前脂肪细胞中转化为米色和褐色脂肪细胞的可能性，将每种乳酸杆菌菌株在MRS培养基中培养48小时，然后离心获得上清液。将得到的上清液冷冻干燥，然后将初始体积为1/10体积的无菌蒸馏水加入到上清液中，以制备其浓缩物。将1、5和10μl的该浓缩物中的每一者应用于3T3-L1细胞，其中甘油三酯的积累量通过油红O染色定量。因此，在乳酸菌培养基中选择引起褐变和米色脂肪细胞的活性候选组(填充有斜线的条)。此外，从中选择抑制脂肪细胞形成的候选组(填充有点的条)(图1B)。

在用1、5和10μl乳酸菌浓缩物中的每一者处理的脂肪细胞的增殖增加10至20％的组中(用Rosi作为对照)，产生褐变脂肪细胞的活性候选组首先选自具有相对高的10μl处理浓度的组，。对于#51具有抑制脂肪细胞形成的作用，活性候选组选自在三次浓度测试中具有10μl的相对高浓度的组。在基于如上所述积累的甘油三酯的量的第一次筛选后，基于作为褐色脂肪细胞特异性基因之一的UCP1是否表达，通过第二和第三次筛选过程进一步筛选所选的候选组，从而选择四个候选者。然后，从四种候选菌株中最终选择#30和#51乳酸菌菌株。

为了确定最终所选的#30和#51对脂肪细胞产生的影响，用其1、5和10μl中的每一者进行处理。然后，通过油红O染色研究甘油三酯的量。鉴定存在于脂肪细胞中的脂滴(LD)(图2A至图2C)。结果，当用乳酸菌菌株#30和#51进行处理时，甘油三酯的积累增加，并且脂滴没有彼此结合，其尺寸较小。因此，发现选择的#30和#51是预期具有抑制3T3-L1细胞成熟为白色脂肪细胞和增强其转化为棕色脂肪细胞的效果的菌株。

米色脂肪细胞可表达在白色脂肪组织中不表达的UCP1(解偶联蛋白1)基因。已知该基因在白色脂肪细胞中的表达表明已经发生从白色脂肪细胞向米色脂肪细胞或棕色脂肪细胞的转分化，并且细胞的转分化根据进食或外部环境可逆地发生。因此，在本实验中，研究了所选菌株培养基对米色脂肪细胞和褐色脂肪细胞特异性基因表达的影响。

研究了乳酸菌培养基对小鼠褐色脂肪细胞和米色脂肪细胞特异性基因表达的影响。如图3A所示，在用#30乳酸菌培养基处理的3T3-L1脂肪细胞中，被称为褐色脂肪细胞特异性基因的解偶联蛋白1(UCP1)基因和与产热相关的基因的表达显著增加。识别出其他褐色脂肪细胞特异性基因，即Pgc1a(过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1-α)和Prdm16(PR/SET结构域16)的表达增加。此外，已经发现，对于一般的脂肪细胞分化重要的过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Pparg)的表达增加了。经鉴定，用乳酸菌培养基#51处理没有显着增加褐色脂肪细胞特异性基因的表达，但增加了Prdm16基因的表达。

此外，为了再次验证乳酸菌培养基的效果，当用菌株培养基处理作为小鼠间充质干细胞的C3H10T1/2细胞时，鉴定了产热相关和褐色脂肪细胞相关基因Ucp1、Pgc1a和Prdm16的表达水平。根据该鉴定结果，确认了用本公开的乳酸菌#30和#51的培养基进行的处理提高了褐色脂肪细胞特异性基因的表达水平(图3B)。

然后，我们鉴定了#30对白色脂肪细胞向米色脂肪细胞转分化的作用。因此，特征性地鉴定了在用乳酸菌培养基#30处理的3T3-L1脂肪细胞中，几种米色脂肪细胞特异性标志物，如成纤维细胞生长因子21(Fgf21)、Tbx1、P2RX5、CD137、细胞色素c氧化酶亚单位II(Cox2)的表达显著增加。另外，确认了在用#51培养基处理的细胞中，作为对米色脂肪细胞表达重要的基因的CD137和Fgf21的表达显著增加(图4A)。

此外，为了再次证实所选的乳酸菌菌株或培养基的效果，将菌株培养基应用于小鼠C3H10T1/2间充质干细胞。然后，鉴定了米色脂肪细胞特异性基因Fgf21、P2RX5、CD137和Tbx1(T-box 1)的表达水平。结果表明，在用本发明的乳酸菌培养基#30和#51处理的细胞中，米色脂肪细胞特异性基因的表达水平增加(图4B)。

为了进一步鉴定根据本公开的乳酸菌培养基的效果，将乳酸菌培养基应用于3T3-L1细胞，然后鉴定与脂解作用相关的基因Atgl、HSL、Plin1、Plin5的表达水平。鉴定了与脂质的β氧化相关的基因LCAD、MCAD、LCPT和Abhd5基因的表达水平。

结果，在根据本发明公开内容用乳酸菌培养基#30和#51处理的3T3-L1细胞中，Atgl、HSL、Plin1、Plin5基因和LCAD、MCAD、LCPT和Abhd5基因的表达水平比对照高。(图5A和图5B)。因此，可以确定，通过诱导能够分解脂肪或氧化脂质成分的作用，该处理具有抑制脂肪积累和体重增加的效果。

此外，将根据本发明的乳酸菌培养基应用于3T3-L1细胞，然后测量PKA信号传导的激活。通过Western印迹鉴定磷酸化PKA是否增加(图6A)。然后，用10mM H89作为PKA抑制剂处理细胞(图6B)。然后，重新鉴定磷酸化的PKA。因此，已经确定用本发明的乳酸菌培养基#30和#51处理细胞具有基于磷酸化PKA的增加而激活PKA信号转导过程的作用。用PKA抑制剂H89处理细胞后，鉴定产热相关基因Ucp1和Pgc1a基因(图6中的C)的表达水平的变化。因此，再次证实用H89处理降低了Ucp1和Pgc1a基因的表达水平。因此，再次证实本发明的乳酸菌培养基通过PKA激活，诱导产热相关基因表达水平的增加。此外，使用si-PKA cat a1鉴定产热相关基因、脂肪细胞分化相关基因的表达和这些蛋白质表达水平的变化。因此，鉴定到Ucp1、Pgc1a、Pparg和Ceba基因的表达受到抑制，而Ucp1、Pparg和Pgc1a蛋白的量也降低。因此，再次确定本发明的乳酸菌培养基通过PKA激活诱导产热相关基因表达水平增加(图6中的D至F)。

此外，已经确定，当本发明的乳酸菌#30和#51应用于3T3-L1细胞时，作为转录调节因子的脂解酶、AMPK磷酸化和CREB磷酸化增加。本发明的效果再次基于上述脂解酶和CREB磷酸化的抑制是由H89作为PKA抑制剂处理引起的结果而确定(参见图7)。

在测试期间，在所有组中都没有观察到一般异常症状。然而，与正常组相比，用高脂肪饮食喂养的小鼠的体重显著增加34.0％。特别是，在菌株培养基#30施用组(G5)和菌株细胞#51施用组(G8)中，与阴性对照(G2)相比，体重平均分别降低10.8％和5.7％。平均重量损失发生在两个实验组中(图8)。此外，基于分析每种脂肪细胞组织的H&E病理(面积测量)的结果，鉴定了与阴性对照(G2)相比，在G5和G8组中的性腺脂肪减少(分别减少19.6％、18.9％)、腹膜脂肪减少(分别减少21.2％、22.4％)、肠系膜脂肪减少(分别减少33.9％、24.4％)和白色脂肪组织减少(减少26.2％、23.4％)(图9)。因此，鉴定到本发明的菌株#30和#51或其培养基具有减少脂肪积累的作用。

此外，基于进行生化分析的结果，确定在G5和G8组中，总胆固醇和LDL的水平与阴性对照相比显著降低(图10)。因此，可以确认，对动物给与本发明的菌株和培养基两者，都具有降低胆固醇和LDL成分的效果。基于鉴定与产热或脂解酶相关的基因，即Ucp1、Pgc1、1a和Prdm16在每种脂肪组织中的表达水平的结果，鉴定到在施用本发明的菌株或培养基的组中，其在小鼠的四种脂肪组织中的表达水平显著增加(图11)。

此外，鉴定了根据本公开的乳酸菌菌株或培养基对施用菌株或培养基的小鼠组中白色脂肪组织的炎症相关巨噬细胞极化的影响。我们鉴定了促炎M1巨噬细胞标志物CD11c、CD68、IL-1B、Mcp1和TNF-a基因(图12A)和抗炎M2巨噬细胞标志物Arg1和CD206基因(图12B)的表达水平的变化。已确定在肥胖状态的受试者的脂肪细胞中，炎症反应得到促进，发生从M2巨噬细胞向M1巨噬细胞的转化，诱导巨噬细胞极性的变化。因此，我们证实根据本公开的乳酸菌菌株或培养基具有抑制或改善肥胖的效果。结果，在给予本发明乳酸菌菌株或培养基的小鼠中，M1巨噬细胞标志物基因的表达水平降低，M2巨噬细胞标志物基因的表达水平增加。因此，确定了本发明的菌株#30和#51或其培养基具有抑制或改善肥胖的作用。

作为第一次筛选的结果，选择了具有优异的抗肥胖活性的两种菌株(#30和#51)。根据其16S rRNA基因分析(SEQ ID No:1和2)的结果，鉴定这两个菌株分别为长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum spp.longum)和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)。这两个菌株分别命名为长双歧杆菌DS0956(16S rRNA与长双歧杆菌JCM 1217T的同源性99.86％)和鼠李糖乳杆菌DS0508(与鼠李糖乳杆菌JCM 1136T的同源性100％)。然后，这两个菌株以专利方式分别以保藏号KCTC13505BP和KCTC13504BP保藏。根据其基因组分析结果，发现长双歧杆菌DS0956和鼠李糖乳杆菌DS0508在其一个染色体上分别具有2.43Mbp和3.01Mbp的基因组大小，并且没有质粒。

以上仅参照所述实施例详细描述了本公开。然而，对于本领域技术人员显而易见的是，在根据本公开的技术思想的范围内，其各种修改和变化是可能的。这些修改和变化落入所附权利要求书内。

【保藏号】

保藏机构名称：韩国生命工学研究院

登录号：KCTC13505 BP

保藏日期：2018年3月26日

保藏机构名称：韩国生命工学研究院

登录号：KCTC13504 BP

保藏日期：2018年3月26日

<110> 韩国生命工学研究院（Korea Research Institute of Bioscience andBiotechnology）

顺天乡大学校产学协力团（Soonchunhyang University Industry AcademyCooperation Foundation）

<120> 具有肥胖预防或治疗效果的新的长双歧杆菌菌株或鼠李糖乳杆菌菌株及其用途

<130> 2019OPA2513

<150> KR 10-2018-0041917

<151> 2018-04-11

<160> 22

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 1448

<212> DNA

<213> 长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）

<400> 1

gatgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac gggatccatc aggctttgct 60

tggtggtgag agtggcgaac gggtgagtaa tgcgtgaccg acctgcccca tacaccggaa 120

tagctcctgg aaacgggtgg taatgccgga tgctccagtt gatcgcatgg tcttctggga 180

aagctttcgc ggtatgggat ggggtcgcgt cctatcagct tgacggcggg gtaacggccc 240

accgtggctt cgacgggtag ccggcctgag agggcgaccg gccacattgg gactgagata 300

cggcccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggc gcaagcctga 360

tgcagcgacg ccgcgtgagg gatggaggcc ttcgggttgt aaacctcttt tatcggggag 420

caagcgagag tgagtttacc cgttgaataa gcaccggcta actacgtgcc agcagccgcg 480

gtaatacgta gggtgcaagc gttatccgga attattgggc gtaaagggct cgtaggcggt 540

tcgtcgcgtc cggtgtgaaa gtccatcgct taacggtgga tccgcgccgg gtacgggcgg 600

gcttgagtgc ggtaggggag actggaattc ccggtgtaac ggtggaatgt gtagatatcg 660

ggaagaacac caatggcgaa ggcaggtctc tgggccgtta ctgacgctga ggagcgaaag 720

cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacgg tggatgctgg 780

atgtggggcc cgttccacgg gttccgtgtc ggagctaacg cgttaagcat cccgcctggg 840

gagtacggcc gcaaggctaa aactcaaaga aattgacggg ggcccgcaca agcggcggag 900

catgcggatt aattcgatgc aacgcgaaga accttacctg ggcttgacat gttcccgacg 960

gtcgtagaga tacggcttcc cttcggggcg ggttcacagg tggtgcatgg tcgtcgtcag 1020

ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caaccctcgc cccgtgttgc 1080

cagcggatta tgccgggaac tcacggggga ccgccggggt taactcggag gaaggtgggg 1140

atgacgtcag atcatcatgc cccttacgtc cagggcttca cgcatgctac aatggccggt 1200

acaacgggat gcgacgcggc gacgcggagc ggatccctga aaaccggtct cagttcggat 1260

cgcagtctgc aactcgactg cgtgaaggcg gagtcgctag taatcgcgaa tcagcaacgt 1320

cgcggtgaat gcgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt caagtcatga aagtgggcag 1380

cacccgaagc cggtggccta accccttgtg ggatggagcc gtctaaggtg aggctcgtga 1440

ttgggact 1448

<210> 2

<211> 1491

<212> DNA

<213> 鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）

<400> 2

atgaacgctg gcggcgtgcc taatacatgc aagtcgaacg agttctgatt attgaaaggt 60

gcttgcatct tgatttaatt ttgaacgagt ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc 120

tgcccttaag tgggggataa catttggaaa cagatgctaa taccgcataa atccaagaac 180

cgcatggttc ttggctgaaa gatggcgtaa gctatcgctt ttggatggac ccgcggcgta 240

ttagctagtt ggtgaggtaa cggctcacca aggcaatgat acgtagccga actgagaggt 300

tgatcggcca cattgggact gagacacggc ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga 360

atcttccaca atggacgcaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgagtgaag aaggctttcg 420

ggtcgtaaaa ctctgttgtt ggagaagaat ggtcggcaga gtaactgttg tcggcgtgac 480

ggtatccaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg 540

gcaagcgtta tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggttttt taagtctgat 600

gtgaaagccc tcggcttaac cgaggaagtg catcggaaac tgggaaactt gagtgcagaa 660

gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg aaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt 720

ggcgaaggcg gctgtctggt ctgtaactga cgctgaggct cgaaagcatg ggtagcgaac 780

aggattagat accctggtag tccatgccgt aaacgatgaa tgctaggtgt tggagggttt 840

ccgcccttca gtgccgcagc taacgcatta agcattccgc ctggggagta cgaccgcaag 900

gttgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 960

gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatctttt gatcacctga gagatcaggt 1020

ttccccttcg ggggcaaaat gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 1080

tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttatgact agttgccagc atttagttgg 1140

gcactctagt aagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc 1200

atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga tggtacaacg agttgcgaga 1260

ccgcgaggtc aagctaatct cttaaagcca ttctcagttc ggactgtagg ctgcaactcg 1320

cctacacgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagca cgccgcggtg aatacgttcc 1380

cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgagagtttg taacacccga agccggtggc 1440

gtaacccttt tagggagcga gccgtctaag gtgggacaaa tgattagggt g 1491

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 27F 引物

<400> 3

agagtttgat cmtggctca 19

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1492R 引物

<400> 4

tacggytacc ttgttacgac tt 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ucp1 正向引物

<400> 5

ggcattcaga ggcaaatcag ct 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ucp1 反向引物

<400> 6

caatgaacac tgccacacct c 21

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pgc1a 正向引物

<400> 7

acagctttct gggtggatt 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pgc1a 反向引物

<400> 8

tgaggaccgc tagcaagttt 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Prdm16 正向引物

<400> 9

cagcacggtg aagccattc 19

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Prdm16 反向引物

<400> 10

gcgtgcatcc gcttgtg 17

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Tbx1 正向引物

<400> 11

ggcaggcaga cgaatgttc 19

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Tbx1 反向引物

<400> 12

ttgtcatcta cgggcacaaa g 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Fgf21 正向引物

<400> 13

agatcaggga ggatggaaca 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Fgf21 反向引物

<400> 14

tcaaagtgag gcgatccata 20

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD137 正向引物

<400> 15

cgtgcagaac tcctgtgata ac 22

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD137 反向引物

<400> 16

gtccacctat gctggagaag g 21

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Cox2 正向引物

<400> 17

gactgggcca tggagtgg 18

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Cox2 反向引物

<400> 18

cacctctcca ccaatgacc 19

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P2RX5 正向引物

<400> 19

ctgcagctca ccatcctgt 19

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P2RX5 反向引物

<400> 20

cactctgcag ggaagtgtca 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Gapdh 正向引物

<400> 21

gacatgccgc ctggagaaac 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Gapdh 反向引物

<400> 22

agcccaggat gccctttagt 20