碱性磷酸酶酶标缓冲液和碱性磷酸酶酶标试剂

技术领域

本发明涉及酶标试剂技术领域，特别涉及一种碱性磷酸酶酶标缓冲液和碱性磷酸酶酶标试剂。

背景技术

目前，通常采用化学发光酶免疫分析方法检测蛋白质(比如B型尿钠肽，BNP)的浓度，化学发光酶免疫分析法是将具有高灵敏度的酶催化化学发光技术与高特异性的抗原抗体反应相结合，用于定量检测各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素、和药物等。该技术具有特异性高、灵敏度高、分离简便快速、可自动化分析等优点。其中，所使用到的酶主要是碱性磷酸酶，碱性磷酸酶在使用过程中往往会出现以下缺陷：AP酶标记抗体后形成的酶标抗体复合物因标记工艺的复杂，复合物稳定的缓冲pH往往跟它的标记所需的pH范围有所不同，造成了酶标记物的稳定性出现问题，不但降低了产品有效期，而且在使用过程中需频繁定标，增加了成本和未知风险。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种碱性磷酸酶酶标缓冲液和碱性磷酸酶酶标试剂，旨在提高碱性磷酸酶酶标试剂的稳定性。

为实现上述目的，本发明提出的碱性磷酸酶酶标缓冲液，包括基础液和稳定剂，所述稳定剂为甘氨酸、海藻糖、甘油中的至少一种。

可选的实施例中，按照重量百分比计，所述稳定剂包括1％-10％甘氨酸、1％-10％海藻糖及5％-20％甘油。

可选的实施例中，所述基础液包括Tris-HCl、NaCl、BSA、Proclin300、镁离子及锌离子。

可选的实施例中，所述基础液包括20mmol/L-150mmol/L Tris-HCl、50mmol/L-200mmol/L NaCl、质量浓度为0.5％-5％的BSA，0.5g/L-1.5g/L Proclin 300、0.1mmol/L-5mmol/L MgCl

可选的实施例中，按重量百分比计，所述稳定剂的用量范围为所述碱性磷酸酶酶标缓冲液的1％至40％。

本发明还提出了一种碱性磷酸酶酶标试剂，其特征在于，包括酶标抗体和碱性磷酸酶酶标缓冲液，所述碱性磷酸酶酶标缓冲液包括基础液和稳定剂，所述稳定剂为甘氨酸、海藻糖、甘油中的至少一种。

可选的实施例中，所述酶标抗体与所述碱性磷酸酶酶标缓冲液的体积比范围为1:500至1:5000。

可选的实施例中，所述碱性磷酸酶酶标试剂于2℃-8℃的温度下保存。

本发明的技术方案，在碱性磷酸酶酶标缓冲液中加入稳定剂，稳定剂选用甘氨酸、海藻糖、甘油中的至少一种。在采用碱性磷酸酶酶标缓冲液稀释酶标抗体时，可以有效地保护酶标抗体，从而延长了碱性磷酸酶酶标工作液的有效期。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1为对比例和实施例1至3稳定性测试结果对比示意图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。

本发明提出一种碱性磷酸酶酶标缓冲液，应用于碱性磷酸酶酶标试剂，用于检测蛋白质的浓度。在使用时，将酶标抗体与碱性磷酸酶酶标缓冲液混合，便可得到碱性磷酸酶酶标试剂。

本发明碱性磷酸酶酶标缓冲液包括基础液和稳定剂，稳定剂为甘氨酸、海藻糖、甘油中的至少一种。

甘氨酸是一种含有氨基和羧基的两性离子，具有很强的缓冲性，可以与基础液形成一个缓冲系统，维持缓冲液在一个相对稳定的pH范围内，从而使得酶标抗体始终处于一个稳定的pH范围内，从而保持酶标抗体的生物活性。

海藻糖是由两个葡萄糖分子组成的非还原性双糖，对热和酸碱具有很好的稳定性，能有效的保护生物分子结构不被破坏。同时，海藻糖作为一种多元醇化合物，既可以通过氢键与酶蛋白表面分子相结合，也可以通过氢键与外部的水分子连接，从而影响酶蛋白的水合作用来稳定和激活蛋白，并能阻止酶发生不可逆的热凝聚-热变形。

甘油，又称丙三醇，是一种液态饱和多元醇化合物，常作为酶、抗体、蛋白等的保护剂；也可作为细菌等的保护剂，添加终浓度为10-20％甘油，细菌可以在-20℃保存数月之久并保持生物活性。甘油对蛋白具有较明显的保护作用，且是一种非特异性保护。甘油不仅可以提高蛋白质的热稳定性还可以提高蛋白质在含有变性剂环境中的稳定性。

需要说明的是，稳定剂可选用甘氨酸、海藻糖、甘油中的一种或多种混合物，在此不做限定，均在本发明的保护范围之内。

本发明的技术方案，在碱性磷酸酶酶标缓冲液中加入稳定剂，稳定剂选用甘氨酸、海藻糖、甘油中的至少一种。在采用碱性磷酸酶酶标缓冲液稀释酶标抗体时，可以有效地保护酶标抗体，从而延长了碱性磷酸酶酶标缓冲液的有效期。

可选的实施例中，按照重量百分比计，稳定剂包括1％-10％甘氨酸、1％-10％海藻糖及5％-20％甘油。

在配制稳定剂时，要合理调配各组分的用量，以使得其组分能够充分有效发挥其作用。

可选地，甘氨酸的添加重量百分比范围为1％-10％，比如甘氨酸的添加重量百分比为1％、3％、5％、7％或10％。倘若甘氨酸的添加重量百分比低于1％时，与基础液形成的缓冲系统缓冲能力较弱；由于试剂都是低温(2℃-8℃)贮藏和运输，甘氨酸浓度大于10％时，容易结晶析出，破坏缓冲液组成，也会在仪器取液时堵塞试剂针。

可选地，海藻糖的添加重量百分比范围为1％-10％，比如海藻糖的添加重量百分比为1％、3％、5％、7％或10％。倘若海藻糖的添加重量百分比低于1％时，对酶标抗体的保护作用较弱。

可选地，甘油的添加重量百分比范围为5％-20％，比如甘油的添加重量百分比为5％、7％、10％、12％、15％、18％或20％。倘若甘油的添加重量百分比过低(小于5％)，则对酶标抗体的保护效果较弱；若其添加重量百分比过高(大于20％)，则会增加试剂的黏稠度，不利于仪器在自动加样时对试剂准确的量取。

可选实施例中，基础液包括Tris-HCl、NaCl、BSA、Proclin 300、镁离子及锌离子。

Tris-HCl是一种缓冲液，其中文名称为三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐，其在pH为7-9时具有很强的缓冲能力，对很多酶的反应是惰性的，能够很好的维持反应体系的相对稳定且不影响抗体及酶的活性。

需要说明的是，稳定剂中的甘氨酸是可以与Tris-HCl形成一个缓冲系统，维持缓冲液在一个相对稳定的pH范围内，从而使得酶标抗体始终处于一个稳定的pH范围内，进而保持其生物活性。

NaCl是一种中性盐，一方面，在水溶液中可以增加蛋白质表面的电荷，增加蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大；另一方面，氯化钠因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点。

BSA是一种惰性蛋白，加入BSA可以增加缓冲液中蛋白浓度，对缓冲液中含量相对较少的酶标抗体与酶复合物起到一个保护作用。同时，BSA也可以防止抗体与酶的分解和非特异性吸附，保证检测结果的准确性；另外，BSA还可以有效地减轻不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性的。

Proclin 300是一种高效的体外诊断抑菌剂，具有广泛的抑制微生物(细菌、真菌)生长的效果。它可替代传统的防腐剂，如硫柳汞(含汞有机物)、叠氮钠(易燃易爆剧毒品)、庆大霉素(抗生素)等，在推荐浓度下使用无危害，废弃物安全。

镁离子是碱性磷酸酶位点的特异性效应分子，它与酶中有关基团配位，稳定了酶活性部位的构像。锌离子是碱性磷酸酶活性中心成份。

在本发明的一实施例中，基础液包括20mmol/L-150mmol/L Tris-HCl、50mmol/L-200mmol/L NaCl、质量浓度为0.5％-5％的BSA，0.5g/L-1.5g/L Proclin 300、0.1mmol/L-5mmol/L MgCl

在配制基础液时，要合理调配各组分的用量，使其充分有效发挥其作用。其中，Tris-HCl的摩尔浓度范围为20mmol/L-150mmol/L，比如，Tris-HCl的摩尔浓度范围为20mmol/L、50mmol/L、75mmol/L、100mmol/L、120mmol/L或150mmol/L。

NaCl的摩尔浓度也要选用适宜，若其浓度过高时，蛋白质会随盐浓度的的升高其溶解度会下降并析出，从而影响蛋白质的活性。可选地，NaCl的摩尔浓度范围为50mmol/L-200mmol/L，比如，NaCl的摩尔浓度为50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L或200mmol/L。选用该浓度范围的NaCl，可以增加蛋白质的表面电荷从而增强蛋白质的水合作用，从而保持蛋白质在水溶液中的相对稳定，但又不至于过高，使蛋白质从水溶液中析出。

BSA的质量浓度也要选用适宜，可选地，其质量浓度范围为0.5％-5％，比如BSA的质量浓度为0.5％、1.0％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％或5％。若其浓度过低时(<0.5％)，对抗体酶复合物的保护作用相对较弱；若其浓度过高时(>5％)，会对抗体酶复合物起到一个封闭作用，影响抗体酶复合物与抗原的结合，会导致检测结果相对偏低。

可选地，Proclin 300的浓度范围为0.5g/L-1.5g/L，比如Proclin 300的浓度为0.5g/L、1.0g/L或1.5g/L。选用该浓度范围的Proclin 300，使用无危害，废弃物较为安全。

可选地，MgCl

可选地，ZnCl

为了充分发挥稳定剂的效果，从而保证碱性磷酸酶酶标缓冲液具有较好的稳定性，要合理调配稳定剂的用量。可选的实施例中，按重量百分比计，稳定剂的用量范围为碱性磷酸酶酶标缓冲液的1％至40％，比如，稳定剂的用量范围为碱性磷酸酶酶标缓冲液的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％。

本发明还提出了一种碱性磷酸酶酶标试剂，包括酶标抗体和如前所述的碱性磷酸酶酶标缓冲液。在使用时，将酶标抗体与碱性磷酸酶酶标缓冲液混合均匀，便可得到碱性磷酸酶酶标试剂。

可选的实施例中，酶标抗体与碱性磷酸酶酶标缓冲液的体积比范围为1:500至1:5000，比如酶标抗体与碱性磷酸酶酶标缓冲液的体积比范围为1:500、1:1000、1:2000、1:3000、1:4000或1:5000。

配制好碱性磷酸酶酶标试剂后，碱性磷酸酶酶标试剂于2℃-8℃的温度下保存，备用。

下面通过具体实施例对本发明碱性磷酸酶酶标缓冲液和碱性磷酸酶酶标试剂进行详细说明。

实施例1

本实施例中，按照重量份计，碱性磷酸酶酶标缓冲液包括：5份甘油、2份海藻糖、1份甘氨酸，基础液补足至100份，其中基础液包括20mmol/L-150mmol/L Tris-HCl、50mmol/L-200mmol/L NaCl、质量浓度为0.5％-5％的BSA，0.5g/L-1.5g/L Proclin 300、0.1mmol/L-5mmol/L MgCl

使用时，将酶标抗体与上述配方的碱性磷酸酶酶标缓冲液按体积比为1:5000进行混合，搅拌使其混合均匀，便可得到碱性磷酸酶酶标试剂工作液，并于2℃-8℃的温度下保存，备用。

实施例2

本实施例中，按照重量份计，碱性磷酸酶酶标缓冲液包括：10份甘油、1份海藻糖、2份甘氨酸，基础液补足至100份，其中基础液包括20mmol/L-150mmol/L Tris-HCl、50mmol/L-200mmol/L NaCl、质量浓度为0.5％-5％的BSA，0.5g/L-1.5g/L Proclin 300、0.1mmol/L-5mmol/L MgCl

使用时，将酶标抗体与上述配方的碱性磷酸酶酶标缓冲液按体积比为1:5000进行混合，搅拌使其混合均匀，便可得到碱性磷酸酶酶标试剂工作液，并于2℃-8℃的温度下保存，备用。

实施例3

本实施例中，按照重量份计，碱性磷酸酶酶标缓冲液包括：5份甘油、2份海藻糖、2份甘氨酸，基础液补足至100份，其中基础液包括20mmol/L-150mmol/L Tris-HCl、50mmol/L-200mmol/L NaCl、质量浓度为0.5％-5％的BSA，0.5g/L-1.5g/L Proclin 300、0.1mmol/L-5mmol/L MgCl

使用时，将酶标抗体与上述配方的碱性磷酸酶酶标缓冲液按体积比为1:5000进行混合，搅拌使其混合均匀，便可得到碱性磷酸酶酶标试剂工作液，并于2℃-8℃的温度下保存，备用。

对比例

将酶标抗体与基础缓冲液按体积比1：5000进行混匀，得到对比例的碱性磷酸酶酶标试剂。其中，基础液包括20mmol/L-150mmol/L Tris-HCl、50mmol/L-200mmol/L NaCl、质量浓度为0.5％-5％的BSA，0.5g/L-1.5g/L Proclin 300、0.1mmol/L-5mmol/L MgCl2及1mmol/L-5mmol/L ZnCl2。

取实施例1至3配制的碱性磷酸酶酶标试剂分别进行稳定性测试，即

将其置于37℃恒温箱中一段时间，然后分别在第0天、第7天和第10天的时候检测校准品的信号值。同时，在同样的条件下，对对比例的碱性磷酸酶酶标试剂进行稳定性测试。其测试结果数据见表1和图1所示。

从表1和图1可以看出，本发明实施例1至3中添加甘氨酸、海藻糖、甘油稳定剂后，37℃加速7天和10天，对比例不添加稳定剂，37℃加速7天和10天；分别和他们37℃加速0天的对比，添加稳定剂的偏差明显小于不添加稳定剂的；且37℃加速0天时，对比例、实施例1、实施例2和实施例3的发光值基本一致。结果表明，甘氨酸、海藻糖、甘油稳定剂可以明显的改善BNP酶标抗体37℃加速条件下的稳定性，且稳定剂的添加对酶标抗体检测的发光值无影响。因此，本发明通过在碱性磷酸酶酶标缓冲液中添加一定剂量的甘氨酸、海藻糖、甘油作为稳定剂，可以显著地提高37℃热加速下酶标抗体在酶标缓冲液稳定性。

表1对比例和实施例1至3稳定性测试数据

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。