一种适用于葡萄果实及胚珠的RNA原位杂交方法

技术领域

本发明属于园艺植物分子生物学技术领域，具体涉及一种适用于葡萄果实及胚珠的RNA原位杂交方法。

背景技术

RNA原位杂交(RNA in situ hybridization)是根据核酸分子碱基互补配对原则，将体外合成的带有标记的单链反义RNA同组织或细胞内的靶标RNA发生杂交，将反义RNA探针定位到待测基因表达区域。探针上所带标记可分为两种，即非放射性的地高辛(DIG)和生物素(BIO)或带有放射性的同位素(

目前，RNA原位杂交在拟南芥、玉米、烟草、水稻、黄瓜等中都有应用，但在葡萄上的应用较少，且其种子木质化程度较重，目前还没有一种针对于葡萄果实及种子原位杂交的方法，因此有必要提出改进。

发明内容

本发明解决的技术问题：提供一种适用于葡萄果实及胚珠的RNA原位杂交方法，本发明用于检测葡萄种子发育过程中目的基因表达，便于从分子水平来探讨葡萄发育过程相关基因的表达及调节机制，将看不见的信号转变为可见信号，直观地反映目的基因在发育过程中的时空表达情况和表达发育模式，便于用于分析目的基因在相应的组织或器官形成中的作用。

本发明采用的技术方案：一种适用于葡萄果实及胚珠的RNA原位杂交方法，包括以下步骤：

步骤一、探针的制备；

步骤二、样品的准备；

(1)采样前的处理：从同一品种葡萄植株上挑选长势相同的花穗，在开花前2-3天的上午，去除已经开放的花蕾和花穗顶端的花蕾，重复2-3次，之后进行套袋，防止外来花粉的污染，确保果实发育进程相同；

(2)样品取材与固定：选取花后1-10天的葡萄果实直接投入预冷的固定液；选取花后10-20天的葡萄果实置于冰上将胚珠剥离，立即将胚珠投入预冷的固定液；选取花后20天之后的葡萄果实置于冰上将胚珠剥离，将胚珠延种脊纵切后立即投入固定液；抽真空处理，将样品内部的空气抽出，便于固定液快速渗入样品内部。存放于4℃冰箱中；

(3)软化：取出已经固定好的花后20天之后的葡萄果实，用50％的乙醇冲洗，之后投入软化剂中进行软化处理，抽真空处理3-5次，每次20min，直到样本材料完全下沉，然后放于4℃冰箱中；

(4)脱水：在4℃冰箱的摇床，将样品材料依次经过由RNase free的水和8.5％NaCl溶液配置而成的乙醇梯度进行脱水；

(5)透明：在室温摇床进行，将样品材料依次经二甲苯:乙醇体积比为1:3、1:1、3:1、1:0、1:0、1:0的溶液，每步2h，进行透明处理；

(6)浸蜡：将材料转入烧杯内，加入适量体积的二甲苯，1/4体积的固体石蜡屑，室温静置过夜。同时在60℃烘箱，提前溶解固体石蜡。第二天将样品材料转移到42℃烘箱，使未溶解的固体石蜡碎屑逐渐溶解，并逐步放入碎石蜡屑，直至饱和；倒掉二甲苯与石蜡混合物，加入制备好的溶解的纯液体石蜡，再将样品材料转移至60℃烘箱，连续5天早上和晚上更换新鲜的液体石蜡，使石蜡充盈组织内部；

(7)包埋：将溶解的纯液体石蜡倒入包埋模具，将样品材料放入包埋模具中并摆正位置，用60℃烘箱溶解好的纯石蜡对样品进行包埋，待石蜡表面凝固后，将其迅速浸入冰水混合物中，加速石蜡凝固，待石蜡完全凝固后，将得到的样品放于-20℃冰箱进行保存；

(8)修蜡：取出包埋好的蜡块，修去样品边缘多余的石蜡；

(9)切片：用石蜡切片机将样品切成5-10μm连续的蜡带，刀片切成合适的长度，筛选出组织结构完整的蜡带，在37℃含有RNase free的ddH

步骤三、预杂交：将石蜡切片经过二甲苯溶液进行脱蜡；经过酒精梯度复水处理，以及去蛋白处理、RNA再固定、乙酰化作用，最后脱水处理后，即可进行杂交实验；

步骤四、杂交：将探针杂交液涂抹到切片上，密封放于50℃烘箱中，探针与组织或细胞内部靶标的RNA杂交，结合成稳定的双链RNA，杂交时间为14-16h；

步骤五、杂交后处理：将杂交后的样品材料依次经过SSC溶液、NTE溶液以及含RNAse A的NTE溶液、TBS溶液、罗氏封闭液、TBST溶液处理，之后经过抗体孵育、NBT/BCIP显色液显色处理。

步骤六、检测：将显色的切片放于显微镜下镜检，观察拍照。

上述步骤二(2)中，所述固定液采用FAA固定液；所述抽真空处理参数为：0.06-0.08MPa、时间25-30min、重复3-4次，直至所有样品材料下沉。

上述步骤二(3)中，所述软化剂组份为甘油:乙醇＝1:1。

上述步骤二(4)中，所述乙醇梯度依次为50％乙醇+0.85％NaCl、时间2h；70％乙醇+0.85％NaCl、过夜；85％乙醇+0.85％NaCl、时间2h；95％乙醇、时间2h；100％乙醇、时间2h；100％乙醇、时间1h、室温；100％乙醇、时间1h、室温。

上述步骤三中，

所述脱蜡复水处理过程：将样品依次经过100％二甲苯15min；100％二甲苯15min；50％二甲苯与50％乙醇10min；无水乙醇2min；无水乙醇2min；95％乙醇、85％乙醇+0.85％NaCl、70％乙醇+0.85％NaCl、50％乙醇+0.85％NaCl、30％乙醇+0.85％NaCl，每级各30s；0.85％NaCl 2min；1×PBS 2min；

所述去蛋白处理：将样品经过蛋白酶K溶液、37℃、30min，暴露靶标核酸片段，增加探针与靶核酸的结合率，最大化杂交信号而不破坏细胞结构；经过0.2％甘氨酸的PBS溶液，2min，封阻蛋白酶活性，终止蛋白酶K的消化作用；经1×PBS溶液，2min；

所述再固定处理：将样品依次经过4％多聚甲醛的PBS溶液，10min，摇床上进行，重新固定细胞内的RNA；1×PBS溶液，2min；1×PBS溶液，2min；

所述乙酰化：将样品依次经过乙酸酐溶液pH 8，10min，摇床上进行，乙酰化作用，导致探针非特异性结合的带正电荷的探针被乙酰化，降低非特异性杂交；1×PBS溶液，2min；1×PBS溶液，2min；

所述脱水处理：将样品依次经过0.85％NaCl 2min；30％乙醇+0.85％NaCl、50％乙醇+0.85％NaCl、70％乙醇+0.85％NaCl、85％乙醇+0.85％NaCl、95％乙醇，每级各30s；100％乙醇，2min；100％乙醇，2min；之后将样品存放于4℃干燥的玻璃缸内1-2h，待酒精挥发完全，即可进行下面的杂交实验。

上述步骤四中，所述探针杂交液的制取方法：按照斑点杂交的结果用50％的去离子甲酰胺溶液稀释探针；将稀释过的探针在80℃的水浴锅条件下变性2min，之后立即置于冰上冷却；配置杂交液，将变性后的探针与杂交液混合，体积比为1:4，其总用量以能覆盖所有样本为标准，轻轻混匀即可得到探针杂交液。

本发明与现有技术相比的优点：

本方案是一种针对葡萄幼果及胚珠的RNA原位杂交方法，用于检测葡萄种子发育过程中目的基因表达，便于从分子水平来探讨葡萄发育过程中相关基因的表达及其调节机制，将看不见的信号转变为可见，直观地反映目的基因在组织器官发育的时空表达情况和表达发育模式，用于分析目的基因在相应的组织或器官形成中的作用，此方法有很高的敏感性和特异性，具有安全、快速、长期保存的优点。

附图说明

图1为本发明实施例中的载体图谱；

图2为本发明实施例中基因克隆过程电泳图一；

图3为本发明实施例中基因克隆过程电泳图二；

图4为本发明实施例中测序结果序列比对图一；

图5为本发明实施例中测序结果序列比对图二；

图6为本发明实施例中转录模板的制备过程单酶切电泳检测结果图；

图7为本发明实施例中合成探针电泳图；

图8为本发明实施例中合成探针水解之后电泳图；

图9为本发明实施例中斑点杂交示意图；

图10为本发明实施例中石蜡切片观察示意图；

图11为本发明实施例中原位杂交结果示意图一；

图12为本发明实施例中原位杂交结果示意图二；

图13为本发明原位杂交简化流程图。

具体实施方式

请参阅图1-13，详述本发明的实施例。

本实施例中，对序列表的说明如下：

SEQUENCE ID NO1:是本发明实施例VvTAU基因3’UTR区域序列。

基因序列：

SEQUENCE ID NO1：

ATTTTCATGGAGTTTTTCAGCAGATAAAATACAAATACCTGCGCTACATTTCCTCGTCTCCCTTCTGTTCCATTTATTTTTTTTCCTCTCATTTTCATGAAAATTATGCCTTGATTACGTTAAATTGATGCCAATTTCACTCTACTAATTGTATCTACGAAGGCCCTAGACCCATCATGTTTTTGCCTTTTCATTCAATGTTCATTCTACATAGAATTTTAGCCTATGAATTGTGTAAGAAATGAGTATGTGCAATAATAAGATGAGATGTGAATGCTGTACA

SEQUENCE ID NO2:是本发明实施例扩增片段的正向引物序列。

SEQUENCE ID NO3:是本发明实施例扩增片段的反向引物序列。

引物序列：

SEQUENCE ID NO2：ATTTTCATGGAGTTTTTCAGCAGAT；

SEQUENCE ID NO3：TGTACAGCATTCACATCTCATCTTA。

下面通过具体实施例对本发明的方法进行详细阐述，但本发明的实施方式并不局限于此。

下述实施例中所述的试验方法，如无特殊说明，均可按照常规条件操作。所用试剂或仪器，如无特殊说明，均可通过市场购买所得。所采用溶液均为高压高温灭菌之后的去离子水配置。

一种适用于葡萄果实及胚珠的RNA原位杂交方法，如图13所示，包括以下步骤：

步骤一、探针的制备；

1、转录模板的制备

选择感兴趣基因的特异性区域，如5’或3’UTR区域，或者选择基因CDS区域特异性较高的序列。将基因序列与该物种的基因组序列进行比对，排除高度重复的序列，选出相似度低的序列。但是与保守蛋白结构域相对应的序列，如转录因子中的DNA结合结构域，通常会产生基因特异性表达模式。通常基因片段大小为200-500bp的长度最合适。根据基因序列设计合适的引物。利用无核白和红地球的DNA为模板，利用PCR扩增仪进行扩增。克隆反应体系：1ul上游引物，1ul下游引物，1ul模板，10ul mix，7ul ddH2O。克隆PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s(35个循环)；72℃延伸10min。将PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，并在紫外光下迅速切下目的条带，利用天根的琼脂糖凝胶回收试剂盒进行目的片段胶回收。将回收产物与TaKaRa公司的pGEM-T easy载体进行4℃过夜连接，并利用热激法转入DH5-α感受态细胞，在含有100mg/L的氨苄霉素的LB板子上进行蓝白斑筛选。挑取蓝斑周围的白斑进行摇菌培养，经菌液PCR初步鉴定筛选出阳性克隆，挑选2个送公司利用T7引物进行测序，并确定连接方向。将测序结果进行比对分析，挑出比对结果正确的菌液进行大摇，37℃200rpm过夜培养，提取质粒DNA。

具体，如图1所示的载体图谱。

如图2所示的分别用红地球和无核白的DNA克隆为模板，克隆VvTau基因的3’UTR区域基因。其中，泳道1-5，无核白DNA为模板进行克隆的电泳结果图；泳道7，为Marker 5000；泳道9-13为红地球DNA为模板进行克隆的电泳结果图。

如图3所示，克隆片段连pGEM-T Easy载体，菌液PCR鉴定，其中，泳道1-5，无核白DNA为模板克隆片段连T载体的菌液PCR电泳结果图；泳道7，Marker 5000；泳道9-13为红地球DNA为模板克隆片段连T载体菌液PCR的电泳结果图。

如图4所示以红地球材料为模板克隆，RG-[T7]:T7引物进行序列的测序；RG-[SP6]:SP6为引物进行序列测序的测序比对结果图。

如图5所示以无核白材料为模板克隆，TS-[T7]:T7引物进行序列测序；RG-[SP6]:SP6为引物进行序列测序的测序比对结果图。

2、转录模板线性化

用载体上合适的多克隆位点的限制性内切酶进行酶切。限制性内切酶切断后必须为5’突出或平末端，采用3’末端突出的限制性内切酶，其产生的末端可能导致非特异性RNA聚合酶启动。若实在只能用3’突出的限制性内切酶，则可在酶切后用T4 DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段在4中dNTP存在下消除3’突出端。模板中不存在所选择的酶切位点，载体上也应只有一个此酶切位点。可用的限制性内切酶只有NcoⅠ、SpeⅠ、Nde I。用购自TAKARA公司的限制性酶NcoⅠ和SpeⅠ对质粒DNA分别进行单酶切，酶切体系分别为:SpeⅠ1ul，10×M Buffer 2ul，DNA 1ug，补充ddH2O至20ul；NcoⅠ1ul，10×K buffer 2ul，0.1％BSA2ul，DNA 1ug，补充ddH2O至20ul.反应条件:37℃2h，65℃20min.电泳检测酶切是否完全，若完全可多做几份酶切，将产物合并到一起，进行PCR溶液回收，最后用DEPC-H

如图6所示为质粒单酶切结果电泳图所示，其中：泳道1：Marker2000；泳道2：质粒；泳道2-3：NcoⅠ酶切电泳；泳道4-5：SpeⅠ酶切电泳。

3、体外转录反应

以酶切后回收的DNA产物为模板，分别在SP6和T7RNA聚合酶的作用下合成反义和正义探针，参照罗氏DIG RNA Labeling Kit(SP6/T7)试剂盒说明书。

反应体系：DNA模板1ug，10×NTP labeling mi×ture 2ul，10×Transcriptionbuffer 2ul，Protector RNase inhibitor 1ul，T7或SP6 RNA聚合酶2ul，加DEPC-H2O补充至20ul。冰上操作，轻柔混匀，离心。37℃反应2h。反应结束，预留1ul的反应产物，标记去DNA之前产物，进行琼脂糖凝胶电泳。加2ul RNase-free DNase I，37℃反应20min，去除DNA模板。在此过程中可用0.2M NaOH浸泡电泳槽以及制胶所用梳子等，以去除RNase，大约浸泡20min左右。其中，0.2M NaOH试剂：40g NaOH，加双蒸水溶解，定容至100ml；不需要高温高压灭菌。

可再将反应延长10min，以确保DNA去除完全。在确保没有DNA之后将溶液转移至1.5mlRNase free的管子中，并加入4ul，0.2M EDTA终止反应。

4、探针收集

加入71ul的DEPC-H2O，再加入等体积(95ul)的4M NH

其中，4M NH

5、探针水解(可选)

加入100ul的DEPC-H

如图7所示为探针合成电泳图示，其中Tau探针合成：泳道1：合成的未水解的正义探针(T7)；泳道2：合成的未水解的反义探针(SP6)。如图8所示为合成探针水解之后电泳图，其中，泳道1：合成的水解的正义探针(T7)；泳道2：合成的水解的反义探针(SP6)。

上述中，2×carbonate buffer：探针水解缓冲液，现用现配，试剂配方为：32ul 1MNaHCO

10％冰醋酸：10ul冰醋酸加90ul DEPC-H

3M NaOAc：pH 5.2，12.3g NaOAc(或40.8g NaOAc·3H

6、探针半定量(斑点杂交)

将探针用RNA稀释缓冲液(DEPC-H

对照：

自己合成的探针：

将2、3、4、5、6、7与a、b、c、d、e、f各取1ul点于尼龙膜上，紫外交联处理20min。

将尼龙膜放入50ml离心管，点样面朝内，加入25ml缓冲液，①TBS溶液中孵育5min，②封闭缓冲液中孵育30min，③TBST溶液中孵育15min，④含1/3000抗体的TBST溶液中90min，⑤TBST溶液中孵育15min，⑥TBST溶液中孵育15min，⑦TBST溶液中孵育15min，⑧缓冲液C中孵育5min，⑨黑暗下NBT/BCIP显色液染色3-4h。其中①②③⑤⑥⑦⑧⑨此步在摇床上进行。比较对照探针和自己合成的探针稀释梯度的斑点染色程度，以估计自己合成的探针的浓度，确定杂交时探针的稀释倍数。

如图9所示的斑点杂交示意图，其中，第一行为未标记的对照RNA探针；第二行为标记的对照RNA探针，第三行为Tau-T7正义探针，第四行为Tau-SP6反义探针。

上述中20×SSC配方：NaCl 87.5g；Na

步骤二、样品的准备；

(1)采样前的处理：从2棵同一品种长势相同、生长旺盛的葡萄植株上分别挑选4个长势相同的花穗，在开花前2-3天的上午，去除已经开放的花蕾和花穗顶端的花蕾，重复2-3次，之后进行套袋，防止外来花粉的污染，确保果实发育进程相同。

(2)样品取材与固定：带无粉乳胶手套，从花后5天开始采样，分别从每穗的上中下部位随机采取若干果粒，装于密封袋内，放入冰盒中，立即带回实验室。具体的，选取花后1-10天的葡萄果实直接投入预冷的固定液(盛花后1-10天葡萄胚珠较小，无法与果肉分离，因此前期的果实采摘后置于冰上，用解剖刀将果实纵切，直接投于预冷的FAA固定液内)；选取花后10-20天的葡萄果实立即放于冰上，用解剖刀将胚珠剥离，避免碰伤，之后立即投入预冷的固定液中；选取花后20天之后的葡萄果实，立即置于冰上，用解剖刀将胚珠剥离，为使固定液快速的渗入样本材料内部，可将种子延种脊纵切后立即投入固定液。为使固定液能够渗入样本材料内部，所有样品均需进行抽真空处理，将样品内部的空气抽出。之后存放于4℃冰箱中。

上述固定液采用FAA固定液，配方：50％乙醇，5％冰醋酸，3.7％甲醛。

所述抽真空处理参数为：0.06-0.08MPa、时间25-30min、重复3-4次，直至所有样品材料下沉。

(3)软化：对于固定好的花后20天之后的种子，由于种皮木质化严重，影响切片后组织结构完整性，进而影响杂交效果，因此须经软化剂处理。处理过程：取出已经固定好的花后20天之后的葡萄果实，用50％的乙醇冲洗3-4处，之后投入软化剂中进行软化处理，软化剂组份为甘油:乙醇＝1:1，再抽真空处理3-5次，每次20min，直到材料完全下沉，然后放于4℃冰箱中。具体时间以材料能否被解剖刀基本无阻切断来判断。

(4)脱水：在4℃冰箱的摇床，将样品材料依次经过由RNase free水和8.5％NaCl溶液配置而成的乙醇梯度进行脱水。所述乙醇梯度依次为50％乙醇+0.85％NaCl、时间2h；70％乙醇+0.85％NaCl、过夜；85％乙醇+0.85％NaCl、时间2h；95％乙醇、时间2h；100％乙醇、时间2h；100％乙醇、时间1h、室温；100％乙醇、时间1h、室温。

其中，8.5g NaCl溶液配方：8.5g NaCl，加双蒸水溶解并定容至100ml，高温高压灭菌，室温保存。

70％乙醇：35ml无水乙醇，加15mlDEPC-H

(5)透明：在室温摇床进行，将样品材料依次经二甲苯:乙醇体积比为1:3、1:1、3:1、1:0、1:0、1:0的溶液，每步2h，进行透明处理。

(6)浸蜡：将材料转入烧杯内，加入适量体积的二甲苯，1/4体积的固体石蜡屑，室温静置过夜。同时在60℃烘箱，提前溶解固体石蜡。第二天将样品材料转移到42℃烘箱，使未溶解的固体石蜡碎屑逐渐溶解，并逐步放入碎石蜡屑，直至饱和；倒掉二甲苯与石蜡混合物，加入制备好的溶解的纯液体石蜡，再将样品材料转移至60℃烘箱，连续5天早上和晚上更换新鲜的液体石蜡，使石蜡充盈组织内部。

(7)包埋：将溶解的纯液体石蜡倒入包埋模具，用烘箱中加热的镊子(镊子温度不可过高，否则影响组织结构)将样品材料放入包埋模具中，避免样品材料周围出现气泡，并摆正位置，使石蜡与样品充分接触，融为一体，该过程操作要迅速。用60℃烘箱溶解好的纯石蜡对组织进行包埋，待石蜡表面凝固后，将其迅速浸入冰水混合物中，加速石蜡凝固，待石蜡完全凝固后，将得到的样品放于-20℃冰箱进行保存。

(8)修蜡：准备酒精灯，组培刀，将锡箔纸铺在桌子上，取出包埋好的蜡块，酒精灯加热刀片，切去样品周围多余的石蜡，越接近样品越好，但不可切到样品。

(9)切片：在Leica HistoCore BIOCUT石蜡切片机上装好刀片，打开摊片机和烤片机，并将温度调节成37℃。用70％酒精喷洒桌面及切片机、摊片机、烤片机，去除表面的RNase。向摊片机内倒入不含RNase的ddH

步骤三、预杂交：用显微镜挑选出样片组织结构完整的载玻片，置于金属的玻片架上，放入体积大约500ml体积含400ml溶液的玻璃缸中。将石蜡切片经过二甲苯溶液进行脱蜡；经过酒精梯度复水处理，以及去蛋白处理、组织RNA再固定、乙酰化作用，最后脱水处理后，即可进行杂交实验。

其中，1、脱蜡复水处理过程：将样品依次经过100％二甲苯15min；100％二甲苯15min；50％二甲苯与50％乙醇10min；无水乙醇2min；无水乙醇2min；95％乙醇、85％乙醇+0.85％NaCl、70％乙醇+0.85％NaCl、50％乙醇+0.85％NaCl、30％乙醇+0.85％NaCl，每级各30s；0.85％NaCl 2min；1×PBS 2min；其中，1×PBS：NaCl 76g；Na

2、去蛋白处理：将切片经蛋白酶K溶液、37℃、30min，暴露靶标核酸片段，增加探针与靶核酸的结合率，最大化杂交信号而不破坏细胞结构；经过0.2％甘氨酸的PBS溶液，2min，封阻蛋白酶活性，终止蛋白酶K的消化作用；经1×PBS溶液，2min。

其中，蛋白酶K溶液：37℃烘箱溶解，1M Tris-HCl(pH 8.0)50ml；0.5M EDTA(pH8.0)50ml；Protein K(10mg/ml)50ul，至终浓度1ug/ml；DEPC-H

0.2％甘氨酸溶液：0.8g甘氨酸溶于400ml 1×PBS溶液。

3、再固定处理：将样品依次经过4％多聚甲醛的PBS溶液，10min，摇床上进行，重新固定组织内的RNA；1×PBS溶液，2min；1×PBS溶液，2min。

其中，4％多聚甲醛：16g多聚甲醛，加入400ml 1×PBS，加热至溶解，冰上冷却。

4、乙酰化：将样品依次经过乙酸酐溶液pH 8，10min，摇床上进行，乙酰化作用，导致探针非特异性结合的带正电荷的探针被乙酰化，降低非特异性杂交；1×PBS溶液，2min；1×PBS溶液，2min。

其中，乙酸酐溶液：7.428g三乙醇胺盐酸盐，400ml DEPC-H

5、脱水处理：将样品依次经过0.85％NaCl 2min；30％乙醇+0.85％NaCl、50％乙醇+0.85％NaCl、70％乙醇+0.85％NaCl、85％乙醇+0.85％NaCl、95％乙醇，每级各30s；100％乙醇，2min；100％乙醇，2min；将样品存放于4℃干燥的玻璃缸内1-2h，待酒精挥发完全，即可进行下面的杂交实验。

步骤四、杂交：

所述探针杂交液的制取方法：所需探针浓度为0.5ng/ul/kb，每张玻片所需探针量：0.5ng×120μl×0.15kb＝9ng。按照斑点杂交的结果用50％的去离子甲酰胺溶液稀释探针；调节金属浴温度到80℃，将稀释过的探针在80℃的水浴锅条件下变性2min，之后立即置于冰上冷却。

配置杂交液：10×salts 10ul；100％甲酰胺40ul；50％dextranslfate20ul；50×denhardt’s 2ul；100mg/ml tRNA 1ul；DEPC-H

计算所需杂交液的量，每张玻片大约需要150μl含探针的杂交液，将变性后的探针与杂交液混合，体积比为1:4，其总用量以能覆盖所有组织样本为标准，轻轻混匀即可得到探针杂交液。

吸取探针杂交液涂抹到组织上，用枪头轻轻推开，盖上盖玻片，尽量避免气泡(影响杂交质量)，放在用2×SSC/50％甲酰胺浸湿的高压灭菌的滤纸湿盒中，杂交过程中要保持湿度，适量增加2×SSC/50％甲酰胺的用量，用保鲜膜、锡箔纸密封放于50℃烘箱中，探针与组织内部的RNA杂交，杂交时间为14-16h。

上述中，tRNA:100mg/ml，分装，储存于-20℃冰箱。

5M NaCl：29.25g NaCl，加双蒸水定容至100ml，高温高压灭菌，室温保存。

步骤五、杂交后处理：

将杂交后的组织样品材料依次经过SSC溶液、NTE溶液以及含RNAse A的NTE溶液、TBS溶液、罗氏封闭液、TBST溶液处理，之后经过抗体孵育、NBT/BCIP显色液显色处理。

具体的，准备2L 0.2×SSC溶液，在55℃烘箱中预热，去掉包裹湿盒的保鲜膜及锡箔纸，取出杂交后的玻片，在预热过的0.2×SSC溶液中洗去残留的杂交液，置于铁架上依次经过以下溶液：55℃0.2×SSC溶液，2次，每次1h；37℃1×NTE，2次，每次5min；37℃含RNAseA的NTE，20min；37℃1×NTE，2次，每次5min；55℃0.2×SSC，1h；1×TBS溶液，5min；罗氏封闭液，45min，置于摇床上进行；TBST溶液，45min，摇床上进行；含1/1250抗体的TBST溶液涂于组织的玻片上，避光保湿室温孵育2h；TBST溶液，4次，每次15min，摇床上进行；Buffer C缓冲液，5min；NBT/BCIP显色液涂于样品组织上，避光显色1-2天。

上述中，Buffer C缓冲液：1M Tris-HCl(pH 9.5)50ml；2M MgCl212.5ml；5M NaCl10ml；加DEPC-H

罗氏封闭液：(1％Blocking buffer)：1g blocking reagent，加入100ml1×TBS溶液，新鲜配置，60℃烘箱中搅拌助溶化。

1×NTE：NaCl 146g；1M Tris-HCl(pH 8.0)50ml；0.5M EDTA 50ml；加双蒸水定容至1L，高温高压灭菌。其中，0.5M EDTA：pH 8.0，18.61g Na

1M Tris-HCl：pH 7.5，pH 8.0，pH 9.5，分别配置三份60.57g Tris-Base，加双蒸水搅拌溶解，用浓盐酸调节PH至7.5、8.0、9.5，定容至500ml，室温保存。

1×TBS：Tris-Base 11.8g；Tris-HCl 63.5g；NaCl 43.83g；调节pH7.5，加DEPC-H2O定容至500ml。

步骤六、检测：将显色的组织切片放于显微镜下镜检，观察拍照。如图10所示的石蜡切片观察示意图。如图11和12所示的原位杂交结果示意图，其中图11为VvTau基因在无核白胚珠组织内RNA与T7反义探针的杂交结果图和SP6-正义探针杂交结果对照图，图12为VvTau基因在红地球胚珠组织内RNA的T7反义探针杂交结果图和SP6-正义探针杂交结果对照图。

显色期间不定时镜检，观察显色程度，防止染色时间过长了，增加信号背景强度。显色达到染色预期效果后，TE缓冲液冲洗玻片，终止显色反应，置于显微镜下观察，拍照。如需要长期保存结果，乙醇梯度脱水，中性树脂封片。

本发明是一种针对葡萄幼果及胚珠的RNA原位杂交方法，用于检测葡萄种子发育过程中目的基因表达，便于从分子水平来探讨葡萄发育过程中目的基因的表达及其调节机制，将看不见的信号转变为可见，直观地反映目的基因在组织器官发育的时空表达情况和表达发育模式，可用于分析目的基因在相应的组织或器官形成中的作用，此方法有很高的敏感性和特异性，具有安全、快速、长期保存的优点。

上述实施例，只是本发明的较佳实施例，并非用来限制本发明实施范围，故凡以本发明权利要求所述内容所做的等效变化，均应包括在本发明权利要求范围之内。