植物乳杆菌在缓解肠炎的功能性食品的应用及功能性食品

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种植物乳杆菌在缓解肠炎的功能性食品的应用及功能性食品。

背景技术

结肠炎(Inflammatory bowel disease，IBD)与宿主遗传因素和环境因素息息相关，肠道菌群变化也会影响IBD的易感性。其中，肠道微生物组成改变、异常的免疫反应和弱化的肠粘膜屏障，会导致宿主与微生物之间作用异常而加速肠道炎症反应。

随着近年来结肠炎发病率和死亡率不断上升，结肠炎已成为严重威胁人类生命健康的一类恶性疾病，被世界卫生组织列为现代难治疗病症之一。其常见临床表现为体重下降、腹泻、血便，有癌变的倾向，反复性强。研究证明，目前用于治疗结肠炎的药物主要有氨基水杨酸、糖皮质激素以及免疫调节剂等，药价高，且副作用不可控。

发明内容

本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种植物乳杆菌在缓解肠炎的功能性食品的应用及功能性食品。

本发明提供了植物乳杆菌在缓解肠炎的功能性食品的应用，具有这样的特征，其中，植物乳杆菌为具有bsh1基因和/或bsh3基因的植物乳杆菌。

在本发明提供的植物乳杆菌在缓解肠炎的功能性食品的应用中，还可以具有这样的特征：其中，植物乳杆菌为植物乳杆菌AR113。

在本发明提供的植物乳杆菌在缓解肠炎的功能性食品的应用，还具有这样的特征：肠炎为DSS诱导的肠炎。

本发明提供了一种功能性食品，具有这样的特征，包括：植物乳杆菌，其中，植物乳杆菌为具有bsh1基因和/或bsh3基因的植物乳杆菌。

在本发明提供的功能性食品中，还具有这样的特征：其中，功能性食品为酸奶、干酪、酒酿、泡菜、酱油、食醋、豆豉或乳腐中的任意一种。

发明的作用与效果

根据本发明所涉及的一种植物乳杆菌在缓解肠炎的功能性食品的应用及功能性食品，本发明涉及的植物乳杆菌为具有bsh1基因和/或bsh3基因的植物乳杆菌，因为本发明提供的具有bsh1基因和/或bsh3基因的植物乳杆菌可以有效缓解DSS诱导的肠炎，所以为研究bsh基因对植物乳杆菌AR113的特定益生功能的影响奠定良好的理论基础。

附图说明

图1是本发明的实施例中动物实验分组方案图；

图2是本发明的实施例中结肠炎小鼠的理化指标图；

图3是本发明的实施例中小鼠结肠HE染色图；

图4是本发明的实施例中小鼠结肠组织损伤评分图；

图5是本发明的实施例中小鼠结肠炎症因子的转录水平图；以及

图6是本发明的实施例中小鼠肠道屏障功能基因的表达图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下结合实施例及附图对本发明作具体阐述。

下述实施例中菌株及质粒来源如表1所示。

表1本实验使用的菌株及质粒

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)AR113菌株已于2017年03月22日保藏于中国普通微生物保藏中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其编号为CGMCCNo.13909。

L.plantarum AR113Δbsh 1、L.plantarum AR113Δbsh 2、L.plantarum AR113Δbsh 3、L.plantarum AR113Δbsh 4、L.plantarum AR113Δbsh 13、L.plantarum AR113Δbsh 132、L.plantarum AR113Δbsh 134的构建方法如下：

在CRISPR/Cas9编辑质粒pHSP01的基础上进行改造，分别以植物乳杆菌AR113基因组为模板，使用相应引物进行PCR扩增，获得BSH1up、BSH1down和BSH1 gRNA，然后使用FXKOD酶将三者进行Overlap PCR，割胶回收获得BSH1up-down-gRNA片段(BSH 2、BSH 3和BSH4的操作同上)，再与经ApaI和XbaI酶切回收的pHSP01载体进行无缝克隆，连接产物转化至大肠Top 10感受态细胞，涂布于相应抗性的平板。长出的单菌落用引物Plcp11yz-F和Plcp11yz-R进行验证，获得的正确质粒命名依次命名为pLdbsh1、pLdbsh2、pLdbsh3和pLdbsh4。将重组质粒pLdbsh1、pLdbsh2、pLdbsh3和pLdbsh4分别电转于AR113(pLH01)感受态，抗性平板筛选阳性克隆子，经PCR验证后进行测序，获得正确的单基因敲除型菌株命名为L.plantarumAR113Δbsh 1(简称Δbsh 1)，L.plantarum AR113Δbsh 2(简称Δbsh 2)，L.plantarumAR113Δbsh 3(简称Δbsh 3)，L.plantarum AR113Δbsh 4(简称Δbsh 4)；多基因敲除型菌株命名为L.plantarumAR113Δbsh 13(简称Δbsh 13)，L.plantarum AR113Δbsh 132(简称Δbsh 132)，L.plantarumAR113Δbsh 134(简称Δbsh 134)。

质粒pLdbsh1、pLdbsh2、pLdbsh3和pLdbsh4的引物序列如下：

下述实施例中的实验动物为小鼠，具体来源如下：

实验所用小鼠为6周龄雄性SPF级C57BL/6小鼠，体重18～20g，购自南京模式动物有限公司。每笼饲养8只小鼠，在恒温23±2℃，湿度50±5％、暗/光周期为12h的环境下，自由饮食，适应一周后进行实验。

下述实施例中的试剂和设备来源如表2所示。

表2主要实验试剂和设备

<实施例>

1.结肠炎模型建立及分组给药

小鼠自由饮用2.5％DSS溶液7天，每两天换一次DSS溶液，构建急性溃疡性肠炎模型小鼠。

图1是本实施例的动物实验分组方案图。

如图1所示，将88只小鼠均分为11组，正常对照组(Conrtol)：自由饮食；模型组(DSS)：自由饮用2.5％DSS溶液，于第5天后开始连续灌胃200μL无菌水7天；阳性药物组(DSS+5-ASA)：自由饮用2.5％DSS溶液，于第5天后开始连续灌胃200μL 5-ASA溶液7天；(DSS+AR113)组：自由饮用2.5％DSS溶液，于第5天后开始连续灌胃200μL浓度为5×10

2.以图1中动物实验分组方案图中的11组小鼠为研究对象，进行实验，具体步骤如下：

步骤1，测量小鼠的体重，测定体重变化图；

实验结果如图2A所示。

根据图2A可知，对照组在实验期间体重相对稳定。在2.5％DSS诱导的前4天，各组体重略有上升。第4天后，经DSS诱导的各组小鼠体重呈现下降趋势，摄食量和饮水量降低，粪便变软，出现稀便甚至便血。第7天，除对照组外，各组体重约下降了10％，停止DSS诱导后，各组体重仍持续下降，在第9天，DSS组体重下降至最低，为85±1.5％。与DSS组相比，5-ASA及益生菌组于第8或9天开始体重出现不同程度的回升，肠炎症状慢慢减轻。其中，第12天时，AR113组小鼠体重恢复的最好，为97±1.3％，其次为5-ASA、Δbsh 4和Δbsh 2组，体重分别为96±1.0％、95±0.8％和94.6±1.1％，体重恢复最差的为Δbsh 132和Δbsh134，为89±2.9％和88.7±0.6％。

步骤2，以步骤1中的小鼠体重变化、粪便硬度及便血情况之和，测定小鼠的疾病活动指数(DAI)并绘制图像；

实验结果如图2B所示。

根据图2B可知，正常对照组的DAI值保持在0左右，表明小鼠体重未出现下降，粪便硬度和性状稳定，无稀便及便血现象。经DSS处理的各组小鼠，DAI值持续上升，尤其是DSS组，在第8天DAI达到最高值，为10.21±1.5，然后开始呈下降趋势。与DSS组相比，益生菌组在第7天停止DSS诱导后，DAI值便开始出现下降，表明益生菌可能通过维护肠道菌群稳定或调节相关炎症因子的表达从而发挥了缓解肠炎症状的作用。在第8～12天，DSS处理过的各组DAI值持续下降，表明停止DSS诱导后，小鼠自身免疫调节发挥作用，伴随着体重回升，稀便及便血现象发生改善。与DSS组相比，益生菌组DAI值下降的更多，表明小鼠恢复的较好。其中，在第12天，与DSS组相比，AR113组DAI值下降的最显著(4.20±0.40vs.7.12±0.26,p<0.05)，而Δbsh 1、Δbsh 13和Δbsh 134组DAI下降的不显著(6.28±0.26vs.7.12±0.26，6.00±0.17vs.7.12±0.26，6.03±0.17vs.7.12±0.26，p>0.05)。以上表明了bsh 1和bsh3基因对于AR113调节DAI值具有重要作用。

步骤3，小鼠解剖后取整段结肠，测量盲肠末端至肛门的长度，并绘制图像；

实验结果如图2C所示。

根据图2C可知，与对照组相比，DSS组的结肠长度显著降低(5.90±0.53vs.6.82±0.31cm，p<0.05)，而5-ASA的治疗使结肠长度恢复至正常水平(6.63±0.31cm)。灌胃AR113和Δbsh 2菌株可显著改善结肠长度，分别为7.1±0.18和6.88±0.19cm。而敲除bsh 1基因、bsh 3基因的Δbsh 3、Δbsh 13、Δbsh 132和Δbsh 134菌株可能因BSH活性降低而无法有效缓解结肠缩短现象。

步骤4，小鼠解剖后，取近端约1cm长度的结肠组织，对其准确称重，按1:19的重量体积比加入生理盐水，用研磨仪制备成5％的组织匀浆，然后根据MPO试剂盒说明书测定各组小鼠结肠组织MPO活性，并绘制图像；

实验结果如图2D所示。

根据图2D可知，正常对照组的MPO活性为0.85±0.04U/g，而DSS组的MPO活性显著提高至1.24±0.04U/g，说明DSS诱导使中性粒的细胞数量显著增加，结肠组织结构遭到严重破坏。而5-ASA、AR113、Δbsh 2和Δbsh 4可以有效降低小鼠结肠组织中的MPO活性，分别为0.93±0.04、0.82±0.03、0.93±0.02和0.91±0.043U/g(p<0.05)。而敲除bsh 1、bsh3因的Δbsh 1、Δbsh 3、Δbsh 13、Δbsh 132和Δbsh 134组表现出下调MPO活性的趋势，可能因BSH(胆盐水解酶)活性降低而对MPO的调节无显著作用(p>0.05)。

步骤5，取小鼠结肠远端约1cm长度的结肠组织，固定在4％多聚甲醛固定溶液中，用石蜡包埋、切片、经过HE染色后置于显微镜下镜检并绘制图像；

实验结果如图3-4所示。

根据图3-4可知，对照组小鼠肠上皮结构和隐窝完整，富含杯状细胞，绒毛紧密而整齐的排列，没有炎症性细胞浸润或粘膜损坏，而完整的肠上皮结构是维持肠道内稳态的基础，可以有效抵御外源微生物的入侵。DSS具有细胞毒性，诱导小鼠后，DSS组则表现出明显的炎症现象，即结肠粘膜中出现炎症性细胞浸润、粘膜水肿、隐窝出现损坏及严重的上皮结构破坏，结肠组织损伤评分高达14.45±0.65。相比之下，5-ASA、AR113、Δbsh 2和Δbsh4的治疗可以有效缓解DSS造成的结肠粘膜损伤，使大部分肠上皮细胞保持完整，其组织学评分分别为4.23±0.40、4.86±0.34、5.67±0.87、5.34±0.38和5.78±0.90(p<0.05)。然而，灌胃Δbsh 1、Δbsh 3、Δbsh 13、Δbsh 132和Δbsh 134菌株对肠道组织损伤表现出一定的修复作用，但结肠组织还是呈现出细胞浸润(图3G)、肠上皮组织受损(图3E和3J)及隐窝消失(图3I和3K)。由此分析，bsh 1和bsh 3基因对缓解DSS导致的组织损伤和保护肠道上皮细胞的完整性具有重要作用。

步骤6，通过反转录-荧光量(RT-qPCR)的方法对bsh对结肠组织炎症因子的影响进行测定，并绘制图像；

实验结果如图5所示。

根据图5可知，与对照组相比，DSS组小鼠结肠组织中TNF-α的mRNA水平显著增加(2.28±0.30vs.1.52±0.35，p<0.01)，而AR113可有效的将TNF-α表达量降低至正常水平(1.60±0.44vs.1.52±0.35，p>0.05)。而除Δbsh 134外，5-ASA、Δbsh 1、Δbsh 2、Δbsh3、Δbsh 4、Δbsh 13和Δbsh 132也可显著降低小鼠结肠组织TNF-α的水平(p<0.05)，但与AR113相比，作用效果还存在显著性差异(p>0.05)。如图5B所示，与对照组相比，DSS组小鼠结肠组织中的IL-1β水平显著增高(3.01±0.03vs.0.97±0.02，p<0.01)，阳性对照组5-ASA、AR113、Δbsh 2、Δbsh 3和Δbsh 4表现出较好的抑制IL-1β水平升高的能力(p<0.001)。而敲除了bsh 1基因的Δbsh 1、Δbsh 13、Δbsh 132和Δbsh 134菌株也降低了IL-1β基因的表达量，但无显著性差异(p>0.05)。如图5C所示，与对照组相比，DSS组IL-6的基因表达量显著增加，为4.16±0.17。而5-ASA、AR113、Δbsh 2和Δbsh4菌株可显著降低IL-6基因的表达量(p<0.05)，而菌株Δbsh 1、Δbsh 3、Δbsh 13、Δbsh 132和Δbsh 134对IL-6水平的降低作用并不显著(p>0.05)。如图5D所示，与对照组相比，DSS处理组小鼠结肠组织中的IL-10的mRNA水平显著下降(0.42±0.05vs.1.11±0.12，p<0.05)，而阳性药物组5-ASA和植物乳杆菌AR113、Δbsh 2、Δbsh 3和Δbsh 4菌株可显著增加IL-10基因的表达量，分别为3.21±0.15、3.46±0.30、2.37±0.34、1.27±0.09和2.68±0.15。而Δbsh 1、Δbsh 13、Δbsh 132和Δbsh 134也表现出提高IL-10的mRNA水平的趋势，但无显著性差异(p>0.05)。

以上结果证实，DSS通过显著增加促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达和降低抑炎细胞因子IL-10的水平来诱发小鼠肠道组织炎症、增加肠道通透性，而bsh 1基因和bsh3基因的存在可能通过有效维持菌株的BSH活性来显著调整促炎细胞因子和抑炎细胞因子的表达量，有效地降低肠道结肠组织中的炎症水平和缓解肠上皮结构的损伤，在调节肠道免疫、缓解DSS肠炎症状中发挥了重要作用。

步骤7，通过RT-qPCR方法对各组小鼠结肠组织的ZO-1、Claudin、Occuldin及MUC2的表达水平进行测定，并绘制图像；

实验结果如图6所示。

ZO-1表达水平的测试结果如图6A。由图6A可知，DSS组显著降低了紧密连接蛋白ZO-1的表达，导致肠道屏障受损。与DSS组相比，阳性对照组5-ASA和植物乳杆菌AR113和Δbsh 4可有效提高ZO-1的mRNA水平(1.37±0.15，1.59±0.13，1.23±0.17vs.0.60±0.22，p<0.01)，而Δbsh、Δbsh 2、Δbsh 3、Δbsh 13、Δbsh 132和Δbsh134菌株对ZO-1基因的表达无显著作用(p>0.05)。

Claudin表达水平的测试结果如图6B所示。由图6B所示，DSS组的Claudin水平显著降低(p<0.05)，而5-ASA、AR113、Δbsh 2和Δbsh 4可有效抑制Claudin水平的降低(1.24±0.08，1.18±0.03，1.11±0.07，0.89±0.02vs.0.63±0.04，p<0.05)，而Δbsh 1、Δbsh 3、Δbsh 13、Δbsh 132和Δbsh 134菌株对Claudin基因的调节无显著作用(p>0.05)。

Occuldin的表达水平的测试结果如图6C。由图6C可知，与对照组相比，DSS组显著下调了小鼠结肠组织中Occludin基因的表达(0.58±0.07，p<0.05)。与DSS组相比，5-ASA、AR113和Δbsh 2可有效上调Occludin的mRNA水平(1.35±0.15，1.65±0.04和0.87±0.043，p<0.05)，其它bsh敲除菌株对Occludin水平无显著作用(p>0.05)。

MUC2的表达水平的测试结果如图6D。由图6D可知，与对照组相比，DSS处理后的小鼠结肠组织中MUC2的mRNA水平显著降低至0.34±0.02，而MUC2基因缺失或肠黏液不足以增加肠道通透性，使小鼠患有肠炎。与DSS组相比，阳性对照组5-ASA、植物乳杆菌AR113、Δbsh2、Δbsh 3和Δbsh4可显著上调MUC2基因的表达，这有助于提高结肠黏液的浓度，增强肠道菌群与肠上皮的接触，并保持防御素和免疫球蛋白的浓度等。但Δbsh 1、Δbsh 13、Δbsh132和Δbsh134菌株对MUC2的mRNA水平无显著影响(p>0.05)。可以得出bsh 1基因可能通过提高结肠黏液细胞合成黏蛋白MUC2来增强黏膜屏障的保护作用，从而缓解DSS作用导致肠道黏膜层的破坏。

实施例的作用与效果

根据本实施例所涉及的一种植物乳杆菌在缓解肠炎的功能性食品的应用及功能性食品，本实施例涉及的植物乳杆菌为具有bsh1基因和/或bsh3基因的植物乳杆菌，因为本实施例提供的具有bsh1基因和/或bsh3基因的植物乳杆菌可以有效缓解DSS诱导的肠炎，所以为研究bsh基因对植物乳杆菌AR113的特定益生功能的影响奠定良好的理论基础。

上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海理工大学

<120> 植物乳杆菌在缓解肠炎的功能性食品的应用及功能性食品

<130> SHLG20100P

<141> 2020-12-25

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gctacggatc acatcttttt ctaaactagg gccctgccta caagacggtc ta 52

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

attttcgagg aggattacta gttaagccac tactgtaata g 41

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ttaactatta cagtagtggc ttaactagta atcctcctcg 40

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ggcaccgagt cggtgctttt tttgattgat atcgatggca c 41

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

aaaaaaagca ccgactcgg 19

<210> 6

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

catactatga tatattctag actgccactc tctgtctgca tgttttagag ctag 54

<210> 7

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

cggatcacat ctttttctaa actagggccc taatggggcc gccattgcga tt 52

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

ctaataaagg agcgatttgt gactttcaga aaagcagtaa ctc 43

<210> 9

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

actgcttttc tgaaagtcac aaatcgctcc tttattagat gataccgg 48

<210> 10

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

tggcaccgag tcggtgcttt ttttatcacg aataacatgg cacc 44

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

aaaaaaagca ccgactcgg 19

<210> 12

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

atggacatac tatgatatat tctagatggt caggacgccg actggggttt tagagctag 59

<210> 13

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

gctacggatc acatcttttt ctaaactagg gcccttgtcc ttgtcagttg c 51

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

taaatcaagg atgtgaaacc cgttggaata tattagggtc 40

<210> 15

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

tgaccctaat atattccaac gggtttcaca tccttga 37

<210> 16

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

accgagtcgg tgcttttttt taactttaag gtcgctg 37

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

aaaaaaagca ccgactcgg 19

<210> 18

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

catactatga tatattctag agtaatcgtc tgatccgcgt agttttagag ctag 54

<210> 19

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

catctttttc taaactaggg cccgattcgg agtgactcac tgg 43

<210> 20

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

caacatcgtg attttttagt tggcgcggcc tccttttaat tag 43

<210> 21

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

ttaaaaggag gccgcgccaa ctaaaaaatc acgatgttga gactg 45

<210> 22

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

gtggcaccga gtcggtgctt tttttcatat caggtgttag agaag 45

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

aaaaaaagca ccgactcgg 19

<210> 24

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

gacatactat gatatattct agaacctggt cggtgcgtcc gttttagagc tag 53

<210> 25

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 25

ctggttgcaa attttgaaaa ccgcta 26

<210> 26

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 26

accgttacat atcaaaggga aaactgtc 28