高效利用麦芽三糖的酿酒酵母和发酵剂及其在发酵谷物饮料及麦芽PYF因子检测中的应用

技术领域

本发明涉及食品加工技术领域，具体涉及一株高效利用麦芽三糖的酿酒酵母，一种发酵剂，一种发酵剂的制备方法和由该方法制备的发酵剂，所述酿酒酵母或所述发酵剂在制备发酵谷物饮料中的应用，一种发酵谷物饮料的制备方法，一种发酵谷物饮料，以及所述酿酒酵母或所述发酵剂在PYF检测中的应用和一种麦芽PYF因子检测方法。

背景技术

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是以出芽繁殖为主的单细胞真核微生物，细胞形态有卵形、长卵形(椭圆形)，于YPD培养基平板上菌落大小为4～5mm，表面光滑凸起，老龄表面呈放射性伞状，质地湿润，颜色呈乳白色。在麦芽汁液体培养基中发酵，表面产生气泡和泡沫，菌体悬浮于培养基中呈混浊状，发酵后期菌体细胞沉积于容器底部，发酵液变得澄清。优良酿酒酵母于25～30℃能发酵葡萄汁产生良好的果香和酒香。其发酵最适pH为4.0～4.5，具有较高的发酵能力，能将糖分发酵完全，并具有较好的凝聚力和快速沉降能力。

能被酵母发酵的糖类称“可发酵性糖”，酿酒酵母的可发酵性糖和发酵顺序为葡萄糖＞果糖＞蔗糖＞麦芽糖＞麦芽三糖。在发酵过程中，5种可发酵性糖的代谢规律及代谢机理各不相同，而啤酒的高效发酵则要求这些糖能被迅速并且彻底利用。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是应用最普遍的啤酒生产菌种，但其利用麦芽三糖的能力差，啤酒发酵过程中麦芽三糖不能被有效利用是成品啤酒残糖含量过高、发酵缓慢的主要原因。

双乙酰是啤酒发酵过程中的重要副产物，是影响啤酒风味的重要物质，同时也是啤酒成熟的限制性指标，缩短啤酒发酵周期的主要影响因素之一是双乙酰。啤酒中的双乙酰主要是由酿酒酵母细胞通过缬氨酸代谢途径产生的α-乙酰乳酸(α-Acetolactate)分泌至细胞外，再经过非酶促的氧化脱羧反应合成。

因此，麦芽三糖被酵母利用速度的快慢和利用率，以及酵母降双乙酰的能力是麦芽汁发酵制备啤酒的“瓶颈”，是发酵能力再提高的关键所在。

酵母提前絮凝(premature yeast flocculation,PYF)现象在啤酒酿造行业普遍存在，至今未有效解决。啤酒发酵过程中酵母发生异常严重(或者提前)的絮凝，导致发酵结束时啤酒存在风味缺陷和不完全发酵。因此预测麦芽PYF对酿造行业来说至关重要。

发明内容

为了实现上述目的，本发明提供了一株高效利用麦芽三糖的酿酒酵母，一种发酵剂，一种发酵剂的制备方法和由该方法制备的发酵剂，所述酿酒酵母或所述发酵剂在制备发酵谷物饮料中的应用，一种发酵谷物饮料的制备方法，一种发酵谷物饮料，以及所述酿酒酵母或所述发酵剂在PYF检测中的应用和一种麦芽PYF因子检测方法。本发明提供的酿酒酵母麦芽三糖利用率高，发酵速度快，是一株发酵度高，降双乙酰能力高，产酒精能力高的啤酒酿酒酵母，对PYF因子敏感，该酿酒酵母菌还能高密度培养，用于制备啤酒发酵剂，使用方便。

因此，本发明第一方面提供一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，该酿酒酵母的保藏号为CGMCC No.20489。

本发明第二方面提供一种发酵剂，所述发酵剂包含如上所述的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

本发明第三方面提供一种发酵剂的制备方法，该方法包括：

(1)将如上所述的酿酒酵母菌在发酵培养基中进行发酵培养，并使活菌数达到10

(2)将步骤(1)得到的液体发酵剂与发酵底物混合，得到半液体发酵剂；

(3)将步骤(2)得到的半液体发酵剂进行固液分离，得到浓缩或压缩发酵剂；

(4)向步骤(3)得到的浓缩或压缩发酵剂中加入冻干保护剂，并调整活菌浓度至10

本发明第四方面提供如上所述的制备方法制备的发酵剂。

本发明第五方面提供如上所述的酿酒酵母或如上所述的发酵剂在发酵谷物饮料中的应用。

本发明第六方面提供一种发酵谷物饮料的制备方法，该方法包括：将如上所述的酿酒酵母或如上所述的发酵剂与发酵底物接触并进行发酵，以制备发酵谷物饮料。

本发明第七方面提供一种由上述制备方法制备的发酵谷物饮料。

本发明第八方面提供如上所述的酿酒酵母或如上所述的发酵剂在麦芽PYF检测中的应用。

通过本发明的技术方案，能够获得如下的有益效果：

1、安全健康、成本低廉：本发明的啤酒酿酒酵母是从山东临沂农户家中留存的老面酵子中筛选出的可用于食品的安全菌株，本发明的方法无化学添加，绿色天然，营养健康；

2、本发明的啤酒酿酒酵母麦芽三糖利用率高，发酵速度快，发酵度高，降双乙酰能力高，产酒精能力高，发酵啤酒风味好。具体的，本发明的酿酒酵母酿造的啤酒残糖量低，麦芽三糖利用率高达88.80％，主发酵时间为5天，4℃储藏6天双乙酰即降至0.05mg/mL，酒精度达到7.00％vol。

3、本发明的啤酒酿酒酵母絮凝性中等，对麦芽PYF因子敏感，检测麦芽PYF因子稳定性高，重复性≤10％，重现性≤10％。

4、本发明的啤酒酿酒酵母CGMCC No.20489作为发酵剂，易于培养和制备，发酵剂酿酒酵母活菌浓度高。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

生物保藏

本发明提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，于2020年8月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.20489，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所(缩写为CGMCC)。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，

图1为本发明酿酒酵母在培养基上的菌落形态；

图2为本发明酿酒酵母的显微形态；

图3为本发明酵母的絮凝性情况。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

第一方面，本发明提供了一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，该酿酒酵母的保藏号为CGMCC No.20489。

所述的酿酒酵母CGMCC No.20489具有下述性质：

(1)形态学特征：所述酵母形状为圆形、卵圆型，直径大小介于1.5-3.0μm；在YPD固体培养基表面生长48个小时后，即能长出直径大小约3.0mm左右的菌落，菌落为有光泽的黄色白色圆点，边缘整齐，质地均匀，易挑取。

(2)糖利用率：糖利用率高，麦芽三糖利用率高达88.80％。

(3)发酵力：发酵速度快，主发酵时间为5天，发酵度高(82.33％)。

(4)降双乙酰能力：降双乙酰速度快，4℃储藏6天双乙酰即降至0.05mg/mL。

(5)风味：啤酒中含有乙酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯和苯乙醇等风味物质成分，赋予啤酒清甜水果等的风味。发酵啤酒清亮透明，口味纯正。

(6)絮凝性：本斯值为0.5cm。

(7)PYF因子敏感性：对PYF因子敏感，对不同PPF值麦芽有区分度。

本发明提供的酿酒酵母CGMCC No.20489的ITS1/ITS4序列如SEQ ID NO:1所示，与NCBI酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的序列比对，相似性达到99.9％。

SEQ ID NO:1：

TTTTGAAAATGGATTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAACAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCC

本发明所述的酿酒酵母CGMCC No.20489是从山东临沂农户家中留存的老面酵子中筛选出的可用于食品的安全菌株。

本发明提供的酿酒酵母经过液体培养能够产生大量酿酒酵母活菌体，所述培养的方法没有特别的要求，只要是能使所述酿酒酵母增殖即可，例如可以按照10

本发明可以进一步分离上述培养液中的酿酒酵母的活菌体，所述分离的方法没有特别的限制，只要是能从培养液中富集菌体即可，例如可以通过离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为公知的条件，本发明在此不再赘述。

第二方面，本发明提供了一种发酵剂，所述发酵剂包含如上所述的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

根据本发明，所述发酵剂的形式可以不受特别的限制，比如可以为液体发酵剂、半液体发酵剂、浓缩发酵剂、压缩发酵剂或固体发酵剂。其中，固体菌剂可以是干燥菌剂，例如，可以为冻干菌剂、喷雾干燥菌剂等。

第三方面，本发明提供了一种发酵剂的制备方法，该方法包括：

(1)将如上所述的酿酒酵母菌在发酵培养基中进行发酵培养，并使活菌数达到10

(2)将步骤(1)得到的液体发酵剂与发酵底物混合，得到半液体发酵剂；

(3)将步骤(2)得到的半液体发酵剂进行固液分离，得到浓缩或压缩发酵剂；

(4)向步骤(3)得到的浓缩或压缩发酵剂中加入冻干保护剂，并调整活菌浓度至10

根据本发明，步骤(1)中，所述发酵培养基可以为本领域常规的各种用于发酵酿酒酵母的发酵培养基，例如，可以为如上所述的YPD培养基，也可以为麦汁培养基和糖蜜培养基等各种适合于发酵酿酒酵母的培养基。

根据本发明，所述发酵培养的条件可以为本领域公知的常规的用于酵母发酵培养的条件，例如，所述发酵培养的温度可以为10-40℃。

根据本发明，步骤(2)中，所述发酵底物可以根据所述发酵菌剂的预定用途不同而不同，例如，当所述发酵剂预定用于啤酒发酵时，则所述发酵底物可以为麦芽汁。

其中，所述发酵底物的用量不受特别的限制，只要能够使得步骤(1)得到的液体发酵剂转变为半液体发酵剂即可。

根据本发明，步骤(3)中，所述固液分离的方法可以参照本领域常规的技术手段，例如，可以为离心、过滤等，只要不显著影响酿酒酵母的活性即可。根据本发明一种优选的实施方式，对所述发酵菌液进行离心以得到浓缩或压缩发酵剂。所述离心，例如，可以在冷冻离心机中以5000-12000rpm的速度离心5-20min获得菌体沉淀，从而得到浓缩或压缩发酵剂。

根据本发明，步骤(4)中，所述冻干保护剂可以为本领域常规的各种冷冻保护剂，例如，可以为脱脂乳粉、麦芽糊精、海藻糖、葡聚糖及甘油等中的至少一种。

根据本发明，优选的，在向所述浓缩或压缩发酵剂中加入冻干保护剂之前，优选的，该方法还包括使用缓冲液对所述浓缩或压缩发酵剂进行洗涤。其中，所述缓冲液可以为本领域常规的用于对菌体进行冲洗的缓冲液，例如，可以为生理盐水或PBS缓冲液。

其中，所述干燥的方式可以不受特别的限制，比如可以为冻干、烘干、风干或喷雾干燥等方式。

第四方面，本发明提供如上所述的制备方法制备的发酵剂。

第五方面，本发明提供如上所述的酿酒酵母或如上所述的发酵剂在发酵谷物饮料中的应用。

根据本发明，所述发酵谷物饮料可以为现有的任意的以酿酒酵母为发酵起始菌的发酵谷物饮料，根据本发明一种优选的实施方式，所述发酵谷物饮料为发酵酒，更优选为发酵啤酒。

在生产发酵谷物饮料的常规生产过程中，可以把酿酒酵母CGMCC No.20489按照常规使用方法接种到待处理的发酵底物中，在能够使所述酿酒酵母CGMCC No.20489繁殖的温度、压力下进行发酵。

本发明在发酵底物中加入CGMCC No.20489，其代谢产物能够使发酵酒具有一定的外观、香味等优异特性，改善了产品感官品质特性。

第六方面，本发明提供了一种发酵谷物饮料的制备方法，该方法包括：将如上所述的酿酒酵母或如上所述的发酵剂与发酵底物接触并进行发酵，以制备发酵谷物饮料。

根据本发明，本领域技术人员可以根据预定的发酵谷物饮料的种类将所述酿酒酵母或发酵剂接种到相应的发酵底物中，发酵结束后，再按照常规的方法进行相应发酵食品的制备。

根据本发明一种优选的实施方式，所述发酵谷物饮料为发酵酒，更优选为发酵啤酒。

在生产发酵谷物饮料的常规生产过程中，可以把酿酒酵母CGMCC No.20489按照常规使用方法接种到待处理的发酵底物中，在能够使所述酿酒酵母CGMCC No.20489繁殖的温度、压力下进行发酵。

根据本发明一种优选的实施方式，将酿酒酵母CGMCC No.20489按照常规使用方法接种到用于啤酒发酵的发酵底物中，并在20-40℃的条件下进行发酵，获得发酵啤酒。

其中，由于本发明提供的酿酒酵母CGMCC No.20489麦芽三糖利用率高，在含有麦芽三糖的发酵底物中发酵速度快，因此，所述发酵底物中优选含有麦芽三糖，例如，以麦芽汁为发酵底物。

第七方面，本发明提供了如上所述的制备方法制备的发酵谷物饮料。

第八方面，本发明提供如上所述的酿酒酵母或如上所述的发酵剂在麦芽PYF因子检测中的应用。

实施例

下述实施例中涉及的培养基配方如下：

YPD培养基(重量％)：酵母粉(1％)、蛋白胨(2％)、葡萄糖(2％)、琼脂(2％)，加热溶解，121℃高压灭菌15-20min。

麦汁培养基：大麦芽粉碎，按照1：4的料水比添加水分，45℃保持30min，64℃保持40min，70℃保持20min，过滤后添加琼脂(2％)，115℃高压灭菌15min。

糖蜜培养基：糖蜜稀释至68-10o Bé，添加酵母粉2g/L，硫酸铵0.5g/L，115℃高压灭菌15min。

实施例1

本实施例用于说明啤酒酿酒酵母CGMCC No.20489的分离、纯化及其特性鉴定

菌株：啤酒酿酒酵母CGMCC No.20489，分离自山东临沂农户家中留存的老面酵子，由中粮营养健康研究院营养健康菌种保藏中心保藏。

发明人从山东、山西等地搜集老面酵子，以无菌生理盐水梯度稀释至10

选择细胞形态为圆形、卵圆形，且出芽生殖的菌株。将上述分离到暂定为酵母菌的菌株在YPD液体培养基中活化3代后进行生理生化鉴定和分子生物学鉴定，并对酵母菌的生长，发酵性能，发酵制品外观品质特征、质构特征、发酵风味物质、感官品质等多个方面进行研究，经过多轮研究和论证，从众多野生酵母菌中最终筛选获得一株酿酒酵母菌。

1、形态学鉴定

将筛选的酿酒酵母，于28±1℃培养48小时，如图1所示，在WL培养基上菌落浅绿色，圆形，表面光滑，湿润，不透明。如图2所示，酿酒酵母的显微镜下细胞形态为卵圆型。

2、生理生化鉴定

利用法国梅里埃API鉴定系统对筛选菌株CGMCC NO.进行生理生化鉴定，鉴定结果见下表1。经生理生化鉴定，分离菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

表1本发明酿酒酵母的生理生化鉴定实验结果

[注]：表中“+”代表生化反应结果为阳性，“-”代表生化反应结果为阴性。

3、分子鉴定

对分离菌株的ITS1/ITS4进行克隆和测序，其ITS1/ITS4基因的核苷酸序列如SEQID NO:1所示，将本发明菌株的ITS1/ITS4序列与酿酒酵母菌的序列比对，本发明菌株的ITS1/ITS4序列与Saccharomyces cerevisiae序列相似性达到99.9％。

SEQ ID NO:1：

TTTTGAAAATGGATTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAACAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCC

结合生化鉴定结果，鉴定此菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

将分离菌株确定为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其保藏编号为CGMCC No.20489，保藏日期为2020年8月6日。

实施例2

本实施例用于说明酿酒酵母在啤酒发酵中的应用研究

用麦汁活化酵母，将酵母菌液，接种到12°P麦汁中，接种量为4％，发酵温度为20℃，前酵(是发酵的主要阶段，也是酵母活性期，麦汁中的可发酵性糖绝大部分在此期间发酵，酵母的一些主要代谢产物也是在此期内产生的)结束后(CO

1、酿酒酵母麦芽三糖利用率的测定研究

1)实验材料

高效液相色谱，色谱柱：Aminex HPX-87H(300mm×7.8mm)

2)实验方法

液相条件：柱温：65℃；流动相为0.005moL/LH2SO4，流速为0.600mL/min。检测器为示差检测器；进样量为20μL。

实验结果如下：

后酵结束后，本发明的酿酒酵母酿造的啤酒麦芽三糖含量为1.23mg/mL，麦汁中麦芽三糖含量为10.98mg/mL，麦芽三糖转化率为88.80％。

2、酿酒酵母发酵速度的研究

发酵速度测定使用称量法，CO

实验结果如下：

本发明的酿酒酵母酿造的啤酒在发酵第5天达到前酵终点。

3、酿酒酵母降双乙酰能力的研究

1)实验材料

双乙酰蒸馏装置、酶标仪、比色管

有机硅消泡剂、浓盐酸、邻苯二胺

2)实验方法

将双乙酰蒸馏器安装好，加热蒸汽发生瓶至沸腾。通气预热后，置25mL容量瓶于冷凝器出口接收馏出液(外加冰浴)，加1滴～2滴消泡剂于100mL量筒中，再注入未经除气的预先冷至5℃的酒样100mL，迅速转移至蒸馏器内，并用少量水冲洗带塞漏斗，盖塞。然后用水密封，进行蒸馏，直至馏出液接近25mL(蒸馏需在3min内完成)时取下容量瓶，达到室温后用水定容，摇匀。

分别吸取馏出液10.0mL于两支干燥的比色管中，并于第一支管中加入邻苯二胺溶液0.50mL，第二支管中不加(做空白)，充分摇匀后，同时置于暗处放置20min～30min，然后于第一支管中加入2mL盐酸溶液(4mol/L)，于第二支管中加入2.5ml盐酸溶液，混匀后，用20mm石英比色皿，于波长335nm下，以空白作参比，测定其吸光度。

试样的双乙酰含量按下式计算：

X-5＝A-335×1.2

式中：

X-5—试样的双乙酰含量，单位为毫克每户升(mg/L)；

A335—试样在波长335nm下，用20mm石英比色皿测得的吸光度；

1.2—换算系数

实验结果如下：

在4℃储藏6天后，本发明的酿酒酵母酿造的啤酒中双乙酰含量即降至0.05mg/mL。

4、酿酒酵母产酒精能力的研究

1)实验材料

酒精蒸馏装置、水浴锅、密度瓶、1000mL锥形瓶、100mL容量瓶

2)实验方法

a)试样制备：

将恒温至15℃～20℃的酒样约300mL倒入1000mL锥形瓶中，加橡皮塞，在恒温室内，轻轻摇动，开塞放气(开始有“砰砰”声)，盖塞。反复操作，直至无气体逸出为止。用单层中速干滤纸(漏斗上面盖表面玻璃)过滤。

b)样品蒸馏：

用一洁净、干燥的100mL容量瓶，准确量取样品(液温20℃)100mL于500mL蒸馏瓶中，用50mL水分三次冲洗容量瓶,，洗液并入500mL蒸馏瓶中，加几颗沸石(或玻璃珠)，连接蛇形冷凝管，以取样用的原容量瓶作接收器(外加冰浴)，开启冷却水(冷却水温度宜低于15℃)，缓慢加热蒸馏，收集馏出液。当接近刻度时,取下容量瓶，盖塞，于20℃水浴中保温30min，再补加水至刻度，混匀，备用。

c)试样溶液的测定

将密度瓶洗净并干燥，带温度计和侧孔罩称量。重复干燥和称重，直至恒重(m)。取下带温度计的瓶塞，将煮沸冷却至15℃的水注满已恒重的密度瓶中，插上带温度计的瓶塞(瓶中不得有气泡)，立即浸入20.0℃±0.1℃的恒温水浴中，待内容物温度达20℃并保持20min不变后，用滤纸快速吸去溢出侧管的液体，使侧管的液面和侧管管口齐平，立即盖好侧孔罩,取出密度瓶，用滤纸擦干瓶外壁上的水液，立即称量(m1)。将水倒出，先用无水乙醇，再用乙醚冲洗密度瓶，吹干(或于烘箱中烘干)，用试样馏出液反复冲洗密度瓶3次～5次,然后装满。按照4.2.2操作，称量(m2)。

样品在20℃的密度

式中：

ρ

m2--20℃时密度瓶和试样的质量，单位为克(g)；

m--密度瓶的质量，单位为克(g)；

A--空气浮力校正值；

m1--20℃时密度瓶与水的质量，单位为克(g)；

ρ

997.0--在20℃时蒸馏水与干燥空气密度值之差，单位为克每升(g/L)。

根据试样的密度

实验结果如下：后酵结束后，本发明的酿酒酵母酿造的啤酒酒精度为7.00％vol。

5、酿酒酵母发酵啤酒的真正发酵度

1)真正浓度的测定

将蒸馏除去酒精后的残液(在已知质量的蒸馏烧瓶中)，冷却至20℃，准确补加水使残液至100.0g，混匀。

用密度瓶测定出残液的相对密度。查出100g试样中浸出物的克数(g/100g)。即为啤酒的真正浓度。

2)分析结果的表述

根据测得的酒精度和真正浓度，按式(2)计算试样的原麦汁浓度：

X1＝((A×2.0665+E)×100)/(100+A×1.0665)

式中：

X1---试样的原麦汁浓度，单位为柏拉图度或质量分数

A---试样的酒精度质量分数，％；

E---试样的真正浓度质量分数，％。

RDF＝100×(2.0665×A)/(2.0665×A+Z)

式中：

RDF—试样的真正发酵质量分数，％；

A—试样的酒精度质量分数，％；

Z—试样的真正浓度，单位为柏拉图度或质量分数％。

实验结果如下：

后酵结束后，本发明的酿酒酵母酿造的啤酒真正发酵度为82.33％。

6、酿酒酵母发酵啤酒的风味物质组成

1)实验材料

超声波清洗仪、

50/30μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头及萃取手柄：美国Supelco公司；6890N-5973I气质联用仪：美国Agilent公司

有机滤膜(0.25μm)、一次性注射器

2)实验方法

将固相微萃取头插入气相色谱的进样口中，270℃老化1h，并进行空白实验，直至无色谱峰出现。将样品装入样品瓶，装液量为整个样品瓶容积的1/3～1/2，并加入2g氯化钠，将固相微萃取头插入样品瓶中，45℃萃取45min，在温度为270℃的气质联用仪进样口中解吸5min，进样分析。

气相色谱(GC)条件：HP-INNOWAX MS型色谱柱(30m×250μm×0.25μm)；载气为氦气(He)，流速1mL/min；柱温起始为50℃，保持5min，以6℃/min升温至160℃，保持3min，再以20℃/min升温至230℃；不分流进样。质谱(MS)条件：电离方式为电子电离(electronionization，EI)源，电子能量70eV，发射电流为200μA，离子源温度为230℃，四级杆150℃，全扫描模式，扫描质量范围50～550amu，无溶剂延迟。

定性分析方法：经过分析得到的图谱和美国国家标准技术研究所(nationalinstitute of standards and technology，NIST)谱库中的标准图谱进行比对，保留下匹配度＞80％的组分。

定量分析方法：采用峰面积归一化法计算各组分的相对含量，进行定量分析，后酵结束后所得啤酒的实验结果如表2所示。

如表2所示，共鉴定出40种香气成分。其中酯类16种，浓度为477.32ug/L；醇10种，浓度为988.83ug/L；醛3种，浓度为16.15ug/L；脂肪酸1种，浓度为3.71ug/L。

酯类物质是通过酸和醇酯化反应或者酵母代谢产生的，不同的酵母菌株细胞内具有不同的酯酰辅酶A的活性。辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、棕榈酸乙酯、乙酸乙酯、癸酸乙酯赋予酒体果香、花香和奶油等较好的风味。本发明提供的酵母在产酯类风味物质方面有明显优势。醇类物质主要是乙醇，苯乙醇和橙花叔醇可赋予酒愉快的花香味。本发明酿酒酵母酿造啤酒中还检测出了浓时有椰子香味，稀释时有杏仁味或桃花香的椰子醛及提供坚果香的苯甲醛。

色、香、味是构成发酵酒的三要素，香气成分的分子种类、含量、相互之间的比例及人们的感觉阈值决定了发酵酒的香味。用本发明提供的酿酒酵母酿造啤酒具有较好的风味。

表2

7、酿酒酵母絮凝性检测

1)实验材料

恒温水浴锅、离心机、硫酸钙、冰醋酸、醋酸钠、15/50mL离心管

2)实验方法

在50mL离心管中收集等量的酵母发酵液，并离心收集酵母(2000rpm，5min)，在新的50mL离心管中称取5g酵母样品，加人30mL0.051％的硫酸钙溶液中，洗涤后离心(1000rpm，5min)，再重复洗涤和离心。准确称取上述的离心酵母泥1.0g置于15mL锥底带刻度及盖的离心管中，加人10mL含硫酸钙、pH 4.5的醋酸缓冲液(0.51g水合硫酸钙+6.80g醋酸钠+4.05g冰醋酸，溶解后，定容1.00L)中，于20℃下水溶保温20min。然后充分振荡之，使酵母重新悬浮起来，再于20℃下保温10min，沉于离心管锥底部的沉淀毫升数，即为本斯值。

实验结果如下如图3所示，从图3可以看出，本发明酿酒酵母形成的解释沉淀约为0.5cm，为中等絮凝酵母。

8、酿酒酵母检测麦芽PYF因子

1)实验材料

糖化器、恒温培养箱、离心机、200mL比色管、麦芽、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、氯化钠

2)实验方法

a)麦芽样品经协定法制成协定麦汁。

b)115度20min灭菌制得协定麦汁，静止冷却过夜，缓慢倾倒留上清。

c)酵母用YPD培养基扩培后，4000rpm，5min离心得酵母泥。

d)缓慢倾倒用量筒量取静止后上清200mL麦汁，倒入三角瓶中，加入10.00g酵母泥，水平振荡器150r/min震荡10min混合均匀倒入EBC管中，用铝帽封好EBC管口。

e)放置23℃恒温培养箱内，发酵48小时。

d)在液面下5厘米处做好标记，用移液枪伸入液面下5厘米处，迅速吸取5mL液体，测悬浮酵母数。

6.22.6结果计算

麦芽PYF值＝试验样品中酵母细胞数/标准麦芽样品中酵母细胞数×100％。

实验结果如下：

本发明提供的酿酒酵母对PYF因子敏感，能区分不同PYF值麦芽，且检测结果稳定，重复性≤10％，重现性≤15％。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中粮营养健康研究院有限公司

中粮麦芽（大连）有限公司

<120> 高效利用麦芽三糖的酿酒酵母和发酵剂及其在发酵谷物饮料及麦芽PYF因子

检测中的应用

<130> I64207COF

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 766

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 1

ttttgaaaat ggattttttt gttttggcaa gagcatgaga gcttttactg ggcaagaaga 60

caagagatgg agagtccagc cgggcctgcg cttaagtgcg cggtcttgct aggcttgtaa 120

gtttctttct tgctattcca aacggtgaga gatttctgtg cttttgttat aggacaatta 180

aaaccgtttc aatacaacac actgtggagt tttcatatct ttgcaacttt ttctttgggc 240

attcgagcaa tcggggccca gaggtaacaa acacaaacaa ttttatttat tcattaaatt 300

tttgtcaaaa acaagaattt tcgtaactgg aaattttaaa atattaaaaa ctttcaacaa 360

cggatctctt ggttctcgca tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgatacg taatgtgaat 420

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