一种检测诊断低钾血症致病基因的DNA文库及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种通过靶向高通量测序技术检测诊断低钾血症致病基因的DNA文库及其应用。

背景技术

低钾血症是临床上常见的电解质紊乱，定义为血清钾含量低于3.5mmol/L。门诊低钾血症患者多无需住院检查，但合并高血压、反复多次发作低钾血症症状、补钾治疗效果不佳或血钾<3.0mmol/L者应住院检查和治疗。住院患者的低钾血症发生率约为20％，其中最常见原因为胃肠道疾病及手术。多数低钾血症临床上比较容易发现，并可以很快纠正，但是肾性失钾大多隐匿且顽固。严重低钾血症可导致全身性肌无力、心律失常、代谢正常，甚至可以致命。部分低钾血症患者可合并其他器官功能障碍，因此对于临床医师而言，如何正确、及时地诊断低钾血症是一个非常重要的问题，需采用有针对性的治疗和咨询。

已知低钾血症的发病机制多种多样，包括钾摄入不足、胃肠道流失、泌尿道流失、自细胞间质液流失、假性低钾血症等，其中由致病基因突变导致的低钾血症往往表现为反复发作，纠正困难，预后不佳，需要特别关注，代表性的包括：肾小管肾病、胰岛素分泌异常、离子通道病、盐代谢激素异常等。诊断这些致病基因导致的低钾血症只能利用基因检测才能做出准去诊断。目前，临床实验室检测基因突变大多采用传统的Sanger测序法，而如果对低钾血症的众多致病基因同时检测，不仅工作量巨大，而且导致检测效率低，更重要的是浪费珍贵的DNA样本、明显增加基因诊断的检测成本，严重制约了其在临床分子诊断中的大规模应用。因此，有必要寻求一种新的检测低钾血症致病基因突变的方法，提高诊断准确率，降低成本和劳动强度并提高时效性。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种能够提高诊断准确率、降低成本和劳动强度的通过靶向高通量测序技术检测诊断低钾血症致病基因的DNA文库。

本发明的目的之二在于提供所述DNA文库的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：一种基于高通量测序技术诊断低钾血症的DNA文库，该文库包括61个低钾血症致病基因，其中，所述61个低钾血症致病基因如下：

AIP、AKAP9、ANK2、ATP1A1、BMPR1A、BSND、CA2、CACNA1D、CACNA1S、CALM1、CALM2、CASR、CAV3、CDH23、CLCN1、CLCN2、CLCNKA、CLCNKB、CLDN10、COL3A1、COL5A1、CTNS、CYP11B1、CYP11B2、CYP17A1、FXYD2、GABRA3、HSD11B2、IKZF1、INSR、KCNE1、KCNE2、KCNE3、KCNH2、KCNJ1、KCNJ10、KCNJ18、KCNJ2、KCNJ5、KCNQ1、MAGED2、NOS1AP、NR3C1、OCRL、SCN10A、SCN4A、SCN4B、SCN5A、SCNN1A、SCNN1B、SCNN1G、SLC12A1、SLC12A3、SLC26A3、SLC2A2、SLC4A1、SMAD4、SNTA1、TP53、TRDN、USP8。

本发明提供的DNA文库覆盖了肾小管肾病、胰岛素分泌异常、离子通道病、盐代谢激素异常等几乎全部以低钾血症为临床表现的遗传病，包含61个低钾血症致病基因。这61个基因选择基于国际已报道和公认的临床致病基因数据库(OMIM数据库、HGMD数据库、ClinVar数据库)。这61个基因上的致病基因变异既可以单独致病，也可以联合致病导致更加严重和复杂的临床表型，本发明首次做到可以一次性全面的对它们进行测序。

本发明根据61个低钾血症致病基因，设计能覆盖上述基因外显子及毗邻±20bp内含子区域的探针池，利用探针靶向捕获建立含有61个低钾血症致病基因的目标区域文库，文库利用高通量测序技术进行测序，寻找致病突变，明确低钾血症的遗传学病因，为临床诊断提供遗传学和分子生物学的理论依据。

本发明还提供一种上述DNA文库在制备诊断试剂盒中的应用，所述试剂盒用于寻找低钾血症的致病基因，进而用于诊断低钾血症。

进一步，所述应用包括下列步骤：

1)收集低钾血症患者的临床资料及临床生物样本，优选的，所述的临床生物样本是指来源于人体的各类样本，包括但不限于来自受检者的外周血、体液、组织器官样本，如受检者的唾液、毛发或口腔黏膜等。

2)提取样本的基因组DNA，优选的，提取方法包括DNA提取试剂盒或各种手工提取方法；

3)对提取的基因组DNA进行定量，并构建文库，优选的，所述定量方法包括但不限于荧光定量方法和电泳；其中，构建文库包括如下步骤：

a)将基因组DNA进行片段化，优选的，所述片段化方法包括但不限于超声破碎、转座酶酶切和限制性内切酶酶切；

b)将片段化的基因组DNA进行末端修复的同时进行3'末端加A；

c)将3'末端加A的产物连接接头，以便进行有效连接产物的扩增，优选的，所述链接接头来自于高通量测序建库试剂盒；

d)将连接产物利用通用引物进行PCR扩增，加上完整的接头，优选的，所述通用引物来自于高通量测序建库试剂盒；

e)使用针对上述61个低钾血症致病基因的探针靶向捕获目标区域，优选的，所述捕获方法包括但不限于液相探针捕获和固相芯片杂交捕获；

f)将未捕获的文库清洗掉，仅保留目标区域文库；

j)获得目标区域捕获文库。

4)对文库进行定量操作，优选的，所述定量方法包括但不限于荧光定量方法和电泳；

5)利用测序设备对文库进行高通量测序，优选的，所述测序设备包括但不限于Novaseq系列、Hiseq系列、Nexeseq系列、BGIseq系列第二代核酸测序仪；

6)将得到的测序数据进行生物信息学比对，并通过变异解读得到致病位点相关信息。

一种诊断试剂盒，所述试剂盒包括所述的DNA文库。

较之现有技术而言，本发明的优点在于：

1.低钾血症与多种遗传性疾病有关，其严重程度不一，临床表现多样，从出生前死亡到仅表现为脊柱侧弯，甚至无明显症状，临床很难做出准确的病因学诊断，由于低钾血症可能伴有心脏病、脑病等严重的并发症或其他症状，因此确定致病基因是低钾血症临床正确诊断的关键。本发明旨在建立一种快速、准确、高通量检测低钾血症致病基因的新方法，从而帮助了解发病机制，辅助临床诊断、预后判断、产前诊断和精准治疗奠定基础。

2.基因诊断有助于临床遗传咨询和产前诊断等。通过临床遗传咨询，家属可了解自身的患病可能；患者父母或本人可通过基因检测指导生育，确保将来下一胎的健康。低钾血症常常是遗传疾病的临床表型之一，只有进行基因检测才能够提供准确的健康和生殖指导。发现家系中尚无症状的年幼致病基因携带者也有助于更早制定家庭医疗和康复计划。

3.本申请的DNA文库是发明人在多年开展高通量基因检测服务积累大量中国低钾血症临床病例的基础上，查阅大量文献，并采用ClinGen等权威数据库提供的疾病-基因相关性筛选方法，最终优选的61个低钾血症致病基因，兼顾了全面性、准确性和科学性，这些基因的绝大多数均为发明人在汉族人群中发现的致病基因，尤其适合包括中国人在内的黄色人种患者的检测。本发明优选61个低钾血症致病基因，设计探针池，建立针对61个低钾血症致病基因的目标区域文库，文库利用高通量测序技术进行测序，寻找致病突变，为临床诊断提供遗传学和分子生物学依据。本发明具有准确、快速、灵活、低成本的特点，本发明涉及的61个基因检测区域能够检测肾小管肾病、胰岛素分泌异常、离子通道病、盐代谢激素异常等几乎全部以低钾血症为临床表现的遗传病，对低钾血症的诊断和鉴别诊断有着重要的意义和临床价值。

4.本发明中采用高通量测序技术对目标区域捕获文库进行测序，能够在一次测序反应中同时检测本发明中涉及的61个低钾血症致病基因的全部外显子及其毗邻区域。与传统测序技术相比，本发明的检测效率显著提高、成本显著降低，在低钾血症基因挖掘和致病基因筛查方面具有巨大优势，是高效、可信、经济的低钾血症致病基因检测技术。

5.综合来看，本发明中涉及的DNA文库及其应用具有准确、灵活、快速、低成本的特点；经过临床评估，该发明对低钾血症具有很好的辅助诊断价值。

附图说明

图1是实施例1中对先证者样本的61个低钾血症致病基因建立目标区域靶向DNA文库的质控信息；

图2是实施例1中对先证者样本的61个低钾血症致病基因的目标区域进行测序的数据覆盖信息；

图3是实施例1中对先证者样本的61个低钾血症致病基因的目标区域进行测序的数据量信息；

图4是实施例1中所述的低钾血症家系的家系图谱，图中箭头指向的是先证者，实心图标表示为患者，空心图标表示为未发病，空心图标内圆点表示为携带状态。

具体实施方式

本发明提供了一种检测诊断低钾血症致病基因的DNA文库及其应用，下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，根据本发明的一个实施例，通过高通量测序平台进行测序，优选Illumina Hiseq平台，并进行数据分析，通过确定低钾血症表现者是否携带致病基因，判断其是否为低钾血症患者。

若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第四版或者相关资料进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例1：

本实施例是采用Illumina公司的Hiseq测序平台对受检人外周血基因组DNA进行检测，具体实施步骤如下：

1.样本来源

先证者为来自中国山东省的低钾血症患者，7岁，男性，先证者1年前运动过度后次日出现四肢乏力，伴四肢肌肉疼痛，无麻木感，休息数日后可缓解，运动过度后反复出现，近来每月发作3～4次，减少运动后一般每月发作1次。平素喜饮水，夜尿3～4次，大便无异常。体格检查：血钾2.5mmol/L，其它正常。否认家族史，否认长期服药史，否认化学物质、重金属、有毒物质接触史。该家系的家系谱如图4所示，箭头指向的是先证者，实心图标表示为患者，空心图标表示为未发病，空心图标内圆点表示为携带状态。共有3名家系成员参与检测，包括先证者(患病)、先证者母亲、先证者父亲，获得先证者父母的知情同意书，从该实施例家系成员的肘静脉采集静脉血10mL(EDTA抗凝处理)，用于检测。

2.标本基因组DNA的提取：

按照商家提供的说明书操作，使用Magen公司的基因组DNA提取试剂盒(HiPureBlood&Tissue DNA Kit)从外周血样本中提取基因组DNA，使用Nanodrop one测量DNA的纯度，所得基因组DNA的OD

3.基因组扩增文库的建立：

按照商家提供的说明书操作，使用KAPA公司的试剂盒(KAPA HyperPlus LibraryPreparation Kit)对基因组DNA进行酶切片段化、末端修复、3'末端加A、链接接头和PCR扩增，最后对获得文库进行定量和质检，具体实施步骤如下：

1)基因组DNA片段化反应，反应体系如下：

反应条件：37℃反应12min。

2)末端修复和3'末端加A反应，反应体系如下：

反应条件：20℃反应1min；65℃反应30min；20℃恒温

3)接头链接反应，反应体系如下：

反应条件：20℃反应20min。

4)第一次PCR扩增反应，反应体系如下：

反应条件：98℃45s；(98℃15s，60℃30s，72℃30s)×6cycles；72℃1min；12℃保存。

5)DNA定量和质检：

使用Nanodrop one测量PCR扩增产物的浓度和条带分布情况；配置2％琼脂糖凝胶，将获得PCR扩增产物与上样缓冲液混合，电泳观察条带的位置、亮度、均一性，条带大小在200-800bp之间为合格。

4.基于探针杂交捕获构建目标区域靶向DNA文库：

按照商家提供的说明书操作，文库的构建采用IGT公司的文库构建试剂盒，探针根据候选的61个低钾血症致病基因序列设计，合成并生物素标记，具体实施步骤如下：

1)探针杂交：

将步骤3获得PCR产物5μg与5μL Cot-1human DNA混合，涡旋振荡；根据总体积，加入2.5×Ampure XP beads，混匀离心，室温静置5min；上述磁珠用80％的乙醇离心清洗2次，用杂交液洗脱并进行杂交反应，杂交液的体系如下：

杂交条件：95℃反应10min；65℃过夜

2)使用80μL链霉亲和素标记的磁珠(M-270Streptavidin beads)，通过生物素与链霉亲和素结合，将杂交有样品目标序列的探针捕获到磁珠上。利用200μL的1×Bead WashBuffer依次在65℃和室温洗涤三次，每次3min，最后磁珠用20μL NF H

3)对捕获到的目标序列进行第二次PCR扩增反应，反应体系如下：

反应条件：98℃45s；(98℃15s,60℃30s,72℃30s)×7cycles；72℃1min；4℃保存。

5)PCR产物定量和质检：

使用Nanodrop one测量PCR扩增产物的浓度和条带分布情况；配置2％琼脂糖凝胶，将获得PCR扩增产物与上样缓冲液混合，电泳观察条带的位置、亮度、均一性，条带大小在200-800bp之间为合格。

5.测序数据的生信分析和变异解读：

使用Novocraft NovoAlign将NGS测序结果和人类参考基因组UCSC NCBI37/hg19进行比对，获得比对到基因组上的唯一比对序列。利用VarScan mpileup2snp和VarScanmpileup2indel检测确定61个低钾血症致病基因区域的变异。利用Remove Run CommonVariants和Remove Global Common Variants软件去除dbSNP和ExAC数据库中的常见变异。然后利用Interactive Biosoftware Alamut Batch对变异进行注释。注释用到的数据库包括：dbSNP、ExAC、1000g、ClinVar、OMIM等，并利用FATHMM、FATHMMMKL、METALR、METASVM、MUTATIONASSESSOR、MUTATIONTASTERAGVGD、AGVGD、LRT、PROVEAN、SIFT软件进行变异功能预测。根据《ACMG遗传变异分类标准与指南》，分析得到对低钾血症诊断有意义的突变位点。

6.测序结果说明及分析

通过本发明中提供的一种检测诊断低钾血症致病基因的DNA文库，一次性对3个受检者的61个低钾血症致病基因进行测序。以先证者为例，经质控分析，所得DNA文库大小主要分布在200-800bp，平均长度为492bp，浓度和片段大小符合测序要求，提示文库构建质量合格(如图1)。DNA文库包括61个基因的编码区长度为230871bp，非编码区长度为28754bp，共计259625bp。其中编码区的10×覆盖度为99.84％，20×覆盖度为99.79％，50×覆盖度为97.42％(如图2)。总共获得421756个片段读长数据(Total Reads)，匹配率(Aligned)为87.94％(如图3)。以上测序结果满足变异解读的数据要求。经过对测序数据的分析，发现与受检者临床表型相关的，低钾血症的致病基因变异，如下表所示：

先证者SLC12A3基因发现两个杂合变异，呈复合杂合，其中变异NM_000339.2:c.1456G>A(p.Asp486Asn)，即编码区第1456位碱基由G突变成A，该变异导致编码蛋白的第486位氨基酸由天冬氨酸变成天冬酰胺；变异NM_000339.2:c.2843G>A(p.Trp948*)，即编码区第2843位碱基由G突变成A，该变异导致编码蛋白的第948位氨基酸翻译终止，蛋白截短。SLC12A3基因的常染色体隐性变异与Gitelman综合征(Gitelman syndrome)的发生相关。

Gitelman综合征是一种以严重电解质紊乱为特征的肾脏疾病，在儿童晚期或青春期发病，病情严重程度和临床表现存在个体差异，临床表现为低钾血症、肌肉痉挛、肌无力、眩晕、喜盐、皮肤和面部感觉异常、易疲劳、低血压和关节疼痛。致死性心律失常的发生风险增加。

变异NM_000339.2:c.1456G>A以纯合或与多个致病变异以复合杂合形式在多名Gitelman综合征患者中被报道，并在家系中与疾病共分离。该变异在正常人群数据库gnomAD中的频率小于0.01％(6/235370)，无纯合子报道。该变异在HGMD数据库和ClinVar数据库中被报道为致病变异。Grantham's Distance预测提示天冬氨酸和天冬酰胺的理化性质差异小。氨基酸保守性分析表明，该变异位点的野生型氨基酸Asp486，在分析的所有59种哺乳动物和36/37种非哺乳类脊椎动物中保守，表明该位点的保守性高，发生氨基酸置换将不被容忍。该错义变异在2/3个预测软件中提示有害(MAPP，SIFT)，在1/3个预测软件中提示可容忍(AGVGD)。依据ACMG指南，确定该变异为致病变异。该变异遗传自先证者父亲。

变异NM_000339.2:c.2843G>A以杂合形式在1名Gitelman综合征患者中被报道。目前，该变异尚未被正常人群数据库gnomAD收录。该变异发生在转录本NM_000339.2(共26号外显子)的24号外显子上，对蛋白功能造成的影响未知，可能引起蛋白截短或激活无义介导的mRNA降解，从而影响SLC12A3基因编码蛋白产物的功能，该位点下游由多个截短变异被报道为致病变异。依据ACMG指南，确定该变异为致病变异。该变异遗传自先证者母亲。

经检测，先证者被确诊为Gitelman综合征，为后续的个体化治疗奠定了基础。建议先证者每年到肾脏病诊所随访1次以上。建议鼓励患者遵循喜盐的倾向，并考虑终身补盐(高钠和高钾饮食)。定期监测心律失常的危险因素。先证者的预期寿命正常。

对于遗传咨询，由于该疾病为常染色体隐性遗传，患者父母生育Gitelman综合征后代的再发风险为1/4，致病变异携带者风险为1/2。患者生育子女均为致病变异携带者。(如图4)

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“该实施例”、“实施例”等的描述意指结合该实施例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例中，且不做特定指代。

需要说明的是，尽管在本文中已经对上述实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。