核酸分子、载体和细胞及其应用及基于父系印记基因的植物无融合生殖克隆种子的筛选方法

技术领域

本发明属于植物分子生物学和农业生物技术领域，具体涉及一种核酸分子，一种重组载体，一种转基因细胞，所述核酸分子、所述重组载体或所述转基因细胞的应用，一种培育转基因植物的方法，一种鉴定所述转基因植物的方法，一种基于父系印记基因的植物高纯度克隆种子筛选方法，以及一种基于父系印记基因的筛选无融合生殖系的方法。

背景技术

近年来植物生物技术飞速发展，通过分子生物学以及基因工程的手段去研究和改良作物在农业生产中取得了很好的应用前景。近期通过分子生物学以及基因工程的手段在无融合生殖研究领域取得了重要进展。2018年底，美国加州大学戴维斯分校VenkatesanSundaresan教授团队发表的水稻无融合生殖体系；通过编辑PAIR1、REC8、OSD1(MiMe)三个基因，结合卵细胞中异位表达BBM1，实现了水稻的无融合生殖。但是该无融合生殖体系中克隆种子的比率只达到29％，远低于生产上96％的纯度要求，且克隆种子和正常授粉受精而成的种子无法进行分选。以至于还无法实现杂交种无融合生殖体系的应用。

发明内容

本发明的目的在于解决上述背景技术中的不足，提供一种核酸分子，一种重组载体，一种转基因细胞，所述核酸分子、所述重组载体或所述转基因细胞的应用，一种培育转基因植物的方法，一种鉴定所述转基因植物的方法，一种基于父系印记基因的植物高纯度克隆种子筛选方法，以及一种基于父系印记基因的筛选无融合生殖系的方法。本发明提供的核酸分子用于无融合克隆种子筛选时，获得的阳性转化植株自交产生具有荧光的合子胚种子和不具有荧光的无性胚种子。通过光电分选，可高效分选出固定了杂种优势的无性胚种子，从而实现杂交种无融合体系应用的方法。

为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种核酸分子，该核酸分子包含基于印记基因的表达盒E1，所述表达盒E1自上游至下游包括父系印记基因功能区、第一启动子、筛选标记基因和第一终止子。

优选的，该核酸分子还包含表达盒E2，所述表达盒E2携带有胚自主发生基因。

优选的，该核酸分子还包含表达盒E3，所述表达盒E3携带有产生MiMe突变体的元件，以促使有丝分裂替代减数分裂。

第二方面，本发明提供了一种重组载体，该重组载体包括如上所述的核酸分子。

优选的，所述重组载体包括表达盒E1和表达盒E2，且所述表达盒E1和所述表达盒E2以连锁表达盒的形式插入在所述重组载体中。

优选的，所述重组载体包括含有所述连锁表达盒和表达盒E3的核酸分子。

第三方面，本发明提供一种转基因细胞，该转基因细胞含有如上所述的核酸分子，或者如上所述的重组载体。

第四方面，本发明提供了如上所述的核酸分子，或者如上所述的重组载体，或者如上所述的转基因细胞的应用，其中，所述应用包括如下(a1)-(a4)中的至少一种：

(a1)孤雌生殖克隆种子的筛选；

(a2)制备无融合生殖系；

(a3)一系法育种；

(a4)固定植物杂种优势。

第五方面，本发明提供了一种培育转基因植物的方法，该方法包括：将如上所述的核酸分子，或者如上所述的重组载体导入植物，得到转基因植物。

优选的，该方法包括：将含有表达盒E1、表达盒E2和表达盒E3的核酸分子，或者如上所述的含有所述连锁表达盒和表达盒E3的核酸分子的重组载体导入植物，得到转基因植物。

第六方面，本发明提供了一种基于父系印记基因的植物无融合生殖克隆种子的筛选方法，该方法包括如下步骤：

A、将含有表达盒E1、表达盒E2和表达盒E3的核酸分子，或者如上所述的含有所述连锁表达盒和表达盒E3的核酸分子的重组载体导入植物，得到转基因植物；

B、将步骤A中获得的转基因植物自交，获得不带有筛选标记的无性胚种子和带有筛选标记的合子胚种子；

C、通过筛选标记对所述无性胚种子和合子胚种子进行分选，获得不带有筛选标记的无性胚种子，并将其作为克隆种子。

第七方面，本发明提供了一种筛选无融合生殖系的方法，该方法包括：

A、将含有表达盒E1、表达盒E2和表达盒E3的核酸分子，或者如上所述的含有所述连锁表达盒和表达盒E3的核酸分子的重组载体导入植物，得到转基因植物；

B、将步骤A中获得的转基因植物自交，检测其是否满足以下条件：(a1)具有MiMe突变，有丝分裂替代减数分裂；(a2)产生无性胚种子和合子胚种子两种种子；(a3)无性胚种子的胚中不携带有筛选标记基因；(a4)合子胚种子中表达表达盒E1中的筛选标记基因；

C、筛选同时满足步骤B中条件的转基因植物作为无融合生殖系。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明提供的基于父系印记基因的表达盒E1可以使通过授粉受精产生的合子胚产生荧光，具有父系印记基因的合子胚带有荧光筛选标记。当将其用于植物无融合生殖克隆种子的筛选时，阳性转化植株自交后代中产生两种种子，产生胚中具有荧光的合子胚种子和胚中无荧光的无性胚种子。通过光电分选，可高效分选出固定了杂种优势的无性胚种子，用于繁殖，含荧光的合子胚种子可以用于商用。这种无融合生殖方法可以在不影响种子产量的前提下产生并分选出固定了杂种优势的克隆种子，减除杂交种子的复杂制种程序，减轻劳动强度，降低杂交种子的生产成本，并达到杂种优势利用一系法的产业化要求，整体提高杂交种业的效益。本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。

附图说明

图1为本发明提供的一种具体的无融合生殖载体的结构示意图。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

第一方面，本发明提供了一种核酸分子，该核酸分子包含基于印记基因的表达盒E1，所述表达盒E1自上游至下游包括父系印记基因功能区、第一启动子、筛选标记基因和第一终止子。

根据本发明，基于父系印记基因的表达盒E1中的印记基因，来源于植物父本，并在植物胚中特异表达，因此通过授精产生的合子胚基本均带有筛选标记。当将其用于植物无融合生殖克隆种子的筛选时，合子胚种子的胚中基本都带有筛选标记，无性胚种子(克隆种子)的胚中都不带有筛选标记，因此克隆种子的纯度得到显著性提高，例如，纯度可达96％以上，可以为96％、97％、98％、99％、100％。

根据本发明，所述父系印记基因功能区可以为常规使用的各种父系印记基因功能区，优选为ICR(印记控制区(imprinting control region)、DMR2′(基因的差异甲基化区2′(differentially methylated region 2′,DMR2′))和DMR1(differentially methylatedregion 1,DMR1))的融合序列，该融合序列的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.2所示。

根据本发明，为了进一步提高克隆种子的纯度，所述第一启动子优选为胚特异表达启动子，例如，可以包括但不限于OsESP1、Ole18、OsVP1P和ZmESP，优选为OsESP1启动子，其序列优选如SEQ ID NO.3所示。

根据本发明，所述筛选标记基因可以包括但不限于荧光蛋白编码基因，优选为红色荧光蛋白编码基因，进一步优选为红色荧光蛋白编码基因DsRed2，所述DsRed2的序列优选如SEQ ID NO.4所示。

根据本发明，所述第一终止子可以包括但不限于Nos终止子，所述Nos终止子的序列优选如SEQ ID NO.5所示。

根据本发明，优选的，所述表达盒E1包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

根据本发明，当将所述核酸分子用于筛选植物无融合生殖克隆种子时，本领域技术人员可以根据本领域常规的技术手段使得植物产生克隆种子，也即，无性胚种子(例如，使卵细胞中异位表达BBM1足以实现孤雌生殖)，并根据本领域常规技术手段通过筛选标记等方式将受精产生的带有筛选标记的无胚种子与无融合生殖产生的不带有筛选标记的无性胚种子进行区分，从而筛选得到高纯度的克隆种子。

根据本发明一种优选的实施方式，该核酸分子还包含表达盒E2，所述表达盒E2携带有胚自主发生基因。

更优选的，所述表达盒E2自上游至下游包括：第二启动子、胚自主发生基因和第二终止子，更优选，为了进一步提高克隆种子的纯度，所述表达盒E2包括卵细胞特异启动子、胚自主发生基因和第二终止子。

根据本发明，所述卵细胞特异启动子可以为常规的各种能够特异性启动胚自主发生基因表达的启动子，优选选自但不限于AtDD45、Os03g0296600pro、ECA1-like1 pro、DCL2、AT1G74480.1和ZmEAl promoter；更优选为AtDD45，AtDD45的序列优选如SEQ ID NO.7所示。

根据本发明，所述胚自主发生基因可以为常规的能够实现孤雌生殖从而获得无性胚的基因，优选的，选自但不限于BBM1、WUS、LEC、CLAVATA和MYB115，优选为BBM1，优选如SEQID NO.8所示。

根据本发明，所述第二终止子可以为常规的各种能够种子基因表达的终止子，例如可以为但不限于Nos终止子，所述Nos终止子的序列优选如SEQ ID NO.5所示。

根据本发明，优选的，所述表达盒E2包括如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

根据本发明，所述表达盒E2的表达使卵细胞在卵细胞特异启动子驱动胚自主发生基因表达的作用下，进行孤雌生殖得到无性胚，无性胚只含有母本基因组，不含父本基因组，因此，不携带筛选标记。从而能够和合子胚通过筛选标记进行筛分。

根据本发明，所述核酸分子还包含表达盒E3，所述表达盒E3携带有产生MiMe突变体的元件，以促使有丝分裂替代减数分裂。

优选的，MiMe突变体中包括PAIR1、REC8和OSD1的突变，产生MiMe突变体的元件包括：如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的构建PAIR1突变的靶标序列，如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的构建REC8突变的靶标序列，如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的构建OSD1突变的靶标序列。

其中，所述MiMe突变体可以通过基因编辑获得，所述载体可以为Cas9载体。

根据本发明，通过MiMe突变，可以促使有丝分裂替代减数分裂，从而使减数分裂受阻，使得在表达盒E3产生MiMe突变体的条件下，可使无性胚进一步发育成克隆种子。

本领域公知，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的核苷酸序列，完全可以推导出能够编码相同蛋白质分子的其他核苷酸序列，通过生物学方法(如PCR方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此该部分核苷酸序列都应该包括在本发明范围内。

根据本发明一种优选的实施方式，本发明提供了一种核酸分子，该核酸分子包括如上所述的表达盒E1和表达盒E2，其中，所述表达盒E1和表达盒E2优选形成连锁表达盒。

根据本发明一种优选的实施方式，本发明提供了一种核酸分子，该核酸分子包括如上所述的表达盒E1、表达盒E2和表达盒E3。

当表达盒E2和表达盒E3联用时，表达盒E2的表达使卵细胞在卵细胞特异启动子驱动胚自主发生基因表达的作用下，进行孤雌生殖得到无性胚，并在表达盒E3产生MiMe突变体的条件下，无性胚进一步可发育成与母本基因型完全相同的克隆种子。

第二方面，本发明提供了一种重组载体，该重组载体包含如上所述的核酸分子。

根据本发明，所述重组载体可以按照本领域的常规技术手段进行构建，例如，当所述重组载体还包括表达盒E2和表达盒E3中的至少1个时，可以将不同的表达盒构建在同一载体中，也可以构建在不同的载体中。

所述载体可以为本领域常规的各种载体，例如，可以为但不限于Cas9载体。

根据本发明，可以采用本领域常规技术手段来构建本发明的重组载体，例如，可采用能够在载体多克隆位点具有切割位点的各种核酸内切酶进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的目的基因片段连接，获得本发明的重组载体。

根据本发明一种优选的实施方式，所述重组载体包括含有连锁表达盒的核酸分子，该连锁表达盒包含所述表达盒E1和表达盒E2。

根据本发明另一种优选的实施方式，所述重组载体包括含有所述连锁表达盒和表达盒E3的核酸分子。

根据本发明一种优选的实施方式，用于构建所述重组载体的载体为Cas9载体，该重组载体通过如下的方式获得，通过Gate-Way方法将MiMe突变引入基因编辑载体Cas9载体中，然后利用酶切连接的方法将如上所述连锁表达盒通过亚克隆方式引入。

第三方面，本发明提供了一种转基因细胞，该转基因细胞包括如上所述的核酸分子，或者如上所述的重组载体。

所述转基因细胞可以为细菌细胞，例如，可以为大肠杆菌细胞(可以为大肠杆菌DH5a)或者农杆菌细胞(可以为农杆菌EHA105)。

可以通过本领域常规的技术手段将如上所述的核酸分子引入所述宿主细胞中，如氯化钙法化学转化、热激转化、电击转化等。

第四方面，本发明提供了如上所述的核酸分子，或者如上所述的重组载体或者如上所述的转基因细胞的应用，其中，所述应用包括如下(a1)-(a4)中的至少一种：

(a1)孤雌生殖克隆种子的筛选；

(a2)制备无融合生殖系；

(a3)一系法育种；

(a4)固定植物杂种优势。

根据本发明一种具体的应用，所述核酸分子含有表达盒E1，如上所述的，该表达盒E1可以使合子胚产生荧光，具有父系印记基因的合子胚带有荧光筛选标记，可以很容易被分选出。

当用于如上的应用时，本领域技术人员可以根据本领域的常规技术手段结合其他的操作从而实现所述应用，例如，当用于孤雌生殖制备克隆种子时，本领域技术人员可以根据本领域的常规技术手段实现无性胚的获得以及实现无性胚种子的获得。

根据本发明一种具体的应用，所述核酸分子含有表达盒E1、表达盒E2和表达盒E3，且表达盒E1和表达盒E2以连锁表达盒的形式存在于所述核酸分子中。

第五方面，本发明还提供了一种培育转基因植物的方法，该方法包括：将如上所述的核酸分子，或者如上所述的重组载体导入植物，得到转基因植物。

优选的，该方法包括：将含有表达盒E1、表达盒E2和表达盒E3的核酸分子，或者含有所述连锁表达盒和表达盒E3的核酸分子导入植物，得到转基因植物。

根据本发明，将如上所述的核酸分子导入植物中的方法可以包括：构建表达载体，并将该表达载体导入大肠杆菌中以对其正确性进行验证，然后将验证正确的表达载体转化入农杆菌中；最后再用该农杆菌浸染植物的愈伤组织，从而导入植物中。

优选的，所述植物包括单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物或双子叶植物为水稻、玉米、油菜、谷子、小麦、辣椒；优选为单子叶植物。

优选的，所述单子叶植物为水稻，更优选为杂交水稻。

根据本发明，可以将如上核酸或载体导入到目标植物的任意部位，只要能够使其表达并实现本发明的目的即可，例如，可以导入细胞的核、叶绿体、线粒体和/或质体中。

本发明还提供了一种鉴定如上所述的转基因植物的方法，该方法包括如下至少一种方法：

(1)利用特异性引物对所述转基因植物或其部分进行特异性扩增；

(2)通过对所述筛选标记进行观察；

(3)通过荧光定量分选；

(4)通过探针杂交检测。

根据本发明一种优选的实施方式，该特异性引物能够对所述表达盒E1的全长或任意片段进行特异性扩增，且所述筛选标记基因为如SEQ ID NO.4所示的红色荧光蛋白基因DsRed2，该引物包括如SEQ ID NO.15所示的上游引物和如SEQ ID NO.16所示的下游引物。

第六方面，本发明提供了一种基于父系印记基因的植物无融合生殖克隆种子的筛选方法，该方法包括如下步骤：

A、将含有表达盒E1、表达盒E2和表达盒E3的核酸分子，或者如上所述的含有所述连锁表达盒和表达盒E3的核酸分子的重组载体导入植物，得到转基因植物；

B、将步骤A中获得的转基因植物自交，获得不带有筛选标记的无性胚种子和带有筛选标记的合子胚种子；

C、通过筛选标记对所述无性胚种子和合子胚种子进行分选，获得不带有筛选标记的无性胚种子，并将其作为克隆种子。

本发明提供的基于父系印记基因的表达盒E1可以使通过授粉受精产生的合子胚产生荧光，具有父系印记基因的合子胚带有荧光筛选标记。表达盒E2的表达使卵细胞在卵细胞特异启动子驱动胚自主发生基因表达的作用下，进行孤雌生殖得到不带有筛选标记的无性胚，并在表达盒E3产生MiMe突变体的条件下，无性胚进一步可发育成与母本基因型完全相同的克隆种子，只含有母本基因组，不含父本基因组。因此，可将合子胚种子和无性胚种子进行高效的筛选。

第七方面，本发明提供了一种筛选无融合生殖系的方法，该方法包括：

A、将含有表达盒E1、表达盒E2和表达盒E3的核酸分子，或者如上所述的含有所述连锁表达盒和表达盒E3的核酸分子的重组载体导入植物，得到转基因植物；

B、将步骤A中获得的转基因植物自交，检测其是否满足以下条件：(a1)具有MiMe突变，有丝分裂替代减数分裂；(a2)产生无性胚种子和合子胚种子两种种子；(a3)无性胚种子的胚中不携带有筛选标记基因；(a4)合子胚种子中表达表达盒E1中的筛选标记基因；

C、筛选同时满足步骤B中条件的转基因植物作为无融合生殖系。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中：

实施例1

本实施例用于说明转基因植株的获得

1.合成表达盒E1和E2

合成表达盒E1，序列如SEQ ID NO.1所示：包括父系印记基因功能区ICR、DMR2′、DMR1的融合序列(SEQ ID NO.2)，胚特异表达启动子OsESP1(SEQ ID NO.3)、红色荧光蛋白基因DsRed2(SEQ ID NO.4)、NOS终止子(SEQ ID NO.5)。

合成表达盒E2，序列如SEQ ID NO.6所示，包括卵细胞特异启动子AtDD45(SEQ IDNO.7)、胚自主发生基因选自BBM1(SEQ ID NO.8)、NOS终止子(SEQ ID NO.5)。

将E1和E2构建成连锁表达盒，命名为76E。

2.构建表达载体p76C

分别在PAIR1、REC8、OSD1基因编码区设计2个靶标(PAIR1：SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10；REC8：SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；OSD1：SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14)，通过Gate-Way方法构建至基因编辑载体Cas9载体，构建MiMe突变体，命名为p56DM。

利用酶切连接的方法将76E亚克隆至基因编辑载体p56DM，载体重新命名为p76C，表达载体p76C的完整载体图谱见附图1。

3.重组质粒的转化

(1)取一管200μL大肠杆菌感受态细胞DH5a与5μL连接产物混合，冰浴30min；

(2)迅速置于42℃恒温水浴锅中，热激90s，冰浴2min；

(3)加入500μL LB液体培养基，混匀；

(4)37℃、200rpm,培养45min，使细胞恢复正常生长状态；

(5)将菌液均匀涂布于LB固体培养基平板上；

(6)30min后，置37℃恒温培养箱，过夜培养。

(7)挑取正确的单克隆接菌，抽提质粒，酶切验证。

4.重组农杆菌的获得

将构建正确的植物表达载体使用电激法转化农杆菌EHA105。导入方法采用电激转化方法，主要参考bio-rad公司的电击仪使用说明书进行，具体步骤如下：

将储存于-80℃的EHA105感受态细胞取出放在冰上冻融，1mm电击杯放在冰上预冷，把冻存的SOC放置在37℃解冻。将干净的EP离心管插在冰上预冷，一般EP离心管的数目比要转化的样品多两个，一个用来做阴性对照(没有加入DNA)、另一个做阳性对照(加入1μl的10ng/μl pUC19)。分别吸取1μl要转化的DNA样品放入预冷的EP离心管中，然后将融化的EHA105感受态细胞20μl轻轻取出放入预冷的离心管底部，轻轻的将两者混匀，尽量不要产生气泡，离心管底部不要用手接触，避免温度变化对感受态转化效率造成影响，操作过程尽量的快。设置转化参数，电阻200Ω，电容25μF，电压1800V，电激杯规格1mm，BioRad电激仪一般有推荐使用的参数。轻轻吸取感受态和DNA混合物，放入电激杯中，轻敲使混合物均匀的分布于杯底。盖上盖子放入电激槽中，关上安全盖，按下电激红色按钮，待电激完成后，将在37℃预热好的SOC放入电激杯中，将混合物旋起，用吸头将混合物转入摇菌管中，于28℃恒温摇床，180rpm,2h。取50μl菌液涂布在含卡那霉素(50μg/mL)和利福平(25μg/mL)的LB固体培养基上，28℃暗培养2d，挑取农杆菌转化子单菌落，接种到添加了相同抗生素的LB液体培养基中，28℃条件下，振荡培养2d。取适量菌液加入等体积的50％浓度的无菌甘油混合，于-80℃条件下保存、备用。

挑选水稻表达载体p76C农杆菌单菌落接种于含50mg/L kanamycin的LB培养基上26℃暗培养2天后，用NB-AS液体培养基洗下农杆菌菌体，28℃180rpm液体振荡培养90-120min。调整菌落浓度至OD600为0.8-1.0，转化杂交稻，杂交水稻种子消毒，挑选子粒饱满的种子，用75％的酒精浸泡30s，倒掉酒精，无菌水冲洗一遍，用HgCl

将无菌愈伤组织集中在一起，放入农杆菌悬浮液中，浸泡5-10min，取出，用滤纸晾干。接种到共培养培养基，共培养2天，将共培养的愈伤，清洗6遍，并用滤纸晾干后接种到具有潮霉素抗性的筛选培养基上45天。

将抗性愈伤转移到分化培养基上，培养2周后愈伤开始转绿，3周后即可长出幼芽，随之根也长出。将幼苗转移到含生根培养基的小三角瓶内，每瓶一株，继续光照培养，待小植株长至7-10cm左右时进行室内炼苗，3～4d后将其移栽到土壤中生长。通过观察绿色(载体上自带)荧光筛选出转化植株。

实施例2

本实施例用于说明转基因植株的获得

按照实施例1的方法进行转基因植物的制备，不同的是，表达盒E1中的父系印记基因功能区不包括ICR、DMR2′、DMR1。

对比例1

本对比例用于说明参比的转基因植株的获得

按照实施例1的方法进行转基因植株的制备，不同的是，表达盒E1中不设置父系印记基因功能区。

测试例1

本测试例用于说明转基因植株的分子检测

DNA抽提：分别取如上实施例1、实施例2和对比例1的各1.0g叶片，液氮研磨至粉末状，转入2ml EP管中，加入700μl预热的CTAB溶液。于65℃水浴30-60min，期间轻轻混匀，冷却后加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)，混匀，12000rpm离心10min,取上清至新的离心管中，加入500μl异丙醇，-20℃静置30-60min。4℃，12000rpm,10min收集沉淀，弃上清。70％乙醇清洗沉淀2次，吹干酒精残留，50-100μl ddH2O溶解沉淀，备用。

PCR分析：以DsRed2基因作为模板设计引物，扩增产物片段为431bp。

正向引物：

F:5'-CCCAGTTCCAGTACGGCTCCAAG-3'(SEQ ID NO.15)；

反向引物：

R:5'-CTCGTTGTGGGAGGTGATGTCCAG-3'(SEQ ID NO.16)。

PCR反应体系：DNA 30-90ng,10×Buffer 2.0μl,1mM dNTP 1.8μl,25mM MgCl21.5μl,10uM primer两种各0.5μl,Tag酶1.5U，加ddH2O至20μl反应体积。PCR循环条件94℃，3min；94℃,1min，64℃,1.5min，72℃30s，40个循环；72℃，延伸5min。用1.4％琼脂糖凝胶电泳检测，照相记录电泳结果，结果显示，使用实施例1、实施例2和对比例1获得的转基因植物的扩增片段与预期大小相符。

荧光定量分析：使用植物总RNA提取试剂盒(天根DP432)对T0代转基因杂交稻和野生型杂交稻对照进行RNA抽提，方法参考试剂盒说明书。以总RNA为模板逆转录合成相应的cDNA。以Actin为内参基因，野生型植株为对照，用RT-PCR的方法对RFP(红色荧光蛋白)基因进行定量PCR检测。显示，使用实施例1、实施例2和对比例1获得的转基因植物中，RFP的定量PCR检测的转录水平应与荧光显微镜观察的翻译表达水平相对应。

Southern印迹分析：取水稻总DNA进行EcoRⅠ酶切、电泳、转移至硝酸纤维素膜Hybond-N。利用随机引物标记试剂盒(Promega公司)和[α-32P]dATP(北京亚辉公司)，随机引物法制备α-32P标记的RFP基因片段，作为分子探针，按照Sambrook等分子克隆方法进行转化植株的Southern杂交分析。Southern杂交分析可以显示转基因的拷贝数，通过农杆菌介导转化的转基因拷贝数多为1-3拷贝，但由于本发明实施例中采用了MiMe突变体，减数分裂被有丝分裂所替代，后代中无基因自由组合和分离，因此使用实施例1、实施例2和对比例1获得的转基因植物中转基因拷贝数的个数不受制约。

测试例2

本测试例用于说明无融合生殖系的筛选

对经过分子鉴定的转基因植株进行自交，考察其株高、分蘖数、剑叶长、结实率、千粒重等农艺性状，与野生型无差异；收获的种子观察其大小差异，与野生型无差异，并在手持式荧光灯下观察，可见种子中，有的胚显示红色荧光，有的胚没有红色荧光，统计其荧光种子和非荧光种子比例。

其中，实施例1获得的转基因植物中克隆种子纯度为98％，实施例2获得的转基因植物中克隆种子纯度为96％，对比例1获得的转基因植物中克隆种子纯度为29％。

纯度的检测：由于本发明植物中含有E3表达盒，则后代不会发生性状分离。如果出现了两种不同的种子(有荧光/无荧光)，则表明父系印记成功表达，从而将合子胚和无性胚筛选；如果父系印记没有成功表达，可通过基因芯片测定种子的杂合度，从而也可将合子胚和无性胚进行筛选。

取胚无红色荧光的种子进行发芽，流式细胞检测其染色体倍数。以亲本为对照，通过全基因组测序检测其杂合性。筛选出具有以下特征的转化植株即为无融合生殖系：(1)自交产生具有红色荧光的胚和无荧光的胚；(2)无红色荧光的胚为二倍体且保留了母本杂合性；(3)具有MiMe突变。

试验例

本试验例用于说明杂交水稻的无融合生殖繁殖

取实施例1无红色荧光的种子进行繁殖，考察其株高、分蘖数、剑叶长、结实率、千粒重等农艺性状，与野生型无差异。收获的种子观察其大小差异，与野生型无差异，并在手持式荧光灯下观察其胚是否红色荧光，统计其荧光种子和非荧光种子比例。

取无红色荧光的胚进行发芽，流式细胞检测其染色体倍数。以亲本为对照，通过全基因组测序检测其杂合性。重复多代，取表现稳定的株系供一系法育种的应用。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南杂交水稻研究中心

<120> 核酸分子、载体和细胞及其应用及基于父系印记基因的植物无融合生殖克隆

种子的筛选方法

<130> YXI66057HHRRC

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4219

<212> DNA

<213> 表达盒E1

<400> 1

caacccttac tccctttctt tcttctcata gagtgaacct aaatgcaaga tattagtgct 60

aaattgcttt aaaaataata atttaaattc aattggattt tataccataa atggttttca 120

tggttcatca ttgtgggata gatgcatgtt ttggcctgga cttgaaaatt tgtagcatta 180

caaaatattc tctccatttc tagatgaaag attttgggtt gacttcccta aacaccaaat 240

atagtgttta ttgtttatac ttactttttt gtggtatgga tatctttgaa gcattaatat 300

ataatttatt atcagaatta acttgattta cagattgtat tagattaggg atttgatatt 360

tcagagattt attaggttgt tatgtattct tttaaaaaca aaaaagaaaa gaaaagaaaa 420

gtaaatctca tcagttttag ttttaatttt aagaaataca agccgaaatg gaaatataag 480

aaaggagaga tatatccaat tgagattgaa gggataactt ttgactagaa atttatttaa 540

aataactact ttcaagtttt atttactcag tggcaaaaag ccgaaattag taaaaagcaa 600

tatcttctat gtacgcacat cggtatatgt tacattattt ttggtagatt gtacgagatt 660

tttctcctac attttattta ataacgaaat atccctaata tctaactata ttaaaccaac 720

aaccaacgcc gaatccatct ccaacaccac ccttctaaat attttctccc aagctacaac 780

aagccattaa tacacagccc acaattccgc taataggctg agcaaacacc aatattaaaa 840

acaaaactac ctaaccacgt cccatactca tcacggatca cacctcccgc tgttgccttc 900

cccgggtttc catgcgaggc tccgtcggta ttgattgtaa cccatccctc acttggtttc 960

ccaaacagtc ggtttcaagg ttataagttc gaagaggaat taggtgaaac gatagaggtt 1020

aatttgattg attttatgag ttttcacata tattaaaaaa attaattaat atttaaatat 1080

aaatattatt tttggtatta atttgtttct ttattacttt aaaccaatag taattttata 1140

caataaatta tttacaatca atatttttta aaagtttatg attcgtcata attaattaat 1200

aaaaaaggca tggtaaagca aaaaataaat ctcttaagaa acaaggaaaa agacatcgaa 1260

attatttggt tgacttcact agacccaggc tactttcaag tcaataagag acatttgtta 1320

gttataagac atatctctta acataagaat tgtgttaaga gaccatcaat aaggatgctc 1380

taataatctt cctttcactg cgttacaaac gtttgctatg gatttgttct cttatcgcaa 1440

aaacaataca cgatttgtgc caaggccaca ttttatgtaa taattttggg tgccacacta 1500

atcaataatt ttctgttagt tggtcaaatt gtcattctaa aagtcatttt tacaaaggct 1560

ttaaccctaa aatttgtaac atttattatt catttttgat ttgttgtgtc ttagtctcat 1620

atatttgttg ggcttttgtt tttgtttatt tagaatatat aatcaatcac ctatgaaaca 1680

taattaaatc tttttgccta agtacaaaca ctatttgggg tccctgtttt ggtgtagttt 1740

agggaagtca acccaaaata tttttgtcta caaatggaga gagtatttac tctttaagta 1800

ctgctattaa atttcaattc aacatatgga attacaagga cagctgagca aagaatgcac 1860

accctagttt atgcttaaag atcagttcag atttaggtga tgctgcacta tcaaaattac 1920

caggcctaac agcttagtgt gtatttacca aaactactat caaacaccag atttcccatg 1980

ttcttttatt tatatcagat aaaacatttt tttctacgag tatgccacaa ttgccaccaa 2040

gtcagcaatt gtcgtttctc ttgttttaac gcatttcttt caattttagc atggaaaact 2100

tcgcattcga gtgggatgga acatagcata taattcgata atgcatgttt tgcatctctg 2160

aagattgtgg aaatttgcat tagatgcata gattggttgc tttggtgtga tttttttccc 2220

aatgctttct cgtgctagta atttaccatc atgtgttatt cattcatgat atgctccatt 2280

ttaataaaag ctgctaatgt tgggccatga actaaaattc tgaccaggta aaattgttag 2340

gccagtttct cactatatca agtcaatggt acatgccatg ttgggctttt tggatgcaaa 2400

tgtctcagaa agaaagaaag aattgatctg cctatccagt aaaaaaatgg tccgcttgtg 2460

ccttttcctg ccttatagtg attggaatga aatgcctaag atgctaaaat tggccaatta 2520

ttcttcccaa tagtgacaaa tcccttgtta acaccatata ttgttcctct ttgcggtttt 2580

cctattccag aggaaatccc tccttatttc agtatgcatg tactttttgt cgttttattc 2640

atgacattat cagcatgcca gggatgaaag taaatcactg gtcatagcaa gtccacgttg 2700

atcaaaacaa tagctttcca gccgaatggt gtcatttccc taacttggaa agtgatagta 2760

taattgatga ggagaaaaga tgaaaaagtc atcagtttta gctatatata gcgctattga 2820

gataaagatg tttggccagt ttggtgtcat accaacagta catgactgct aggtagttga 2880

ctgtcctcat cagttttggt gcaataaatt gaaagatctc actggcaaac acattattct 2940

tcctgtttct aaacaaatct aattaccaca gtgaaaactg caaaagcgga aaggttacga 3000

tggaaaccag agcaccatgg atattcttca atctttactc aaggtatcca tccttattgc 3060

gattttgttt gttcagtatg ttcatattaa tcatttcctt atgttcacct gtctattctt 3120

ctggggcagt gcttgaagat aagaaattga actgcaagca ttctatgctc atattaatca 3180

tttccttatg tatatctgtc ttttcttcag ggatagtgct tgaagataag aaatgaacca 3240

caagcattct ttctctgccc tctatggcct cctccgagaa cgtcatcacc gagttcatgc 3300

gcttcaaggt gcgcatggag ggcaccgtga acggccacga gttcgagatc gagggcgagg 3360

gcgagggccg cccctacgag ggccacaaca ccgtgaagct gaaggtgacc aagggcggcc 3420

ccctgccctt cgcctgggac atcctgtccc cccagttcca gtacggctcc aaggtgtacg 3480

tgaagcaccc cgccgacatc cccgactaca agaagctgtc cttccccgag ggcttcaagt 3540

gggagcgcgt gatgaacttc gaggacggcg gcgtggcgac cgtgacccag gactcctccc 3600

tgcaggacgg ctgcttcatc tacaaggtga agttcatcgg cgtgaacttc ccctccgacg 3660

gccccgtgat gcagaagaag accatgggct gggaggcctc caccgagcgc ctgtaccccc 3720

gcgacggcgt gctgaagggc gagacccaca aggccctgaa gctgaaggac ggcggccact 3780

acctggtgga gttcaagtcc atctacatgg ccaagaagcc cgtgcagctg cccggctact 3840

actacgtgga cgccaagctg gacatcacct cccacaacga ggactacacc atcgtggagc 3900

agtacgagcg caccgagggc cgccaccacc tgttcctgta gggtgaccag ctcgaatttc 3960

cccgatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt 4020

gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa 4080

tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa 4140

tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca 4200

tctatgttac tagatcggg 4219

<210> 2

<211> 1824

<212> DNA

<213> 父系印记基因功能区(ICR+DMR2'+DMR1)

<400> 2

caacccttac tccctttctt tcttctcata gagtgaacct aaatgcaaga tattagtgct 60

aaattgcttt aaaaataata atttaaattc aattggattt tataccataa atggttttca 120

tggttcatca ttgtgggata gatgcatgtt ttggcctgga cttgaaaatt tgtagcatta 180

caaaatattc tctccatttc tagatgaaag attttgggtt gacttcccta aacaccaaat 240

atagtgttta ttgtttatac ttactttttt gtggtatgga tatctttgaa gcattaatat 300

ataatttatt atcagaatta acttgattta cagattgtat tagattaggg atttgatatt 360

tcagagattt attaggttgt tatgtattct tttaaaaaca aaaaagaaaa gaaaagaaaa 420

gtaaatctca tcagttttag ttttaatttt aagaaataca agccgaaatg gaaatataag 480

aaaggagaga tatatccaat tgagattgaa gggataactt ttgactagaa atttatttaa 540

aataactact ttcaagtttt atttactcag tggcaaaaag ccgaaattag taaaaagcaa 600

tatcttctat gtacgcacat cggtatatgt tacattattt ttggtagatt gtacgagatt 660

tttctcctac attttattta ataacgaaat atccctaata tctaactata ttaaaccaac 720

aaccaacgcc gaatccatct ccaacaccac ccttctaaat attttctccc aagctacaac 780

aagccattaa tacacagccc acaattccgc taataggctg agcaaacacc aatattaaaa 840

acaaaactac ctaaccacgt cccatactca tcacggatca cacctcccgc tgttgccttc 900

cccgggtttc catgcgaggc tccgtcggta ttgattgtaa cccatccctc acttggtttc 960

ccaaacagtc ggtttcaagg ttataagttc gaagaggaat taggtgaaac gatagaggtt 1020

aatttgattg attttatgag ttttcacata tattaaaaaa attaattaat atttaaatat 1080

aaatattatt tttggtatta atttgtttct ttattacttt aaaccaatag taattttata 1140

caataaatta tttacaatca atatttttta aaagtttatg attcgtcata attaattaat 1200

aaaaaaggca tggtaaagca aaaaataaat ctcttaagaa acaaggaaaa agacatcgaa 1260

attatttggt tgacttcact agacccaggc tactttcaag tcaataagag acatttgtta 1320

gttataagac atatctctta acataagaat tgtgttaaga gaccatcaat aaggatgctc 1380

taataatctt cctttcactg cgttacaaac gtttgctatg gatttgttct cttatcgcaa 1440

aaacaataca cgatttgtgc caaggccaca ttttatgtaa taattttggg tgccacacta 1500

atcaataatt ttctgttagt tggtcaaatt gtcattctaa aagtcatttt tacaaaggct 1560

ttaaccctaa aatttgtaac atttattatt catttttgat ttgttgtgtc ttagtctcat 1620

atatttgttg ggcttttgtt tttgtttatt tagaatatat aatcaatcac ctatgaaaca 1680

taattaaatc tttttgccta agtacaaaca ctatttgggg tccctgtttt ggtgtagttt 1740

agggaagtca acccaaaata tttttgtcta caaatggaga gagtatttac tctttaagta 1800

ctgctattaa atttcaattc aaca 1824

<210> 3

<211> 1439

<212> DNA

<213> 胚特异表达启动子OsESP1

<400> 3

tatggaatta caaggacagc tgagcaaaga atgcacaccc tagtttatgc ttaaagatca 60

gttcagattt aggtgatgct gcactatcaa aattaccagg cctaacagct tagtgtgtat 120

ttaccaaaac tactatcaaa caccagattt cccatgttct tttatttata tcagataaaa 180

catttttttc tacgagtatg ccacaattgc caccaagtca gcaattgtcg tttctcttgt 240

tttaacgcat ttctttcaat tttagcatgg aaaacttcgc attcgagtgg gatggaacat 300

agcatataat tcgataatgc atgttttgca tctctgaaga ttgtggaaat ttgcattaga 360

tgcatagatt ggttgctttg gtgtgatttt tttcccaatg ctttctcgtg ctagtaattt 420

accatcatgt gttattcatt catgatatgc tccattttaa taaaagctgc taatgttggg 480

ccatgaacta aaattctgac caggtaaaat tgttaggcca gtttctcact atatcaagtc 540

aatggtacat gccatgttgg gctttttgga tgcaaatgtc tcagaaagaa agaaagaatt 600

gatctgccta tccagtaaaa aaatggtccg cttgtgcctt ttcctgcctt atagtgattg 660

gaatgaaatg cctaagatgc taaaattggc caattattct tcccaatagt gacaaatccc 720

ttgttaacac catatattgt tcctctttgc ggttttccta ttccagagga aatccctcct 780

tatttcagta tgcatgtact ttttgtcgtt ttattcatga cattatcagc atgccaggga 840

tgaaagtaaa tcactggtca tagcaagtcc acgttgatca aaacaatagc tttccagccg 900

aatggtgtca tttccctaac ttggaaagtg atagtataat tgatgaggag aaaagatgaa 960

aaagtcatca gttttagcta tatatagcgc tattgagata aagatgtttg gccagtttgg 1020

tgtcatacca acagtacatg actgctaggt agttgactgt cctcatcagt tttggtgcaa 1080

taaattgaaa gatctcactg gcaaacacat tattcttcct gtttctaaac aaatctaatt 1140

accacagtga aaactgcaaa agcggaaagg ttacgatgga aaccagagca ccatggatat 1200

tcttcaatct ttactcaagg tatccatcct tattgcgatt ttgtttgttc agtatgttca 1260

tattaatcat ttccttatgt tcacctgtct attcttctgg ggcagtgctt gaagataaga 1320

aattgaactg caagcattct atgctcatat taatcatttc cttatgtata tctgtctttt 1380

cttcagggat agtgcttgaa gataagaaat gaaccacaag cattctttct ctgccctct 1439

<210> 4

<211> 678

<212> DNA

<213> 红色荧光蛋白基因DsRed2

<400> 4

atggcctcct ccgagaacgt catcaccgag ttcatgcgct tcaaggtgcg catggagggc 60

accgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg agggccgccc ctacgagggc 120

cacaacaccg tgaagctgaa ggtgaccaag ggcggccccc tgcccttcgc ctgggacatc 180

ctgtcccccc agttccagta cggctccaag gtgtacgtga agcaccccgc cgacatcccc 240

gactacaaga agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag 300

gacggcggcg tggcgaccgt gacccaggac tcctccctgc aggacggctg cttcatctac 360

aaggtgaagt tcatcggcgt gaacttcccc tccgacggcc ccgtgatgca gaagaagacc 420

atgggctggg aggcctccac cgagcgcctg tacccccgcg acggcgtgct gaagggcgag 480

acccacaagg ccctgaagct gaaggacggc ggccactacc tggtggagtt caagtccatc 540

tacatggcca agaagcccgt gcagctgccc ggctactact acgtggacgc caagctggac 600

atcacctccc acaacgagga ctacaccatc gtggagcagt acgagcgcac cgagggccgc 660

caccacctgt tcctgtag 678

<210> 5

<211> 278

<212> DNA

<213> Nos终止子

<400> 5

ggtgaccagc tcgaatttcc ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt 60

gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca 120

tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt 180

cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa 240

attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agatcggg 278

<210> 6

<211> 2960

<212> DNA

<213> 表达盒E2

<400> 6

aaatgttcct cgctgacgta agaagacatt agtaatggtt ataatatata gctttctatg 60

aatgtatggt gagaaaatgt ctgttcactg attttgagtt tggaataaaa gcatttgcgt 120

ttggtttatc attgcgttta tacaaggaca gagatccact gagctggaat agcttaaaac 180

cattatcaga acaaaataaa ccattttttg ttaagaatca gagcatagta aacaacagaa 240

acaacctaag agaggtaact tgtccaagaa gatagctaat tatatctatt ttataaaagt 300

tatcatagtt tgtaagtcac aaaagatgca aataacagag aaactaggag acttgagaat 360

atacattctt gtatatttgt attcgagatt gtgaaaattt gaccataagt ttaaattctt 420

aaaaagatat atctgatcta gatgatggtt atagactgta attttaccac atgtttaatg 480

atggatagtg acacacatga cacatcgaca acactatagc atcttattta gattacaaca 540

tgaaattttt ctgtaataca tgtctttgta cataatttaa aagtaattcc taagaaatat 600

atttatacaa ggagtttaaa gaaaacatag cataaagttc aatgagtagt aaaaaccata 660

tacagtatat agcataaagt tcaatgagtt tattacaaaa gcattggttc actttctgta 720

acacgacgtt aaaccttcgt ctccaatagg agcgctactg attcaacatg ccaatatata 780

ctaaatacgt ttctacagtc aaatgcttta acgtttcatg attaagtgac tatttaccgt 840

caatcctttc ccattcctcc cactaatcca actttttaat tactcttaaa tcaccactaa 900

gcttcgaatc catccaaaac cacaatataa aaacagaact ctcgtaactc aatcatcgca 960

aaacaaaaca aaacaaaaca aaaaccccaa aaagaaagaa taatggcctc catcaccaac 1020

tggctcggct tctcctcctc ctccttctcc ggcgccggcg ccgaccccgt cctgccccac 1080

ccgccgctgc aagagtgggg gagcgcttat gagggcggcg gcacggtggc ggccgccggc 1140

ggggaggaga cggcggcgcc gaagctggag gacttcctcg gcatgcaggt gcagcaggag 1200

acggccgccg cggcggcggg gcacggccgt ggaggcagct cgtcggtcgt tgggctgtcc 1260

atgatcaaga actggctacg cagccagccg ccgcccgcgg tggttggggg agaagacgct 1320

atgatggcgc tcgcggtgtc gacgtcggcg tcgccgccgg tggacgcgac ggtgccggcc 1380

tgcatttcgc cggatgggat ggggtcgaag gcggccgacg gcggcggcgc ggccgaggcg 1440

gcggcggcgg cggcggcgca gaggatgaag gcggccatgg acacgttcgg gcagcggacg 1500

tccatctacc ggggtgtcac caagcacagg tggacaggaa ggtatgaagc ccatctttgg 1560

gataacagct gcagaagaga aggtcagact cgcaaaggca gacaagtcaa tgcaggagga 1620

tatgataagg aagaaaaagc tgctagggct tatgatttgg ctgcccttaa atactggggc 1680

actacaacga cgacgaattt tccggtaagc aactacgaaa aagagttgga tgaaatgaag 1740

cacatgaata ggcaggaatt tgttgcatcc cttagaagaa aaagcagtgg attttcacgt 1800

ggtgcttcca tatatcgtgg tgttacaaga caccatcagc atggaaggtg gcaagcaagg 1860

ataggacggg tggcaggaaa caaggatctg tatttgggca catttggcac ccaagaggaa 1920

gctgcagagg catatgatat cgctgcaatc aaattccgtg gtctcaatgc tgtgacaaac 1980

tttgacatga gccggtacga tgtcaagagc atcattgaaa gcagcaatct cccaattggt 2040

actggaacca cccggcgatt gaaggactcc tctgatcaca ctgataatgt catggacatc 2100

aatgtcaata ccgaacccaa taatgtggta tcatcccact tcaccaatgg ggttggcaac 2160

tatggttcgc agcattatgg ttacaatgga tggtcgccaa ttagcatgca gccgatcccc 2220

tcgcagtacg ccaacggcca gcccagggca tggttgaaac aagagcagga cagctctgtg 2280

gttacagcgg cgcagaacct gcacaatcta catcatttta gttccttggg ctacacccac 2340

aacttcttcc agcaatctga tgttccagac gtcacaggtt tcgttgatgc gccttcgagg 2400

tccagtgact catactcctt caggtacaat ggaacaaatg gctttcatgg tctcccgggt 2460

ggaatcagct atgctatgcc ggttgcgaca gcggtggacc aaggtcaggg catccatggc 2520

tatggagaag atggtgtggc aggcattgac accacacatg acctgtatgg cagccgtaat 2580

gtgtactacc tttccgaggg ttcgcttctt gccgatgtcg aaaaagaagg cgactatggc 2640

caatctgtgg ggggcaacag ctgggttttg ccgacaccgt agggtgacca gctcgaattt 2700

ccccgatcgt tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct 2760

tgcgatgatt atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta 2820

atgcatgacg ttatttatga gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta 2880

atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc 2940

atctatgtta ctagatcggg 2960

<210> 7

<211> 1002

<212> DNA

<213> 卵细胞特异启动子AtDD45

<400> 7

aaatgttcct cgctgacgta agaagacatt agtaatggtt ataatatata gctttctatg 60

aatgtatggt gagaaaatgt ctgttcactg attttgagtt tggaataaaa gcatttgcgt 120

ttggtttatc attgcgttta tacaaggaca gagatccact gagctggaat agcttaaaac 180

cattatcaga acaaaataaa ccattttttg ttaagaatca gagcatagta aacaacagaa 240

acaacctaag agaggtaact tgtccaagaa gatagctaat tatatctatt ttataaaagt 300

tatcatagtt tgtaagtcac aaaagatgca aataacagag aaactaggag acttgagaat 360

atacattctt gtatatttgt attcgagatt gtgaaaattt gaccataagt ttaaattctt 420

aaaaagatat atctgatcta gatgatggtt atagactgta attttaccac atgtttaatg 480

atggatagtg acacacatga cacatcgaca acactatagc atcttattta gattacaaca 540

tgaaattttt ctgtaataca tgtctttgta cataatttaa aagtaattcc taagaaatat 600

atttatacaa ggagtttaaa gaaaacatag cataaagttc aatgagtagt aaaaaccata 660

tacagtatat agcataaagt tcaatgagtt tattacaaaa gcattggttc actttctgta 720

acacgacgtt aaaccttcgt ctccaatagg agcgctactg attcaacatg ccaatatata 780

ctaaatacgt ttctacagtc aaatgcttta acgtttcatg attaagtgac tatttaccgt 840

caatcctttc ccattcctcc cactaatcca actttttaat tactcttaaa tcaccactaa 900

gcttcgaatc catccaaaac cacaatataa aaacagaact ctcgtaactc aatcatcgca 960

aaacaaaaca aaacaaaaca aaaaccccaa aaagaaagaa ta 1002

<210> 8

<211> 1680

<212> DNA

<213> 胚自主发生基因选自BBM1

<400> 8

atggcctcca tcaccaactg gctcggcttc tcctcctcct ccttctccgg cgccggcgcc 60

gaccccgtcc tgccccaccc gccgctgcaa gagtggggga gcgcttatga gggcggcggc 120

acggtggcgg ccgccggcgg ggaggagacg gcggcgccga agctggagga cttcctcggc 180

atgcaggtgc agcaggagac ggccgccgcg gcggcggggc acggccgtgg aggcagctcg 240

tcggtcgttg ggctgtccat gatcaagaac tggctacgca gccagccgcc gcccgcggtg 300

gttgggggag aagacgctat gatggcgctc gcggtgtcga cgtcggcgtc gccgccggtg 360

gacgcgacgg tgccggcctg catttcgccg gatgggatgg ggtcgaaggc ggccgacggc 420

ggcggcgcgg ccgaggcggc ggcggcggcg gcggcgcaga ggatgaaggc ggccatggac 480

acgttcgggc agcggacgtc catctaccgg ggtgtcacca agcacaggtg gacaggaagg 540

tatgaagccc atctttggga taacagctgc agaagagaag gtcagactcg caaaggcaga 600

caagtcaatg caggaggata tgataaggaa gaaaaagctg ctagggctta tgatttggct 660

gcccttaaat actggggcac tacaacgacg acgaattttc cggtaagcaa ctacgaaaaa 720

gagttggatg aaatgaagca catgaatagg caggaatttg ttgcatccct tagaagaaaa 780

agcagtggat tttcacgtgg tgcttccata tatcgtggtg ttacaagaca ccatcagcat 840

ggaaggtggc aagcaaggat aggacgggtg gcaggaaaca aggatctgta tttgggcaca 900

tttggcaccc aagaggaagc tgcagaggca tatgatatcg ctgcaatcaa attccgtggt 960

ctcaatgctg tgacaaactt tgacatgagc cggtacgatg tcaagagcat cattgaaagc 1020

agcaatctcc caattggtac tggaaccacc cggcgattga aggactcctc tgatcacact 1080

gataatgtca tggacatcaa tgtcaatacc gaacccaata atgtggtatc atcccacttc 1140

accaatgggg ttggcaacta tggttcgcag cattatggtt acaatggatg gtcgccaatt 1200

agcatgcagc cgatcccctc gcagtacgcc aacggccagc ccagggcatg gttgaaacaa 1260

gagcaggaca gctctgtggt tacagcggcg cagaacctgc acaatctaca tcattttagt 1320

tccttgggct acacccacaa cttcttccag caatctgatg ttccagacgt cacaggtttc 1380

gttgatgcgc cttcgaggtc cagtgactca tactccttca ggtacaatgg aacaaatggc 1440

tttcatggtc tcccgggtgg aatcagctat gctatgccgg ttgcgacagc ggtggaccaa 1500

ggtcagggca tccatggcta tggagaagat ggtgtggcag gcattgacac cacacatgac 1560

ctgtatggca gccgtaatgt gtactacctt tccgagggtt cgcttcttgc cgatgtcgaa 1620

aaagaaggcg actatggcca atctgtgggg ggcaacagct gggttttgcc gacaccgtag 1680

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> PAIR1突变的靶标序列R1

<400> 9

ggtgaggagg ttgtcgtcga ggg 23

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> PAIR1突变的靶标序列R2

<400> 10

aagcaaccca gtgcaccgct gg 22

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> REC8突变的靶标序列C1

<400> 11

gtgtggcgat cgtgtacgag agg 23

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> REC8突变的靶标序列C2

<400> 12

cccatggcac taaggctctc cg 22

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> OSD1突变的靶标序列D1

<400> 13

gcgctcgccg acccctcggg tgg 23

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> OSD1突变的靶标序列R1

<400> 14

ctgccgccga cgagcaacaa gg 22

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> DsRed2基因扩增正向引物

<400> 15

cccagttcca gtacggctcc aag 23

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> DsRed2基因扩增反向引物

<400> 16

ctcgttgtgg gaggtgatgt ccag 24