一种分离瑞巴派特与间氯瑞巴派特的色谱分析方法

技术领域

本发明涉及一种分离瑞巴派特与间氯瑞巴派特的分析方法，尤其涉及一种利用反相高效液相色谱分离瑞巴派特与间氯瑞巴派特的分析方法。

背景技术

瑞巴派特的化学名称为：(2RS)-2-(4-氯苯甲酰胺基)-3-[2-氧代-1,2-二氢-4-喹啉基]丙酸；分子式为：C

间氯瑞巴派特，分子式为C

间氯瑞巴派特与瑞巴派特属于邻间位化合物，化学性质相似，在液相普通色谱条件下出峰重合。因此，开发一种检测灵敏度高，能将间氯瑞巴派特与瑞巴派特峰有效分离的分析方法显得尤为重要。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种灵敏度高、能有效分离瑞巴派特与间氯瑞巴派特峰的分析方法。

技术方案：本发明的瑞巴派特与间氯瑞巴派特的分离检测方法包括以下步骤：

(1)制备系统测试液：取瑞巴派特及间氯瑞巴派特适量用二甲基亚砜溶解并稀释，得到瑞巴派特浓度为0.5mg/ml，间氯瑞巴派特为0.5μg/ml的系统测试液；

(2)色谱柱固定相为十八烷基键合硅胶；采用紫外吸收检测器；流动相A为磷酸盐溶液，流动相B为甲醇-四氢呋喃混合溶液；洗脱方式为梯度洗脱；

(3)采用带二极管阵列检测器的反相高效液相色谱对系统测试液进行检测；

(4)按面积归一化计算单个杂质和总杂质的含量。

优选的，步骤(2)中，色谱柱的规格：色谱柱的规格：内径为4.0～5.0mm长度为100～250mm，填料粒径为2～5μm。进一步地，色谱柱的规格：内径4.6mm，长度250mm，填料粒径为5μm。

进一步的，色谱柱为Thermo scientific Hypersil GOLD

优选的，色谱柱柱温为20-50℃，进一步地，色谱柱柱温优选为30℃。

优选的，步骤(2)中，流动相A中的磷酸盐溶液为磷酸氢二钾溶液。

优选的，步骤(2)中，流动相A中的磷酸盐溶液pH＝5.5～6，优选pH＝6.0。

优选的，步骤(2)中，流动相A中的磷酸氢二钾溶液的浓度为0.01mol/L，进一步的，流动相A的pH＝6.0。

优选的，步骤(2)中，流动相B中甲醇-四氢呋喃的比例为固定值60:40。

进一步的，步骤(3)中，进样量为1～10μl，优选为5μl。进一步的，步骤(3)中，进样流速为1～1.5ml/min，优选1.0ml/min。

进一步的，紫外吸收检测器的波长为235nm。

进一步的，梯度洗脱程序如表1所示；

表1梯度洗脱程序

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：本发明能有效分离间氯瑞巴派特与瑞巴派特峰，检测时间短，同时保证检测的特异性、准确度和灵敏度，本发明方法检测结果准确、可靠，为控制瑞巴派特中的间氯瑞巴派特的质量研究提供了方法，能高效准确的分离检测化合物瑞巴派特和间氯瑞巴派特。

附图说明

图1为实施例1中对系统测试液的检测图谱；

图2为实施例1中对间氯瑞巴派特的检测图谱；

图3为实施例2中对系统测试液的检测图谱；

图4为实施例2中对间氯瑞巴派特的检测图谱；

图5为实施例3中对系统测试液的检测图谱；

图6为实施例3中对间氯瑞巴派特的检测图谱；

图7为实施例4中进样量10μl对系统测试液的检测图谱

图8为实施例4中进样量1μl对系统测试液的检测图谱；

图9为实施例5中对系统测试液的检测图谱；

图10为实施例6中流动相1对系统测试液的检测图谱；

图11为实施例6中流动相2对系统测试液的检测图谱；

图12为实施例6中流动相3对系统测试液的检测图谱；

图13为实施例7中梯度a对系统测试液的检测图谱；

图14为实施例7中梯度b对系统测试液的检测图谱；

图15为实施例7中梯度c对系统测试液的检测图谱；

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1

高效液相色谱检测方法

采用反相高效液相色谱进行检测：

高效液相色谱仪(型号：Thermo U3000，生产厂家：Thermo)

色谱柱：色谱柱型号：Agilent ZORBAX SB-Phenyl；色谱柱的规格：内径为4.6mm，长度为250mm，填料粒径为5μm；

流动相：0.1％高氯酸溶液为流动相A，甲醇为流动相B；

采用梯度洗脱；

检测波长：235nm；

柱温：30℃；

流速：1.0ml/min；

进样量：10μl；

制备系统测试液：取瑞巴派特及间氯瑞巴派特适量用稀释剂(pH6.5磷酸盐缓冲液-甲醇-四氢呋喃(60：36：40))溶解并稀释，得到瑞巴派特浓度为0.5mg/ml，间氯瑞巴派特为5μg/ml的系统测试液；

制备杂质定位溶液：分别取间氯瑞巴派特适量用稀释剂(pH6.5磷酸盐缓冲液-甲醇-四氢呋喃(60：36：40))溶解并稀释，得到杂质浓度为5μg/ml的定位溶液；

检测结果见附图1-2，间氯瑞巴派特与瑞巴派特峰重合。

实施例2

高效液相色谱检测方法

采用反相高效液相色谱进行检测：

色谱柱：色谱柱型号：ACE Ultracore 5SuperPhenylHexyl(4.6×250mm)；色谱柱的规格：内径为4.6mm，长度为250mm，填料粒径为5μm；

流动相：0.1％高氯酸溶液为流动相A，甲醇为流动相B；；

采用梯度洗脱；

检测波长：235nm；

柱温：30℃；

流速：1.0ml/min；

进样量：10μl；

制备系统测试液：取瑞巴派特及间氯瑞巴派特适量用稀释剂(pH6.5磷酸盐缓冲液-甲醇-四氢呋喃(60：36：40))溶解并稀释，得到瑞巴派特浓度为0.5mg/ml，间氯瑞巴派特为5μg/ml的系统测试液；

制备杂质定位溶液：分别取间氯瑞巴派特适量用稀释剂(pH6.5磷酸盐缓冲液-甲醇-四氢呋喃(60：36：40))溶解并稀释，得到杂质浓度为5μg/ml的定位溶液；

检测结果见附图3-4，间氯瑞巴派特与瑞巴派特峰重合。

实施例3

高效液相色谱检测方法

采用反相高效液相色谱进行检测：

色谱柱：色谱柱型号：YMC-Pack ODS-A；色谱柱的规格：内径为4.6mm，长度为250mm，填料粒径为5μm；

流动相：0.01mol/L庚烷磺酸钠溶液(pH＝1.5)为流动相A，甲醇为流动相B；

采用梯度洗脱；

检测波长：235nm；

柱温：40℃；

流速：1.0ml/min；

进样量：10μl；

制备系统测试液：取瑞巴派特及间氯瑞巴派特适量用稀释剂(pH6.5磷酸盐缓冲液-甲醇-四氢呋喃(60：36：40))溶解并稀释，得到瑞巴派特浓度为0.5mg/ml，间氯瑞巴派特为5μg/ml的系统测试液；

制备杂质定位溶液：分别取间氯瑞巴派特适量用稀释剂(pH6.5磷酸盐缓冲液-甲醇-四氢呋喃(60：36：40))溶解并稀释，得到杂质浓度为5μg/ml的定位溶液；

检测结果见附图5-6，间氯瑞巴派特与瑞巴派特峰重合。

实施例4

高效液相色谱检测方法

采用反相高效液相色谱进行检测：

色谱柱：色谱柱型号：Supelco Ascentis Express 90A C18；色谱柱的规格：内径为4.6mm，长度为150mm，填料粒径为2.7μm；

流动相：0.01mol/L磷酸氢二钾溶液(pH＝5.5)为流动相A，甲醇为流动相B；

采用梯度洗脱；

检测波长：235nm；

柱温：40℃；

流速：1.0ml/min；

进样量：10μl、1μl；

制备系统测试液：取瑞巴派特及间氯瑞巴派特适量，用二甲基亚枫溶解并稀释，得到瑞巴派特浓度为0.5mg/ml，间氯瑞巴派特为5μg/ml的系统测试液；

制备杂质定位溶液：分别取间氯瑞巴派特适量用二甲基亚枫溶解并稀释，得到杂质浓度为5μg/ml的定位溶液；

检测结果见附图7-8，进样量1μl，间氯瑞巴派特与瑞巴派特峰的分离有所改善。

实施例5

高效液相色谱检测方法

采用反相高效液相色谱进行检测：

色谱柱：色谱柱型号：Thermo scientific Hypersil GOLD

流动相：0.01mol/L磷酸氢二钾溶液(pH＝6.0)为流动相A，甲醇-四氢呋喃(60:40)为流动相B；

采用梯度洗脱；

检测波长：235nm；

柱温：30℃；

流速：1.0ml/min；

进样量：5μl；

制备系统测试液：取瑞巴派特及间氯瑞巴派特适量用二甲基亚枫溶解并稀释，得到瑞巴派特浓度为0.5mg/ml，间氯瑞巴派特为5μg/ml的系统测试液；

检测结果见附图9，其中RT＝14.020min为间氯瑞巴派特的峰，RT＝14.360min为瑞巴派特的峰，间氯瑞巴派特与瑞巴派特峰的分离度为1.62，能有效分离。

实施例6

高效液相色谱检测方法

采用反相高效液相色谱进行检测：

不同流动相的对比

在保障其他检测条件一致的前提下，仅改变流动相B中甲醇-四氢呋喃的比例，观察加入不同比例的四氢呋喃对整个分析方法的影响。

色谱柱：色谱柱型号：Thermo scientific Hypersil GOLD

检测波长：235nm

流动相1：0.01mol/L磷酸氢二钾溶液(pH＝6.0)为流动相A，甲醇-四氢呋喃(80:20)为流动相B；

流动相2：0.01mol/L磷酸氢二钾溶液(pH＝6.0)为流动相A，甲醇-四氢呋喃(60:40)为流动相B；

流动相3：0.01mol/L磷酸氢二钾溶液(pH＝6.0)为流动相A，甲醇-四氢呋喃(40:60)为流动相B；

采用梯度洗脱；

柱温：30℃

流速：1.0ml/min；

进样量：5μl；

制备系统测试液：取瑞巴派特及间氯瑞巴派特适量用二甲基亚砜溶解并稀释，得到瑞巴派特浓度为0.5mg/ml，其他杂质为5μg/ml的系统测试液；

检测结果见附图10-12，结果发现：采用流动相2间氯瑞巴派特与瑞巴派特峰的分离度优于流动相1，采用流动相3,间氯瑞巴派特与瑞巴派特峰的分离较流动相2未有明显改善，且峰形较差，故流动相2为最优选择。

实施例7

高效液相色谱检测方法

采用反相高效液相色谱进行检测：

不同梯度之间的对比

在保障其他检测条件一致的前提下，仅改变梯度，观察梯度对整个分析方法的影响。

色谱柱：色谱柱型号：Thermo scientific Hypersil GOLD

检测波长：235nm

流动相：0.01mol/L磷酸氢二钾溶液(pH＝6.0)为流动相A，甲醇-四氢呋喃(60:40)为流动相B；

梯度a；

梯度b；

梯度c；

柱温：30℃

流速：1.0ml/min；

进样量：5μl；

制备系统测试液：取瑞巴派特及间氯瑞巴派特适量用二甲基亚砜溶解并稀释，得到瑞巴派特浓度为0.5mg/ml，其他杂质为5μg/ml的系统测试液；

检测结果见附图13-15，结果发现：采用梯度c色谱条件下色谱峰峰形分离度优于梯度a和梯度b，梯度c色谱条件下，间氯瑞巴派特与瑞巴派特峰的分离度为1.62，故梯度c为最优选择。

综上所述，本发明采用磷酸氢二钾溶液为流动相A，以甲醇-四氢呋喃(60:40)为流动相B，对瑞巴派特进行梯度洗脱，间氯瑞巴派特与瑞巴派特峰分离度良好，本发明方法检测结果准确、可靠，为控制瑞巴派特中的间氯瑞巴派特的质量研究提供了方法，高效准确的分离检测瑞巴派特和间氯瑞巴派特。