一种鉴别水生鞘翅目泥甲科东方泥甲属昆虫的DNA条形码、引物对、试剂盒及方法

技术领域

本发明属物种鉴别领域，尤其涉及一种鉴别水生鞘翅目泥甲科东方泥甲属昆虫的DNA条形码、引物对、试剂盒及方法。

背景技术

泥甲科(Dryopidae)是Billberg于1820年建立，Junk和Schenkling(1910， 1914)发表了覆盖范围较广的泥甲科昆虫名录；Brown(1981)发表了关于泥甲科各属的世界分布调查，根据该调查，东洋界和新热带界泥甲科种类最为丰富；Kodada和

泥甲科昆虫对生境变化较敏感，既可应用于水质监测，如监测水利设施建设对水生生物的影响，又可应用于对河流水量变化的适应性研究。同时，泥甲科昆虫在生理学及生物进化方面也有重要研究价值。因此，研究泥甲科昆虫的种类及分布具有重要意义。

然而，目前对泥甲科昆虫的鉴定主要依靠经验丰富的昆虫分类学家根据成虫的形态学特征来实现。这种方法需要大量、长期、细致的工作，是一件费时费力的事。许多种属的形态差异细微，只有长期从事该工作的专业人员才有可能胜任这项工作。对于在不同生长季的泥甲科昆虫鉴定的结果往往存在较大偏差。特别是，对形态不完整的标本、不同虫态就更难以辨别和鉴定。此外，形态学鉴定的人为因素很强，不同研究者的鉴定结果可能存在差异，使得鉴定难以标准化，在调查过程中很容易导致某些物种的遗漏，亟需寻求一种新的快捷准确的方法，来弥补泥甲科昆虫传统形态学分类方法的不足。

DNA条形码(DNA Barcoding)技术是通过一段或几段短的、通用的标准DNA 序列对物种进行识别和鉴定的技术。作为传统分类的有效补充，DNA条形码技术在物种分类与鉴定、生物多样性调查与监测、分子系统发育与进化等方面已得到广泛应用。昆虫的线粒体DNA(mtDNA)平均进化速率是单拷贝核DNA的1～2 倍，已成为昆虫分子系统学研究中应用最为广泛的遗传物质之一，主要用于群体水平和近缘种类之间的比较。线粒体细胞色素c氧化酶I基因(CO I)是mtDNA 的13个蛋白质编码基因之一，长度大约700～900bp，编码200～300个氨基酸，具有足够的变异性以区分不同的物种，同时具有相对的保守性，易于设计通用引物。迄今为止，已有诸多研究证明CO I基因在鸟类、鱼类、鳞翅目昆虫、蚁类等类群的分类鉴定中行之有效。然而，目前国内外尚无利用DNA条形码作为分子标记鉴定泥甲科昆虫的报道。

东方泥甲属(Elmomorphus)是泥甲科中种类较多的一个属，本发明首次通过泥甲科东方泥甲属昆虫的DNA条形码，扩增测定其线粒体DNA的CO I基因序列，根据序列特征对比进行物种鉴别。该方法弥补了传统形态鉴定的诸多不足，科学有效，快速准确，是具有通用性的分子生物学鉴定工具，可以更好地为不同层次、不同目标人群服务。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种鉴别水生鞘翅目泥甲科东方泥甲属昆虫的 DNA条形码、引物对、试剂盒及方法，解决了该属形态鉴定困难的问题，方法科学有效，快捷准确。

为解决上述技术问题，本发明是这样实现的：

一种鉴别水生鞘翅目泥甲科东方泥甲属昆虫的DNA条形码，其特征在于：所述DNA条形码为线粒体细胞色素c氧化酶I基因(COI)。

一种用于扩增线粒体细胞色素c氧化酶I基因(COI)DNA条形码的引物对。

作为一种优选方案，本发明所述引物对中的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如下所示：

正向引物5'-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3'；

反向引物5'-CAACATTTATTTTGATTTTTTGG-3'。

一种鉴别水生鞘翅目泥甲科东方泥甲属昆虫试剂盒，包含本发明所述的引物对。

鉴别水生鞘翅目泥甲科东方泥甲属昆虫的方法，包括如下步骤：

(1)从待测的泥甲科昆虫组织中分离提取DNA；

(2)以步骤(1)所述DNA为模板，利用引物对通过PCR反应扩增出线粒体细胞色素c氧化酶I基因(COI)；所述引物对的正向引物 5'-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3，引物对的反向引物 5'-CAACATTTATTTTGATTTTTTGG-3'。

(3)取步骤(2)所述线粒体细胞色素c氧化酶I基因(COI)，用琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯观察，根据扩增产物的大小判定结果，若能特异性扩增出 840bp左右的条带，进行测序；

(4)测序结果通工校对、序列拼接，将已确定是所需要的序列用BioEdit 软件的Clustal W分别进行序列对位排列分析，如果所述基因序列的比对同源性在98％以上，即可判断所述的待测昆虫为同一种，反之则为不同种。

进一步地，本发明所述步骤(1)中，泥甲科昆虫组织为成虫、幼虫或不完整标本。

进一步地，本发明所述步骤(2)中，PCR反应条件如下：循环前94℃预变性5min，每个循环包括94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸60s，共设35 个循环，循环结束后72℃延伸10min，4℃保存。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1、本发明能对泥甲科东方泥甲属昆虫不同生物型以及幼虫、残缺个体进行鉴定，克服了形态鉴定的困难，缩短了鉴定的周期；

2、本方法对使用的仪器设备要求较低，无需复杂的技术步骤和昂贵的实验试剂，对鉴定人员的专业知识要求不高，比传统的依赖成虫尾器鉴定泥甲科昆虫的方法更准确可靠，又可节省时间。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。本发明的保护范围不仅局限于下列内容的表述。

图1为本发明6种泥甲科昆虫基因组DNA的凝胶电泳图；

图2为本发明COⅠ序列PCR扩增电泳图；

图3为本发明利用COI序列基于Kimura双参数构建的邻近树；

图4-1为本发明COⅠ序列比对图；

图4-2为本发明COⅠ序列比对图。

具体实施方式

基于DNA条形码的泥甲科东方泥甲属昆虫的鉴别方法，其步骤是：

(1)动物组织DNA提取试剂盒从待测的泥甲科昆虫组织中(成虫、幼虫或不完整标本)分离提取DNA，提取的DNA经0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测，要求： OD260/280在1.8～2.0之间，OD260/230在2.0左右；

(2)利用线粒体CO I基因的通用引物：正向引物 5'-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3'，反向引物5'-CAA CAT TTATTT TGATTTTTTGG-3'，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出CO I基因；

(3)PCR反应体系为25μL，其中模板DNA 1μL(约50ng)，正反向引物各0.5μL(10μM)，10×PCR buffer 2μL，dNTP 2μL(2mM)，rTaq 0.2 μL(5U/μL)，加去离子H2O至25μL。反应条件如下：循环前94℃预变性5 min，每个循环包括94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸60s，共设35个循环，循环结束后72℃延伸10min，4℃保存；

(4)扩增产物经1.2％浓度的琼脂糖凝胶电泳观察检测，如果能特异性扩增出840bp左右的条带，送生物公司测序；

(5)测序结果通过手工校对、序列拼接，将已确定是所需要的序列用 BioEdit软件的Clustal W分别进行序列对位排列分析，如果所述基因的序列同源性在98％以上，即可判断所述的待测昆虫为同一种，反之则为不同种。

实施例l

基于DNA条形码鉴别泥甲科东方泥甲属不同种的方法，包括如下步骤：

(1)样品的采集及保存

采集水甲虫成虫主要以网捕为主，对于不同的水环境采用不同的采集策略。一般在水很深且不流动的池塘中，只站在水边将捕虫网伸入水中搅动，将搅动起的淤泥及枯枝落叶一同收进网中，而后置于阳光下观看，待昆虫从淤泥中爬出后，将其放入有乙酸乙酯的毒瓶中；在小溪中采集时，则穿水鞋进入水中采集，可一手翻动石块，一手持捕虫网在下游截住翻起的泥沙等混浊物，将网提起后先观察其内壁(水甲虫很可能挂在网壁上)，而后再等待淤泥中的水甲虫爬出来，同样放入乙酸乙酯中。

(2)形态学鉴定

使用OLYMPUS的SZX16体式显微镜观察标本。标本尾器照片使用OLYMPUS BX51显微镜，尾器拍照前至少在乳酸中浸泡3至6个小时。

(3)泥甲科昆虫基因组DNA的提取

分别选取泥甲科不同属、种的6个样品(表1)，每种3头，取待测泥甲科昆虫虫体的全部，采用动物组织DNA抽提试剂盒(天根生化科技有限公司)，提取总基因组DNA。经0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，提取的DNA完整， OD260/280均在1.8～2.0之间，OD260/230在2.0左右。

表1 6种泥甲科昆虫及采集地信息

(4)CO I基因片度的扩增和测序

利用步骤(2)中泥甲科昆虫线粒体CO I基因的通用引物：正向引物 5'-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3'，反向引物5'-CAACAT TTATTT TGATTTTTTGG-3'，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出CO I基因；PCR反应体系如下：总体系为25μL，其中模板DNA 1μL(约50ng)，正反向引物各0.5μ L(10μM)，10×PCR buffer 2μL，dNTP 2μL(2mM)，rTaq 0.2μL(5U/μ L)，加去离子H2O至25μL；PCR反应条件如下：循环前94℃预变性5min，每个循环包括94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸60s，共设35个循环，循环结束后72℃延伸10min，4℃保存；

扩增产物经1.2％浓度的琼脂糖凝胶电泳观察检测，特异性扩增出842bp的条带(图2所示)，用宝生物(大连)技术有限公司的试剂盒回收CO I扩增片段，回收产物送往华大基因公司进行双向测序，测序结果见附图4。

(5)测序结果的分析比对

将测得的序列导入Bio Edit软件，查找并标记若干插入位点两端50bp内的短序列，手动去除明显的载体序列，表2利用Bio Edit分析序列的长度及核苷酸GC含量，显示了细胞色素氧化酶亚基Ⅰ基因长842bp，单链的平均分子量为254 712Dals，序列有明显的A+T的倾向，平均为66.52％。

表2所测序的COⅠ序列的碱基组成(Mol％)

用BioEdit软件的Clustal W分别进行序列对位排列分析，对比结果见附图。如果基因序列的比对同源性在98％以上，即可判断所述的待测昆虫即为同一种种，反之则为不同种。表3显示了6种泥甲科昆虫COⅠ基因序列的相似性比对，可以看出：E.tongisp.n.(female)与E.tongisp.n.(male)相似性最高，达99.05，与E.lichuanensis sp.n.、E.longnanensis sp.n.、E.ganzhouensis sp.n.次之，与 S.jiangjinensis sp.n.最低。

用MEGA 3.1构建邻近系统树(图3)，从系统发育树可以看出，E.tongi sp. n.(female)与E.tongi sp.n.(male)亲缘关系最近，属于同一个种，而与E.lichuanensissp.n.、E.longnanensis sp.n.次之，属于不同种，与S.jiangjinensis sp.n.最低，属于不同属，这与之前形态分类学鉴定结果一致。

综上，表明本发明涉及的泥甲科东方泥甲属昆虫DNA条形码基因序列，可以用于该物种的快速准确鉴别。

表3 CO1基因序列的相似性比对

1-6：E.tongi sp.n.(female)、E.tongi sp.n.(male)、E.ganzhouensis sp.n.、E.lichuanensis sp.n.、E.longnanensis sp.n.、 S.jiangjinensis sp.n.

可以理解地是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。