便携式压力与精神疾病客观指标评估试纸条及方法

技术领域

本发明涉及体外诊断领域，具体为便携式压力与精神疾病客观指标评估试纸条及使用方法。

背景技术

皮质醇，亦称氢化可的松，是从肾上腺皮质中提取出的是对糖类代谢具有调节作用的糖皮质激素的一种，参与调解人的日常节律，在应激反应和压力调控中通过HPA轴的负反馈机制维持人体内分泌和戒律稳态。DHEA/DHEAS为皮质醇的前体小分子，其血液浓度与皮质醇存在相关性，可以联合使用于与应激、长期压力相关的内分泌失调的诊断，大量国内外研究表明其与焦虑、抑郁等压力相关的精神疾病有着密切关系。与传统的自评、他评量表以及医生问诊相比，生物标志物及标志物组合的血液或尿液检测可以较大程度减少主观意识对检测结果的影响，克服专业医生不足，医疗资源紧缺等在精神压力和疾病诊断及普查中的常见问题。

目前皮质醇和DHEA/DHEAS等压力调节激素的检测都基于酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒(例如中国专利CN102520165B和CN111351945A以及部分上市产品)，操作较为复杂，且反应时间通常为6-24h。这类检测试剂盒有较好的检测灵敏度，然而人工操作成分较多，实验步骤较为复杂，读值设备较为昂贵，难以保障检测精密度和时效性，在试剂盒运输、保存和应用推广中也存在困难。

在现有的免疫层析技术中，基于胶体金的可视化定性及半定量方法已经较为成熟，通过肉眼观察红色检测条带(T线)即可大概评估被测蛋白的对应浓度，在验孕、排卵等大分子蛋白检测方面与ELISA方法相比有明显优势。然而对于本项目涉及的激素小分子来说，胶体金免疫层析技术无法达到临床所需检测灵敏度，更无法进行精准定量，得出稳定的检测结果。

量子点是一种纳米级半导体发光材料，通常由II～VI族或III～V族元素组成其核心结构，具有发光强度大，热稳定性好，抗光漂能力强等特点。量子点材料的颗粒大小、均一性、核壳结构的组成以及表面修饰对发光波长以及免疫层析试剂的性能有较明显的影响。

有部分研究使用不同粒径(发光波长)的量子点作为多联检的不同检测指标的标记材料，虽然在克服干扰，提高检测准确度方面有较好的效果，但是不同发光波长的量子点所适合的免疫荧光分析仪中的光学组件有所区别，为达到理想的检测灵敏度以及明显的区分度，需要设备硬件光学模块和软件参数进行配合，导致设备体积和成本大幅上升，不适于便携式移动检测。

因此，考虑以上现有技术存在的缺陷以及具体使用需求，本发明提出了针对性的改进。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供便携式压力与精神疾病客观指标评估试纸条和使用方法，以解决上述现有方法学的技术和应用问题。

本发明的技术方案如下：便携式压力与精神疾病客观指标评估试纸条，包括玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜、吸水纸、PVC板以及封闭盒盖；

所述PVC板设于封闭盒盖中，所述玻璃纤维素膜、硝酸纤维素膜以及吸水纸设于PVC板上，所述硝酸纤维素膜的两端分别与玻璃纤维素膜和吸水纸连接；

所述玻璃纤维素膜靠近硝酸纤维素膜的一端设置喷探针区域，所述喷探针区域喷涂偶联探针和独立抗体探针，偶联探针为不同规格但同波长的量子点与特异性抗体偶联成的探针；

所述硝酸纤维素膜并列设有一条质控线以及至少一条检测线，所述质控线远离玻璃纤维素膜，所述检测线靠近玻璃纤维素膜；

所述检测线喷涂与检测特异性探针结合的抗原，所述质控线喷涂与质控独立抗体探针结合的独立抗原。

作为优选的，所述量子点为聚合程度不同的多规格CdSe/ZnS核壳量子点，其发光波长依然为原料核壳量子点本身产生，几乎不受聚合程度影响。

作为优选的，所述特异性抗体为单独的皮质醇特异性抗体，或单独的DHEA特异性抗体，或单独的DHEAS特异性抗体，或皮质醇与DHEA/DHEAS二者之一，共计两种指标各自的特异性抗体。

作为优选的，所述特异性抗体包括针对目标小分子的兔IgG单抗或鼠IgG单抗。

作为优选的，其特征在于，所述检测线包括T1和T2，所述T1和T2分别喷涂与特异性抗体相对应的抗原。

作为优选的，所述独立抗体质控探针中的独立抗体为DNP-BSA抗体，所述质控线为C，所述独立抗原为DNP-BSA抗原。

作为优选的，所述封闭盒盖包括上盖和下盖，所述下盖内部放置PVC板，所述上盖开设通孔，所述通孔位于玻璃纤维素膜远离硝酸纤维素膜一端的上方。

作为优选的，所述上盖设置有透明观察窗，所述透明观察窗位于质控线和检测线上方。

便携式压力与精神疾病客观指标评估方法，包括上述便携式压力与精神疾病客观指标评估试纸条；

还包括如下步骤：

S1、在玻璃纤维素膜靠近硝酸纤维素膜一侧的喷探针区域喷涂检测特异性检测探针和独立质控抗体探针；

检测特异性抗体探针为不同规格但同波长的量子点与特异性抗体偶联成的探针，特异性抗体为单独的皮质醇特异性抗体，或单独的DHEA特异性抗体，或单独的DHEAS特异性抗体，或皮质醇与DHEA/DHEAS二者之一，共计两种指标各自的特异性抗体；

独立质控抗体探针中的抗体为DNP-BSA抗体；

S2、在硝酸纤维素膜设置两条检测线和一条质控线，分别为T1、T2和C，T1位于玻璃纤维素膜与T2之间，T2位于T1和C之间；

S3、在T1和T2上喷涂与检测特异性抗体探针相对应的抗原；在C上喷涂与DNP-BSA抗体相对应的DNP-BSA抗原；

S4、将5～20ul血液样本或尿液样本与稀释液混合形成60～80ul混合液，并将混合液在上盖的通孔位置滴加到玻璃纤维素膜上；

S5、等待反应时间为6～10分钟；

S6、用检测分析装置从透明观察窗读取质控线和检测线位置的荧光数据，根据检测线的荧光数据与质控线的荧光数据的比值

评估压力与精神疾病的检测结果。

采用上述各个技术方案，本发明最短6分钟内即可完成多指标的检测，层析完成后10分钟之内检测浓度变化不超过10％，一小时内不超过15％，具有较好的时间稳定性。对读取结果的时间准确性要求较低，使用方便、操作简单，成本低廉，能满足基层以及社康繁忙情况下的检测精准度要求。

同时，本发明结合了量子点发光强度高，荧光寿命长，粒径小的特征，与常规胶体金检测相比可以满足低浓度，特别是能够满足日常节律和压力调节相关皮质醇或DHEA/DHEAS激素小分子的竞争法定量检测，与ELISA检测法相比可以满足手持设备读取结果，甚至可以用验钞笔UV光源观察对比荧光条带亮度进行初步分析，达到在不同场景下压力和精神疾病的筛查和评估的目的。

附图说明

图1为本发明的结构示意图；

图2为本发明的多组测试数据的稳定性示意图；

图3为本发明的一条检测线检测结果示意图；

图4为本发明的两条检测线检测结果示意图。

附图标记说明：

1、玻璃纤维素膜；

2、喷探针区域；

3、量子点；

4、皮质醇(DHEA/DHEAS)抗体；

5、血液样本或尿液样本；

6、硝酸纤维素膜；

7、皮质醇(DHEA/DHEAS)抗原；

8、检测线(T1)；

9、检测线(T2)；

10、质控线(C)；

11、DNP-BSA抗原；

12、PVC板；

13、吸水纸；

14、下盖；

15、上盖；

16、透明观察窗；

17、DNP-BSA抗体。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例一

如图1，本实施例提供了便携式压力与精神疾病客观指标评估试纸条，包括玻璃纤维素膜1、硝酸纤维素膜6、吸水纸13、PVC板12以及封闭盒盖。

PVC板12设于封闭盒盖中，封闭盒盖包括上盖15和下盖14，下盖14底部放置PVC板12。上盖15开设通孔，用于滴加血液样本或者尿液样本。上盖15设置有透明观察窗16，透明观察窗16位于质控线10和检测线(8/9)上方，用于检测装置读取质控线10和检测线(8/9)的信号数据。

玻璃纤维素膜1、硝酸纤维素膜6以及吸水纸13设于PVC板12上，硝酸纤维素膜6的两端分别与玻璃纤维素膜1和吸水纸13连接。

玻璃纤维素膜1靠近硝酸纤维素膜6的一端设置喷探针区域2，通孔的下方为玻璃纤维素膜1的另一端，设为样本端。玻璃纤维素膜经过特殊处理，且离样本端至喷探针区域2的高度逐渐变高，可以在加样后有效将全血样本的血细胞阻挡在玻璃纤维素膜1上，不在检测区域产生信号与反应产生干扰。即，玻璃纤维素膜1经过封闭处理，且右端略高于左端，可以保证测试的稳定性以及可靠性。

喷探针区域2喷涂检测特异性抗体探针和独立质控抗体探针，检测探针为不同规格但为同波长的量子点3与特异性抗体4偶联成的探针。

硝酸纤维素膜6并列设有一条质控线以及至少一条检测线，质控线远离玻璃纤维素膜1，检测线靠近玻璃纤维素膜1。

检测线喷涂与检测特异性抗体探针结合的抗原，质控线喷涂与独立质控抗体探针结合的独立抗原。

量子点3为聚合程度不同的多规格CdSe/ZnS核壳量子点，其发光波长依然为原料核壳量子点本身产生，几乎不受聚合程度影响。

当检测线采用一条T线，选取同规格同波长的量子点3。

当检测线采用两条，分别为T1(8)和T2(9)时，则选取不同规格但同波长的量子点3。小规格的量子点为单分散量子点，大规格的量子点为聚合性量子点。标记单分散量子点的探针层析速度略快于聚合型量子点标记的探针，标记单分散量子点的探针对应位置较远的检测线T2，标记聚合型量子点的探针对应位置较近的检测线T1。不同检测项目可以在相同较短时间内完成反应，减少相互干扰，同时保证所有的荧光结果可以用同一种光学系统读取，减少硬件差异带来的误差。

其中，特异性抗体4为单独的皮质醇特异性抗体，或单独的DHEA特异性抗体，或单独的DHEAS特异性抗体，或皮质醇与DHEA/DHEAS二者其一，共计两种指标的特异性抗体(二联检)。即，如果是二联检则特异性抗体4中必须要有皮质醇，皮质醇与DHEA/DHEAS中的任意一种联合使用。

特异性抗体4包括针对目标小分子的兔IgG单抗或鼠IgG单抗。

T1(8)和T2(9)分别喷涂与特异性抗体相对应的抗原。当特异性抗体4为单独的皮质醇特异性抗体，则仅需要一条T线为皮质醇特异性抗原7。当特异性抗体为皮质醇与DHEA/DHEAS中的任意一种偶联时，则T1(8)和T2(9)分别为皮质醇抗原和DHEA/DHEAS抗原中的至少一种。

独立质控抗体探针中的抗体为DNP-BSA抗体17，质控线为C(10)，独立抗原为DNP-BSA抗原11。

实施例二

根据实施例一的结构，本实施例为便携式压力与精神疾病客观指标评估方法，包括实施例一的便携式压力与精神疾病客观指标评估试纸条。试纸条的检测项目包含皮质醇以及DHEA/DHEAS激素，评估的疾病类型包括慢性压力、应激、以及由于长期压力和刺激导致的精神疾病和内分泌紊乱。

具体还包括如下步骤：

S1、在玻璃纤维素膜1靠近硝酸纤维素膜6一侧的喷探针区域2喷涂偶联探针和独立抗体探针。

偶联探针为不同规格但为同波长的量子点与特异性抗体偶联成的探针，特异性抗体则为单独的皮质醇特异性抗体，或单独的DHEA特异性抗体，或单独的DHEAS特异性抗体，或皮质醇与DHEA/DHEAS中的一种偶联的特异性抗体(二联检)。

独立抗体探针中的独立抗体为DNP-BSA抗体。

S2、在硝酸纤维素膜6设置两条检测线和一条质控线，分别为T1、T2和C，T1位于玻璃纤维素膜1与T2之间，T2位于T1和C之间。

S3、在T1和T2上喷涂与偶联探针相对应的抗原。在C上喷涂与DNP-BSA抗体相对应的DNP-BSA抗原。

S4、将5～20ul血液样本5与稀释液混合形成60～80ul混合液，并将混合液在上盖15的通孔位置滴加到玻璃纤维素膜1上，尿液样本可直接加样。

S5、等待反应时间为6～10分钟，该反应在层析完成后10分钟之内检测浓度变化不超过10％，一小时内不超过15％，时间稳定性非常好，同一样本关键检测区间CV不超过10％，可以在很短时间内完成生化反应并达到较为精密的结果。

反应为混合液往吸水纸13方向运动：血液样本或尿液样本5中的待测小分子首先分别与喷探针区域2的喷涂偶联探针和独立抗体探针结合，然后与T1、T2以及C上的抗原结合。

反应原理为：由于涉及的待测物为小分子，使用竞争法检测原理，待测物质的浓度与各自对应的检测线量子点荧光强度成反比，定量数值由T线和C线的比值校正，样本类型由该人群的固定参数r校正。

如某一人群或患者属于压力较大或有焦虑、抑郁等精神疾病，其分泌的皮质醇可能较高，则对应T线量子点荧光强度越弱，而C线荧光数值基本不受待测物影响，T/C值较小，换算为较高的皮质醇浓度。同时，此类人群皮质醇上游前体DHEA/DHEAS激素偏低，在本方法学中表现为对应T线量子点荧光强度较强，T/C值较高，换算为DHEA/DHEAS浓度偏低。对同一个个体的皮质醇浓度和DHEA/DHEAS浓度取比值(即T

S6、用检测分析装置从透明观察窗16读取质控线和检测线位置的荧光数据，根据检测线的荧光数据与质控线的荧光数据的比值计算皮质醇、DHEA/DHEAS的浓度，评估压力与精神疾病的情况。

本方法的应用包括且不限于压力、压力产生的应激、内分泌失调、焦虑、抑郁等与本技术所选取的检测指标相关的精神疾病的检测。

步骤S6中，所采用的检测分析装置为现有的荧光数据采集装置，例如专利号为ZL201510120128.6的定位基座、暗腔及使用该暗腔的体外检测分析装置，或专利号为ZL201510116072.X的光源模块及使用该光源模块的体外检测分析装置，或专利号为ZL201510116173.X的暗腔及使用该暗腔的体外检测分析装置。

当然，根据步骤S5中的反应原理，在缺少专业检测装置的条件下，可以通过观察的方法评估荧光的亮度。例如通过UV光源或者验钞笔等常见的日用品，照射T线和C线上的荧光值，通过判断荧光值的亮度评估待检测人的精神状况。

本发明使用的量子点可以用同一UV光源激发，发光颜色观察都为红色，反应完成后可通过检测线和质控线的信号比以及质控线之间的信号比(T1/C,T2/C,T1/T2)判断皮质醇、DHEA/DHEAS的浓度以及相互之间的浓度比例关系，大量国内外研究表明这些数值和比值对压力和应激导致的精神疾病的辅助诊断有参考意义。

检测原理为小分子竞争法单检或多联检，在不存在待测物质时T线有最高信号值。通过调节T线处喷涂抗原水平、探针喷涂比例、独立C线荧光信号值，使各T线在待测物质浓度处于医学截断值(cutoff)时与C线信号值成固定比例，便于在条件较为简陋的情况下可以简单的通过肉眼观察初步判断检测结果，对该疾病进一步详细检查提供帮助。

如图2，为使用量子点标记的皮质醇探针和检测试剂在25℃下的时间稳定性图表。血液样本加样后6分钟反应完毕使用便携式免疫荧光分析仪做第一次读取，直至60分钟。总共有11份临床样本，各样本为一条线，可以看出各条样本线起伏较小，尤其是10分钟之后，说明时间稳定性好，在无法准确计时或过于繁忙时亦可进行较准确的检测。

如图3，为半定量筛查浓度比例示意图，22.5ug/dL为本方法参比化学发光皮质醇临床检测判断的95％分位上限，本设计在20-23ug/dL浓度范围下荧光颜色可以通过T线和C线的亮度及宽度(基本在1:1左右)进行半定量判断。本检测项目皮质醇以及DNEA/DHEAS都为小分子，采用竞争法检测，故荧光信号越少则待测物浓度越高，即压力较大或者有焦虑、抑郁等精神疾病的可能性较大，因此皮质醇T线狭窄和信号弱，DHEA/DHEAS的T线宽，信号强(或通过两条检测线的对比)则提示需要进一步复查确认。在有手持便携设备的条件下推荐使用手持免疫荧光分析仪进行精准定量读取和自动报数。

如图4，为多指标联检，设置两条检测线为T1和T2，可得知皮质醇和DHEA(DHEAS)检测数值(单位为ug/dL)与T1/T2的关系。其中各自浓度计算方式为r*Tx/C，r为样本的转换系数，由不同样本类型决定，血清通常为1。T1/T2＝(r*T1/C)/(r*T2/C)，在软件中可用二者各自浓度标曲的换算结果进行比值计算，在条件较为苛刻的情况下可以由两条带(T1和T2)的荧光强度和条带宽度进行估算。T1/T2的临床参考范围参照国外案例较多的研究成果，在焦虑症或压力较大的孕妇中该比值将会达到≥0.5，而对照组在≤0.3，有显著差异。

本发明与现有技术相比，具有以下技术效果：

本发明使用同一波长的量子点，但是在后期通过使颗粒进行聚合制成波长一致但分散性不同的单分散和和多聚量子点，分别应用于不同检测目标的探针。

使用粒径较小的量子点标记检测线较远的待测物质，粒径较大的量子点标记检测线较近的待测物质，可以更好地使多种待着指标在层析过程中进行区分，提高各自的反应精密度和反应速度。

使用独立质控线抗原-抗体探针，质控线信号不受检测线影响，待测物的浓度判断参考T线与C线信号的比值。在精神疾病相关待测物检测过程中各待测物质信号比值也有诊断参考意义。

可使用血液(血清，血浆，全血，20ul)或尿液样本进行检测，一次进行皮质醇或DHEA/DHEAS的单检或联检。全血中的血细胞会残留在玻璃纤维素膜1(层析速度极慢且向反方向略微倾斜)而量子点探针和待测物质会迅速完成层析，不会受到血细胞影响。

最短6分钟内即可完成多指标的检测，层析完成后10分钟之内检测浓度变化不超过10％，一小时内不超过15％，具有较好的时间稳定性。对读取结果的时间准确性要求较低，使用方便、操作简单，成本低廉，能满足基层以及社康的检测精准度要求。

同时，本发明结合了量子点发光强度高，荧光寿命长，粒径小的特征，与常规胶体金检测相比可以满足低浓度，有日常节律的压力相关皮质醇或DHEA/DHEAS激素小分子的检测，与ELISA检测法相比可以满足手持设备读取结果，甚至用验钞笔UV光源观察对比荧光条带亮度的效果，达到在不同场景下精神疾病的筛查和评估目的。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。