一种基于三维细胞培养支架的细胞培养方法

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种基于三维细胞培养支架的细胞培养方法。

背景技术

三维细胞培养技术是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞-载体复合物。普通的细胞培养由于细胞在体外改变的环境下增生逐渐丧失了原有的性状，往往和体内情况不相符，而动物实验完全在体内进行，但由于体内的多种因素制约以及体内和外界环境相互影响而变得复杂化，难以研究单一过程，且难以研究中间过程。三维细胞培养技术是介于单层细胞培养与动物实验之间的一种技术，既能最大程度的模拟体内环境，又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。

三维细胞培养依托于支架，不同的支架和支架使用方法得到的培养结果也有所不同，其培养目的均是为了模拟出动物体内环境，在这种类体内环境下进行细胞研究，以至于再转移到动物体内进行研究的时候得到更准确的结果，并减少动物实验所走的弯路，直接明确地得到实验结果。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种基于三维细胞培养支架的细胞培养方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种基于三维细胞培养支架的细胞培养方法，包括以下步骤：S1搭建培养支架；选择支架类型，并制备好以CD-Link为交联剂水凝胶，形成细胞培养基质；S2制备细胞悬浮液；在搭建好培养支架后制备接种细胞的悬浮液，得细胞悬液，标记细胞；S3细胞预培养；将细胞悬液滴加到水凝胶表面，放置在34℃～37℃的环境中，让细胞繁殖发展；每天进行数据记录；S4拉伸环境模拟；对细胞提供拉应力、压应力、切应力刺激加载，模仿细胞在人体内的生理状态，记录细胞发展繁殖数据。

优选的，培养支架所用水凝胶材质包括噬菌体、磁性氧化铁和金纳米颗粒。

优选的，S2制备细胞悬浮液中，使用小分子物质，包括荧光标记phalloidin、核酸染料、活性和毒性检测试剂、增值检测试剂，对细胞悬液内的细胞进行标记，完成标记后再滴加到水凝胶上。

优选的，S3细胞预培养中细胞悬液的滴加速度为20μL/s～60μL/s，细胞悬液静置后再滴加入水凝胶中，其静置时间为5～7min。

优选的，水凝胶制备完成后先放入培养箱内进行环境适应，在水凝胶放入培养箱15min后，向水凝胶内加入细胞悬液。

优选的，在S4拉伸环境模拟的步骤中，选用的施压系统包括flexcell细胞拉伸应力加载培养系统。

优选的，适用的细胞培养领域包括软骨细胞、兔髓核细胞(NP)、脂肪组织来源的间充质干细胞、Y7视网膜母细胞瘤(RB)细胞、乳腺癌细胞、脂肪来源干细胞、MCF-7癌细胞。

本发明的有益效果为：本发明中，本发明在水凝胶中使用噬菌体、磁性氧化铁和金纳米颗粒等成分，有利于瘤细胞癌细胞的着床生长，其在细胞培养8天的形成率和存活率上相较于现有技术有了很大的增长，且本发明中利用拉应力系统较好地模拟细胞在人体内的生活环境，使培养结果能贴近人体环境，实验培养数据更加可靠，有利于动物体内实验的开展。

附图说明

图1为本发明制备得到的细胞数据表。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

参照图1。

实施例一

一种基于三维细胞培养支架的细胞培养方法，包括以下步骤：S1搭建培养支架；选择支架类型，并制备好以CD-Link为交联剂水凝胶，形成细胞培养基质；S2制备细胞悬浮液；在搭建好培养支架后制备接种细胞的悬浮液，得细胞悬液，标记细胞；S3细胞预培养；将细胞悬液滴加到水凝胶表面，放置在36℃的环境中，让细胞繁殖发展；每天进行数据记录；S4拉伸环境模拟；对细胞提供拉应力、压应力、切应力刺激加载，模仿细胞在人体内的生理状态，记录细胞发展繁殖数据。

在本实施例中，培养支架所用水凝胶材质包括噬菌体、磁性氧化铁和金纳米颗粒。其中噬菌体是M13来源的，展示了RGD-4C配体肽段，并以靶定金纳米颗粒和磁性氧化铁。

在本实施例中，S2制备细胞悬浮液中，使用小分子物质，包括荧光标记phalloidin、核酸染料、活性和毒性检测试剂、增值检测试剂，对细胞悬液内的细胞进行标记，完成标记后再滴加到水凝胶上。

在本实施例中，S3细胞预培养中细胞悬液的滴加速度为50μL/s，细胞悬液静置后再滴加入水凝胶中，其静置时间为6min。

在本实施例中，水凝胶制备完成后先放入培养箱内进行环境适应，在水凝胶放入培养箱15min后，向水凝胶内加入细胞悬液。

在本实施例中，在S4拉伸环境模拟的步骤中，选用的施压系统包括flexcell细胞拉伸应力加载培养系统。

在本实施例中，适用的细胞培养领域包括软骨细胞、兔髓核细胞(NP)、脂肪组织来源的间充质干细胞、Y7视网膜母细胞瘤(RB)细胞、乳腺癌细胞、脂肪来源干细胞、MCF-7癌细胞。

实施例二

一种基于三维细胞培养支架的细胞培养方法，包括以下步骤：S1搭建培养支架；选择支架类型，并制备好以CD-Link为交联剂水凝胶，形成细胞培养基质；S2制备细胞悬浮液；在搭建好培养支架后制备接种细胞的悬浮液，得细胞悬液，标记细胞；S3细胞预培养；将细胞悬液滴加到水凝胶表面，放置在36℃的环境中，让细胞繁殖发展；每天进行数据记录；S4拉伸环境模拟；对细胞提供拉应力、压应力、切应力刺激加载，模仿细胞在人体内的生理状态，记录细胞发展繁殖数据。

在本实施例中，培养支架所用水凝胶材质为市面常规材质，不含实施例中的噬菌体、磁性氧化铁和金纳米颗粒等成分。

在本实施例中，S2制备细胞悬浮液中，使用小分子物质，包括荧光标记phalloidin、核酸染料、活性和毒性检测试剂、增值检测试剂，对细胞悬液内的细胞进行标记，完成标记后再滴加到水凝胶上。

在本实施例中，S3细胞预培养中细胞悬液的滴加速度为50μL/s，细胞悬液静置后再滴加入水凝胶中，其静置时间为6min。

在本实施例中，水凝胶制备完成后先放入培养箱内进行环境适应，在水凝胶放入培养箱15min后，向水凝胶内加入细胞悬液。

在本实施例中，在S4拉伸环境模拟的步骤中，选用的施压系统包括flexcell细胞拉伸应力加载培养系统。

在本实施例中，适用的细胞培养领域包括软骨细胞、兔髓核细胞(NP)、脂肪组织来源的间充质干细胞、Y7视网膜母细胞瘤(RB)细胞、乳腺癌细胞、脂肪来源干细胞、MCF-7癌细胞。

实施例三

一种基于三维细胞培养支架的细胞培养方法，包括以下步骤：S1搭建培养支架；选择支架类型，并制备好以CD-Link为交联剂水凝胶，形成细胞培养基质；S2制备细胞悬浮液；在搭建好培养支架后制备接种细胞的悬浮液，得细胞悬液，标记细胞；S3细胞预培养；将细胞悬液滴加到水凝胶表面，放置在36℃的环境中，让细胞繁殖发展；每天进行数据记录；S4拉伸环境模拟；对细胞提供拉应力、压应力、切应力刺激加载，模仿细胞在人体内的生理状态，记录细胞发展繁殖数据。

在本实施例中，培养支架所用为营养基质，而不是实施例一和实施例二中的水凝胶。

在本实施例中，S2制备细胞悬浮液中，使用小分子物质，包括荧光标记phalloidin、核酸染料、活性和毒性检测试剂、增值检测试剂，对细胞悬液内的细胞进行标记，完成标记后再滴加到水凝胶上。

在本实施例中，S3细胞预培养中细胞悬液的滴加速度为50μL/s，细胞悬液静置后再滴加入水凝胶中，其静置时间为6min。

在本实施例中，水凝胶制备完成后先放入培养箱内进行环境适应，在水凝胶放入培养箱15min后，向水凝胶内加入细胞悬液。

在本实施例中，在S4拉伸环境模拟的步骤中，选用的施压系统包括flexcell细胞拉伸应力加载培养系统。

在本实施例中，适用的细胞培养领域包括软骨细胞、兔髓核细胞(NP)、脂肪组织来源的间充质干细胞、Y7视网膜母细胞瘤(RB)细胞、乳腺癌细胞、脂肪来源干细胞、MCF-7癌细胞。

根据上述三个实施例分别培养8天，得到培养细胞，分析细胞繁殖形成率、细胞存活率(8天后的细胞相较于峰值的比例)和细胞贴壁率，得到图1。根据图1能看出本发明中的贴壁率明显低于现有三维培养支架得到的细胞贴壁率，而在存活率上和形成率上也明显较好，不仅能模拟人体环境培养，还具备较好的培养能力。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。