与低分子功能性生物原材料包合的乳酸菌核苷酸的制备方法及通过其方法制备的库必素

技术领域

本发明涉及同时制备在皮肤及化妆品领域中具有油溶性的低分子功能性生物原材料和乳酸菌核苷酸的方法，更具体地，涉及通过一种细胞破碎工序同时解决从高分子功能性生物原材料到低分子功能性生物原材料的转化及乳酸菌核苷酸成分的溶出这两种问题(2-in-1制备法)并与低分子功能性生物原材料包合的乳酸菌核苷酸(Cubisome)的制备方法。

背景技术

皮肤(Skin)可分为作为上层部的表皮(epidermis)、其下侧的真皮(dermis)、下部的皮下脂肪，各个层具有互不相同的功能。表皮的功能有渗透屏障、先天性免疫、对紫外线的保护、伤口恢复、维生素D合成等，真皮层具有抑制病原体侵入、伤口恢复、皮肤的结构及弹性保持等功能。

皮肤起到从来自外部的物理、化学刺激中保护人体的作用，但紫外线使皮肤细胞的脱氧核糖核酸(DNA)受损，生成活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)而抑制皮肤胶原蛋白的合成，促进分解，使皮肤老化，生成皱纹。

紫外线经过在皮肤表皮的边界直接反射，或在皮肤组织内与细胞、成纤维粒子相撞后散射或吸收、渗透的路径，只有被吸收的紫外线引起光化学反应而引起皮肤病变。皮肤的渗透程度根据波长而不同，波长长的长波黑斑效应紫外线(UVA)深入渗透到真皮中，但户外紫外线(UVB)、短波紫外线(UVC)因波长短而严重引起皮肤表皮中的皮肤病变。其中，UVB的波长为280～320nm，大部分被臭氧层吸收，但一部分到达地表，短波长的高能光线使强度超强于UVA，导致在短时间内受到烧伤(solar scar)。基于UVB的持续性暴露以引起皮肤癌的原因备受瞩目。

根据统计的确认报告，地域、人种及随着年龄的皮肤状态和类型不同。Kompaore等(Skin Pharmacol.,1993；6:200-207)针对亚洲人、白人、黑人测定经皮水分损失量的结果显示，相比于白人，亚洲人和黑人的损失量更高。Man等(Skin Pharmacol.Physiol.,200；22:190-199)针对中国男性和女性的不同年龄段测定皮脂量的结果显示，女性额头的皮脂另相比于男性额头的皮脂量更低，女性30多岁之后呈现大幅减少的倾向，但男性直到50多岁呈现类似的倾向，之后逐渐减少。Marrakchi等(Contact dermatitis,2007；57:28-34)比较由24～34岁形成的青年层和由66～83岁形成的老年层的水分量、皮脂量等的结果显示，青年层的水分量除了前臂之外，额头、脸颊中高于老年层，皮脂量对于青年层和老年层而言无大差异。

根据国家皮肤特性银行构建工作报告，对于韩国人而言，存在如下差异，女性皮肤类型依次为复合性＞干性＞中性＞油性，男性皮肤类型顺序为油性＞复合性＞中性＞干性。

在以往的统计方法中确认到存在根据人种、生活的地域、性别、年龄的差异，但UVB之类的光学原因引起经皮水分损失量和皮肤皱纹等皮肤老化的相关关系不明确，难以进行科学证明。

皮肤微生物组(Skin microbiome)是指分布于皮肤的常居菌的生态系统，主要由葡萄球菌(Staphylococcus)属、丙酸杆菌(Propionibacterium)属等形成均衡而保持健康的皮肤状态。构成皮肤微生物组的常居菌根据年龄段、男女、人种、生活的地域而不同。尤其，不同年龄段的皮肤优势种保持皮肤健康，通过统计学方法分析，因而最近将肠道微生物用于皮肤无科学根据。

最近，在专利公开10-2017-0125755的皮肤光损伤判断用肠道微生物或内源性代谢物标记的用途相关专利中，揭示因UVB而导致皮肤光损伤的小鼠的粪便菌群与未被光损伤诱导的小鼠的肠道常居菌不同，将UVB引起的皮肤损伤间接解释为作为肠道常居菌的肠道微生物组(gut microbiome)。但是，对于该现有研究而言，基于饮食(diet)的构成肠道微生物组的肠道常居菌不同，以非皮肤损伤的其他原因也可减少异杆菌属(Allobaculum)、毛螺菌属(Lachnoclostridium)、细小杆菌属(Parvibacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)等，因而在将年龄、性别、人种等作为皮肤常居菌的原因和解决方案上达到了极限。并且，将肠道常居菌接种于皮肤常居菌而保持其均衡，肠道常居菌大部分为厌氧性微生物，皮肤常居菌为兼性或需氧性微生物，氧的嗜好度不同，将肠道常居菌中可用作食品微生物的肠道栖息乳酸菌直接用于皮肤来呈现其有效性的现有研究的科学根据不明确。

并且，当前，市场上销售将双歧杆菌(Bifidobacterium)属或乳杆菌(Lactobacillus)属的乳酸菌使用于皮肤的原料。其中，Bifida发酵浓缩物等为代表性例子，将细胞破碎物作为主要成分。但是，细胞组成成分中与皮肤发生免疫反应的脂多糖(LPS，lipopolysaccharide)存在于细胞壁，当该成分过多时，可引起过敏性皮炎、红斑、皮疹等皮肤过敏。

用于皮肤保护作用的微生物原材料的应用中，另一问题在于，当细胞破碎物适用于皮肤时，对于皮肤常居菌而言是生长所需的蛋白质来源(proteins)，因而当皮肤有害菌将其用作生长因素时，会破坏健康的皮肤微生物组的均衡。当前，记载为国际化妆品原料的各种微生物细胞破碎物包含很多可影响人类的皮肤微生物组的蛋白质成分，因而在其制备工序中，需要将微生物细胞内的蛋白质成分最小化，可增加功能性有效成分的工序上的战略。

并且，在化妆品领域中，利用包含透明质酸、β-葡聚糖等之类的多糖体及胶原蛋白等之类的蛋白质的多种生物原材料。例如，透明质酸具有吸收水分的性质，据悉，不仅带来皮肤保湿及弹性效果，还具有抑制紫外线引起的炎症或皮肤损伤的效果，β-葡聚糖不仅呈现抗氧化效果及抗炎效果，还具有增加皮肤保湿力，改善皮肤皱纹的效果，胶原蛋白不仅改善皮肤皱纹，增加皮肤弹性，而且具有防止皮肤老化的效果。但是，上述生物原材料由高分子形成，从而难以被皮肤吸收。因此，最近，为了提高生物原材料的皮肤吸收，还增大皮肤美容效果，另行开发将这些生物原材料进行低分子化的工序。

在本发明中，克服现有研究中的年龄、性别、人种、生活的地域等限制事项，发明完成可通用地适用于皮肤微生物组的乳酸菌核苷酸的制备工序法。更详细地，通过将乳酸菌细胞的组成成分中的适用于皮肤时影响皮肤微生物组的蛋白质成分最小化，将皮肤美容效果优秀的核苷酸(nucleotide)部分高浓度化的乳酸菌核苷酸制备方法最佳化，将微生物资源适用于人类皮肤时作为皮肤过敏原因成分的脂多糖和蛋白质的影响最小化。并且，为了可通过一个工序准备乳酸菌核苷酸成分和皮肤亲和性生物原材料，完成解决通过一种细胞破碎工序从高分子生物原材料转化为低分子生物原材料和溶出乳酸菌核苷酸成分的两种制备问题的2-in-1制备法，最终完成制备被称为库必素(Cubisome)的乳酸菌核苷酸原料的本发明。

现有技术文献

专利文献

KR 10-1426191 B

KR 10-2008-0092090 A

发明内容

技术问题

因此，本发明的主要目的在于，提供通过一个工序同时制备皮肤美容及化妆品领域中具有油溶性的低分子功能性生物原材料和乳酸菌核苷酸的方法。

本发明的另一目的在于，提供与通过上述制备方法制备而得的低分子功能性生物原材料包合的乳酸菌核苷酸的被称为库必素(Cubisome)的化妆品、食品及医药品领域的新的生物原材料。

在本发明的说明书中，“功能性生物原材料”是指来源于具有以往化妆品、食品及医药品领域中有用的功能性的生物体的物质，只要高分子可分解而低分子化，就可包含任何功能性生物原材料，例如，包含透明质酸、β-葡聚糖之类的多糖体及胶原蛋白之类的蛋白质等。这种“功能性生物原材料”的特征在于，核苷酸不来源于想要溶出的相应的乳酸菌，而是从外部导入(例如，来源于其他微生物)。并且，“高分子”是指功能性生物原材料通过本发明的方法低分子化之前的高分子状态，“低分子”是指上述高分子功能性生物原材料通过本发明的方法分解而低分子化的状态。上述“高分子”及“低分子”为相对的概念，不以特定分子量限制。并且，“包合”是指低分子功能性生物原材料与乳酸菌核苷酸混合或包围而形成复合物(complex)。因此，在本发明中，低分子功能性生物原材料起到作为乳酸菌核苷酸的载体(carrier)的作用。

根据本发明的一实施方式，本发明提供包括如下步骤的与低分子功能性生物原材料包合的乳酸菌核苷酸的制备方法。

步骤(a)，将乳酸菌在营养培养基中增殖，来进行前发酵；

步骤(b)，分离在上述步骤(a)中增殖的乳酸菌体，在包含高分子功能性生物原材料的限定培养基中培养，来进行后发酵；

步骤(c)，针对上述步骤(b)的乳酸菌后发酵液，以热压缩条件破碎乳酸菌细胞来使乳酸菌核苷酸溶出；

步骤(d)，从上述步骤(c)的破碎的发酵液中去除细胞壁及细胞质蛋白质成分，回收与低分子功能性生物原材料包合的乳酸菌核苷酸。

在本发明中，上述前发酵步骤(a)的“营养培养基”是指包含作为微生物的增殖所需的营养素的碳源、氮源、维生素类之类的生长因子、无机盐类的培养基，例如，可包含MRS(乳酸细菌培养基)液体培养基、BL Agar(琼脂)、Todd Hewitt液体培养基等培养基，在本发明的实施例中使用MRS液体培养基。并且，上述步骤(b)的“限定培养基”是指不充分包含增殖所需的营养素且成分受限的培养基，在本发明的实施例中，使用将高分子多糖体或胶原蛋白及葡萄糖溶解于蒸馏水的培养基。

在本发明中，优选地，提供与低分子功能性生物原材料包合的乳酸菌核苷酸的制备方法，其特征在于，以上述步骤(b)的后发酵及步骤(c)的热压缩条件的结果，将高分子功能性生物原材料进行低分子化。根据本发明，在上述步骤(b)的后发酵工序中，限定培养基的营养素不充分，导致高分子生物原材料分解的可能性变高，并且，在上述步骤(c)的热压缩条件下，可实现同时解决通过一个工序从高分子生物原材料转化为低分子生物原材料和使乳酸菌核苷酸成分溶出这两种问题的2-in-1制备法。

在本发明中，上述步骤(a)的乳酸菌只要可通过细胞破碎使核苷酸流出，就可利用于化妆品领域等，可采用任何乳酸菌，但优选地，提供如下与低分子功能性生物原材料包合的乳酸菌核苷酸的制备方法，其特征在于，其为选自由乳杆菌属(Lactobacillus sp.)、双歧杆菌属(Bifidobacterium sp.)、链球菌属(Streptococcus sp.)、乳球菌属(Lactococcus sp)、肠球菌属(Enterococcus sp)、片球菌属(Pediococcus sp)、魏斯氏菌属(Weissella sp)组成的组中的一种以上。

在本发明中，前发酵培养使用MRS液体培养基接种乳酸菌使其成为1～10％(v/v)之后，在30～45℃下培养12～48小时。更优选地，将乳酸菌2～5％(v/v)接种于MRS液体培养基之后，在37℃下培养15～24小时。培养之后，将培养液离心分离(4000rpm，10min)，仅回收菌体，用灭菌蒸馏水洗涤(washing)两次，悬浮于最终灭菌蒸馏水中。

在本发明中，上述步骤(b)的高分子功能性生物原材料可采用可利用于皮肤或化妆品领域等的任何高分子功能性生物原材料，但其特征在于，优选地，其为选自由作为不来源于相关乳酸菌的高分子功能性生物原材料的透明质酸(hyaluronic acid)、β-葡聚糖(beta glucan)或胶原蛋白(collagen)组成的组中的一种以上。在本发明的实施例中，为了在乳酸菌核苷酸的细胞内顺畅地溶出，营造与溶出之后细胞质内的环境类似的环境来保持其稳定性，在来源于微生物的高分子生物原材料中被选为最佳载体(carrier)。

在本发明中，提供如下的与低分子功能性生物原材料包合的乳酸菌核苷酸的制备方法，其特征在于，上述步骤(b)的限定培养基除了高分子功能性生物原材料之外还可采用营养成分受限的任何限定培养基，但优选地，除了高分子功能性生物原材料之外仅包含水和葡萄糖。具体地，上述限定培养基在蒸馏水中可包含0.1～10％(w/v)的高分子功能性生物原材料和0.1～10％(w/v)的葡萄糖。

在本发明中，后发酵培养将通过前发酵回收的悬浮的菌体接种于限定培养基之后，在30～45℃下培养12～48小时。更优选地，接种菌体之后，在37℃下培养15～24小时。

在本发明中，提供如下的与低分子功能性生物原材料包合的乳酸菌核苷酸的制备方法，其特征在于，上述步骤(c)的热压缩条件可采用破碎乳酸菌细胞并可分解高分子功能性生物原材料的任何条件，但优选为80～130℃的温度及0.01～0.30MPa的压力条件。

以往，为了分离乳酸菌核苷酸，将增殖的细胞培养液离心分离来丢弃上清液的培养液，仅收集颗粒的细胞进行破碎，相反，本发明的技术特征在于，与乳酸菌后发酵工序的培养液一同将乳酸菌细胞破碎。由此，自然地可通过一个工序实现生物原材料的低分子化及乳酸菌核苷酸的溶出，可制备与低分子生物原材料复合的乳酸菌核苷酸的新的生物原材料。

在本发明中，提供如下的与低分子功能性生物原材料包合的乳酸菌核苷酸的制备方法，其特征在于，在上述步骤(d)中去除细胞壁和细胞质蛋白质时可使用以往生物技术中公知的任何方法，但优选地，通过离心分离去除包含细胞壁的颗粒，通过冷却及过滤去除细胞质蛋白质。上述离心分离可使用可去除包含破碎的细胞壁的颗粒的任何离心分离，例如，可使用3000～5000rpm，上述冷却中可使用通过高温高压改性的蛋白质凝集或向下(down)的任何温度，例如，可使用0至+25℃，上述过滤中可使用细胞质蛋白质和核苷酸可分离的任何过滤器，例如，可使用0.20至20um的过滤器。如上所述，通过去除乳酸菌固有的细胞壁和细胞质蛋白质，不仅可抑制原料的发酵气味生成及皮肤过敏，还防止对皮肤微生物组产生的坏影响。

具体地，以往，通过破碎乳酸菌来使核苷酸溶出的热压过程而产生的培养基成分中所含的糖成分和细胞质内蛋白质的不可逆反应，即，美拉德反应产生改性糖蛋白成分，成为抑制诱发异常发酵气味的感官质量的因素。但是，根据本发明，可有效去除作为这种制备过程中产生的质量抑制因素的乳酸菌固有的细胞质蛋白质和细胞壁成分，使载体包合，从外源性高分子转换为低分子，可增大其稳定性。

根据本发明的另一实施方式，本发明提供与通过上述本发明的制备方法制备而得的低分子功能性生物原材料包合的乳酸菌核苷酸。根据本发明，不仅可将与化妆品领域等中有用的低分子生物原材料包合的乳酸菌核苷酸作为复合物一次性提供，还通过由低分子生物原材料自然地包围乳酸菌核苷酸可增大其稳定性。与本发明的低分子功能性生物原材料包合的乳酸菌核苷酸为从未有过的新的生物原材料，被称为库必素(Cubisome)。

以下，更具体说明本发明。

本发明涉及以来源于乳酸菌的核苷酸的稳定皮肤美白效果和来源于原料调制中发生的菌体的蛋白质及细胞壁成分的去除为基础的制备方法。更详细地，本发明涉及通过高分子多糖体后发酵过程使影响皮肤微生物组和原料的发酵气味生成的乳酸菌固有的细胞质蛋白质和细胞壁成分抵消，以高浓度生产来源于具有紫外线吸收效果的乳酸菌的核苷酸，将其以化妆品、食品及医药品中可利用的生物原材料开发目的与来源于微生物的高分子多糖体包合来增大其稳定性的库必素(Cubisome)的制备方法。

本发明人在进行用于使乳酸菌增殖的前发酵之后，为了保持发酵气味、颜色以及适用于皮肤时有效成分的稳定性，适用来源于微生物的高分子多糖体和取代培养的技术进行后发酵，针对作为紫外线波长的吸光度最高的细胞组成成分的细胞内核苷酸，开发将温度、压力及时间的变量作为破碎条件最佳化的库必素(Cubisome)原料的调制方法来完成本发明。

本发明的与低分子生物原材料包合的乳酸菌核苷酸(Cubisome)原料的制备方法包括如下步骤。

步骤(a)，将乳酸菌增殖，来进行前发酵；

步骤(b)，将从上述前发酵步骤(a)中增殖的乳酸菌体在包含高分子功能性生物原材料的培养基中增殖，来进行后发酵；

步骤(c)，对于上述步骤(b)的乳酸菌后发酵液，在热压浓缩条件下使副干酪乳杆菌的核苷酸溶出来制备与皮肤吸收度高且保存性优秀的低分子生物原材料包合的乳酸菌核苷酸。

(a)乳酸菌的前发酵步骤：

乳酸菌前发酵步骤设置将使菌体最大限度地增殖，诱发发酵气味的代谢产物最小化的发酵条件。作为前发酵条件，以微生物生长曲线(microbial growth curve)上的指数生长期(exponential phase)状态的菌体局限为活细胞计数及pH的二次变量区间，从而在感官检查中排除发酵气味。

(b)乳酸菌的后发酵步骤：

为了从乳酸菌前发酵中回收的菌体中去除发酵气味，形成用于皮肤表皮层(skinepidermis)中的持续性功能作用的皮肤亲和性结构体，将来源于微生物的高分子生物原材料作为基本培养基来后发酵。

来源于上述微生物的高分子生物原材料具体地不局限于此，但不仅是透明质酸、β-葡聚糖等高分子多糖体，还包含胶原蛋白等蛋白质，优选地，可以为透明质酸、β-葡聚糖，更优选地，是指包含透明质酸的后发酵培养基组合物。

(c)与皮肤亲和性低分子生物原材料包合的功能性乳酸菌核苷酸的库必素(Cubisome)生产：

将乳酸菌后发酵液的特定温度和压力这两种变量最佳化，使高分子多糖体转化为容易被皮肤吸收的形态的低分子多糖体，乳酸菌将存在于细胞质内的核苷酸向细胞质外溶出，生产与低分子多糖体包合的形态的库必素(Cubisome)。

用作化妆品原料的微生物细胞破碎物不明示基于组成的作用，导致作为细胞内蛋白质与宿主的皮肤免疫反应的过敏性皮炎、红斑、皮疹等，进而，一部分蛋白质在皮肤有害菌相对优势的皮肤微生物组中用作生长氮源，可成为危害皮肤健康的潜在因素。因此，在本发明中，根据从实施例中导出的结果，确立可利用乳酸菌大量获取细胞内的核苷酸的制备工序[图1]。随着乳酸菌发酵，通过后发酵过程去除向细胞外分泌的蛋白质，用作后发酵过程中使用的培养基成分的高分子多糖体通过施加热和压力在溶出乳酸菌核苷酸的过程中转化为低分子多糖体，从而可用作容易被皮肤吸收的制剂，并且，呈现包合乳酸菌核苷酸来保持其稳定性的双重功能性，在后发酵工序中排除氮源的培养基中抑制蛋白质生成，去除最终产品中的发酵气味，从而相比于使用现有的细胞壁成分的工序，改善感官商品性，也提高质量。

发明的效果

根据本发明，有效去除影响皮肤微生物组和原料的发酵气味生成的乳酸菌固有的细胞质蛋白质和细胞壁成分，以高浓度生产与低分子功能性生物原材料包合来增大其稳定性的来源于乳酸菌的核苷酸，从而可将其有效利用为化妆品、食品及医药品领域的生物原材料。

附图说明

图1为表示本发明的高浓度乳酸菌核苷酸的制备方法的工序图。

图2为表示通过本发明的制备方法制备而得的乳酸菌核苷酸原料的照片。

图3为表示通过以往方法制备而得的乳酸菌破碎物原料的照片。

图4a为表示通过前发酵-后发酵(有载体)生产的乳酸菌核苷酸的紫外线(UV)波长吸收度的照片。

图4b为表示通过前发酵-后发酵(无载体)生产的乳酸菌核苷酸的UV波长吸收度的照片。

图5为通过核酸分析表示乳酸菌核苷酸的溶出的照片。图5a为核酸标准品(standard)的色谱图，图5b为乳酸菌核苷酸的色谱图。

图6为表示高分子生物原材料的低分子化的照片。图6a为低分子化之前的高分子生物原材料的色谱图，图6b为低分子化的生物原材料的色谱图。

具体实施方式

以下，通过实施例，更详细说明本发明。这些实施例仅用于例示本发明，因而本发明的范围不被解释为局限于这些实施例。

使用MRS液体培养基接种肠道乳酸菌(乳杆菌，Lactobacillus)使其成为3％(v/v)之后，在37℃下前培养15～24小时之后离心分离(4000rpm，10min)，仅回收菌体来用灭菌蒸馏水洗涤(washing)2次，悬浮于最终灭菌蒸馏水中。将回收的悬浮的菌体接种于在蒸馏水中添加葡萄糖1％(w/v)及透明质酸1％(w/v)的限定培养基之后，在37℃下后培养15～24小时。培养之后，在121℃下，以0.15MPa使细胞破碎30分钟，将乳酸菌破碎液离心分离(4000rpm，10min)来仅回收最终上清液。在4℃下冷却(chilling)回收的上清液之后，利用0.45um的过滤器进行最终过滤。过滤之后，在冷藏中保管1周后确认状态。图2为表示通过本发明的制备方法制备而得的乳酸菌核苷酸(

使用MRS液体培养基接种肠道乳酸菌(乳杆菌)使其成为3％(v/v)之后，在37℃下前培养15～24小时之后离心分离(4000rpm，10min)，仅回收菌体来用灭菌蒸馏水洗涤(washing)2次，悬浮于最终灭菌蒸馏水中。将回收的悬浮的菌体接种于在蒸馏水中添加葡萄糖1％(w/v)及β-葡聚糖1％(w/v)的限定培养基之后，在37℃下后培养15～24小时。培养之后，在121℃下，以0.15MPa使细胞破碎30分钟，将乳酸菌破碎液离心分离(4000rpm，10min)来仅回收最终上清液。在4℃下冷却(chilling)回收的上清液之后，利用0.45um的过滤器进行最终过滤。过滤之后，在冷藏中保管1周后确认状态。

使用MRS液体培养基接种肠道乳酸菌(乳杆菌)使其成为3％(v/v)之后，在37℃下前培养15～24小时之后离心分离(4000rpm，10min)，仅回收菌体来用灭菌蒸馏水洗涤(washing)2次，悬浮于最终灭菌蒸馏水中。将回收的悬浮的菌体接种于在蒸馏水中添加葡萄糖1％(w/v)及胶原蛋白1％(w/v)(实施例3)的限定培养基之后，在37℃下后培养15～24小时。培养之后，在121℃下，以0.15MPa使细胞破碎30分钟，将乳酸菌破碎液离心分离(4000rpm，10min)来仅回收最终上清液。在4℃下冷却(chilling)回收的上清液之后，利用0.45um的过滤器进行最终过滤。过滤之后，在冷藏中保管1周后确认状态。

使用MRS液体培养基接种肠道乳酸菌使其成为3％(v/v)之后，在37℃下培养15～24小时之后离心分离(4000rpm，10min)，仅回收菌体来用灭菌蒸馏水洗涤(washing)2次，悬浮于最终灭菌蒸馏水中。对于乳酸菌悬浮液，在121℃下，以0.15MPa使细胞破碎30分钟，将乳酸菌破碎液离心分离(4000rpm，10min)来仅回收上清液。图3为表示通过以往方法制备而得的乳酸菌破碎物原料的照片。

使用MRS液体培养基接种肠道乳酸菌使其成为3％(v/v)之后，在37℃下培养15～24小时之后离心分离(4000rpm，10min)，仅回收菌体来用灭菌蒸馏水洗涤(washing)2次，悬浮于最终灭菌蒸馏水中。用仅利用葡萄糖1％(w/v)而成的限定培养基接种回收的悬浮的菌体之后，在37℃下后培养15～24小时。培养之后，在121℃下，以0.15MPa使细胞破碎30分钟，将乳酸菌破碎液离心分离(4000rpm，10min)来仅回收最终上清液。在4℃下冷却(chilling)回收的上清液之后，利用0.45um的过滤器进行最终过滤。过滤之后，在冷藏中保管1周后确认状态。

为了使乳酸菌核苷酸在细胞内顺畅地溶出，形成与溶出之后细胞质内的环境类似的环境来保持其稳定性，从来源于微生物的高分子功能性生物原材料中选择最佳载体(carrier)。为此，本实验中使用的基于高分子多糖体的载体使用胶原蛋白作为基于透明质酸、β-葡聚糖及蛋白质的载体，在使乳酸菌核苷酸溶出的条件下，将从高分子转换为低分子时产生的异常气味(异味)作为感官因素进行评价[表1]。在分离乳酸菌的细胞质内核苷酸的过程中，施加规定条件的热和压力，引起高分子多糖成分与构成乳酸菌的细胞壁的结构蛋白质反应而成为焦糖的美拉德反应之后，发酵液的颜色变深，或呈现不可逆的糖蛋白(改性蛋白质)等导致不透明而变模糊的现象，这产生异常发酵气味。因此，热压工序之后通过观察冷却过程1周，确认到载体中不模糊而保持透明状态且不产生异常发酵气味的组为不诱发糖蛋白成分的稳定的载体，通过感官检查将其表示如下：因糖蛋白沉淀物而以胶体形态模糊并带有异常发酵气味的情况表示为+++，生成糖蛋白沉淀物并下沉，生成沉淀物下沉并带有异常发酵气味的情况表示为++，不产生糖蛋白沉淀物，透明且不带有异常发酵气味的情况表示为+。培养过程与<实施例1＞相同地进行，在乳酸菌细胞破碎之前步骤中，作为最终悬浮液，使用基于高分子多糖体的液剂，之后，分析过程相同地进行。

表1

利用实验例1中所用的功能性生物原材料中具有皮肤亲和性且有利于制备工序的透明质酸，评价基于载体的乳酸菌核苷酸的稳定性。根据实施例1评价通过前发酵-后发酵(有载体)生产的乳酸菌核苷酸的UV波长吸收度，根据比较例2评价通过前发酵-后发酵(无载体)生产的乳酸菌核苷酸的UV波长吸收度。其结果，如图4a、图4b所示，可确认实施例1的UV波长吸收度高于比较例2的UV波长吸收度。这表示载体不会导致乳酸菌核苷酸分解，而使其长久稳定地保持。

对基于来源于从实验例1中选择的微生物的高分子生物原材料中具有皮肤亲和性且有利于制备工序的透明质酸包合的乳酸菌核苷酸的核酸进行分析。取下样品5ml，添加5mM ZnCl

基于从实验例1中选择的高分子生物原材料中作为多糖体的透明质酸，确认通过后发酵的高分子生物高分子的低分子化。将投入于后发酵工序之前的高分子透明质酸原料(图6a)和与包括后发酵的实施例1的结果物低分子透明质酸包合的乳酸菌核苷酸(图6b)用作试样来测定透明质酸的分子量。利用安装有低分子：TOSOH G3000PWXL、高分子：ViscotekGMPWxl柱的GPC(凝胶渗透色谱法)测定分子量。溶剂利用低分子：D.W.：醋酸(Acetic acid)(3930：70)、高分子：200mM NaCl(in 0.1％叠氮化钠(Sodium Azide))，检测仪利用折射率检测仪(RI detector)。图6为表示高分子生物原材料的低分子化的照片。图6a为低分子化之前的高分子生物原材料的色谱图，图6b为低分子化的生物原材料的色谱图。低分子化之前的高分子透明质酸的分子量(Mw)为1.385×10

参照上述实施例说明本发明，但这仅属于示例性的，只要是本发明所属技术领域的普通技术人员，就会理解从中可进行多种变形及等同的另一实施例。因此，本发明的真正的技术保护范围应当取决于所付的权利要求书的技术事项。