技术领域
本发明属于食品领域，涉及一种食品低温保鲜技术，具体来说采用草菇泛素化结合酶E2抑制剂L345-0044对草菇小纽扣期作用进行保鲜的方法。
背景技术
草菇(Volvariella volvacea)被称为“中国菇”，是一种重要的食用菌。草菇不仅味道鲜美，而且具有重要的医疗保健作用，如抗氧化、调节免疫、抗肿瘤等。草菇肉质鲜美且生长周期短(大约10天左右)，本应成为经济效益很高的食用菌。然而，草菇菌丝的生长和结实要求比较高的温度(28–35℃)，尤其是其菌丝和子实体不耐低温，即使在常规低温4℃下，菌丝和子实体在短时间内便会软化、液化甚至腐烂，即通常所说的“低温自溶”。草菇“低温自溶”的独特性提出了保鲜难题。所以，一直以来草菇的货架期明显短于其它菇类，使其栽培和普及受到极大地限制，也间接影响了降解秸秆经济效益的发挥。
对草菇保鲜技术方面的研究已有展开，但都通过作用于草菇子实体进行保鲜。例如，采用乙烯利和1-甲基环丙烯(1-MCP)作用于蛋形期的草菇，发现1-MCP具有一定的保鲜作用；有报道发现一定配比的壳聚糖复合膜能够有效阻止水分的散失，降低失重率，并在一定程度上抑制营养物质的损失，从而延长保鲜期；还有使用化学药剂浸泡方法对草菇保鲜进行研究，如通过加入氯化钠、VC、柠檬酸溶液对草菇有一定的防腐、防褐变作用。还有些方式尽管能保鲜却影响了草菇品质。例如，表面低温风干处理和微波加热杀菌处理。综上，将这些技术作用于采收后的草菇子实体，普遍存在效果不显著、影响品质等问题。
泛素结合酶E2(ubiquitin-conjugating enzyme，UBE2)家族以泛素结合酶方式起作用，直接控制下游底物的修饰类型，在泛素化修饰过程中起核心级联作用。泛素化修饰的蛋白参与信号传导、内吞作用、膜蛋白转运、DNA修复、蛋白降解等多个细胞活动。
近来研究发现一种类型的草菇泛素化结合酶E2(a type of ubiquitin-conjugating E2 enzyme，UBEV2)上调表达促进低温自溶，通过加入UBEV2的小分子抑制剂L345-0044能够一定程度抑制低温自溶，减轻低温对草菇的伤害。在此基础上，就有可能利用小分子L34-0044化合物研发针对草菇生长阶段作用的低温保鲜技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用草菇泛素化结合酶E2抑制剂L345-0044对草菇小纽扣期作用进行保鲜的方法，所述的这种对草菇进行保鲜的方法要解决现有技术中直接针对草菇子实体进而产生的草菇的保鲜效果不佳、实用性不强、食品安全性等问题。
本发明提供了一种采用草菇泛素化结合酶E2抑制剂对草菇小纽扣期作用进行保鲜的方法，所述的草菇泛素化结合酶E2抑制剂L345-0044的结构式如下所示：
本发明通过设计不同浓度的L345-0044抑制剂化合溶液进行草菇抗冻实验验证，为草菇低温保鲜技术的研发提供最优的方案。本发明基于已报道的UBEV2抑制剂小分子化合物L345-0044对草菇低温保鲜具有一定的改善作用，但该研究采用现有技术中直接针对草菇子实体浸泡作用的方式，该作用方式容易产生可推广性不强及潜在食品安全性等普遍性问题。此外，该研究没有对不同浓度的小分子化合物L345-0044进行对照实验，对草菇生长阶段的作用效果也没有研究。为此，本发明对小分子化合物L345-0044作用方式、作用浓度和作用节点进行研究，为草菇低温保鲜技术的推广提供技术和理论指导。
本发明和已有技术相比，其技术效果是积极和明显的。本发明采用草菇UBEV2小分子抑制剂化合物L345-0044对小纽扣期喷洒处理作用进行保鲜方法，本发明具有以下优点：
(1)较好的解决了现有保鲜技术中直接针对草菇子实体浸泡作用，进而产生的草菇的保鲜效果不佳、实用性不强、食品安全性等问题。
(2)较好的解决了利用小分子化合物L345-0044溶液进行草菇低温保鲜的浓度和剂量问题。
(3)较好的解决了利用小分子化合物L345-0044溶液进行草菇低温保鲜的实验作用方式及作用节点的问题。
(4)显著提升了现有技术中进行草菇低温保鲜的抗冻效果。
附图说明
图1为抑制剂L345-0044小分子化合物的结构式。
图2显示了化合物L345-0044与UBEV2相互作用模式图。图中箭头所指的stick表示靶中的化合物L345-0044。其它stick表示UBEV2上的关键氨基酸残基，也正是这些氨基酸参与了与小分子化合物L345-0044的结合。
图3显示了草菇小纽扣期生长阶段。
图4显示了经100μM的L345-0044溶液喷洒处理的草菇子实体4℃低温保鲜实验。在草菇小纽扣期进行喷洒处理。h代表小时。
图5显示了子实体样品间基因表达水平相关性。G0H为对照处理子实体，G24H为水浸泡处理的4℃保鲜24小时的子实体，GL24H为150μM的L345-0044浸泡处理的4℃保鲜24小时的子实体，P0H为100μM的L345-0044溶液喷洒对照处理的子实体，P24H为100μM的L345-0044溶液喷洒处理的4℃保鲜24小时的子实体，P48H为100μM的L345-0044溶液喷洒处理的4℃保鲜48小时的子实体。浸泡处理直接采用子实体进行作用，而喷洒处理在草菇小纽扣期生长阶段进行喷洒，然后收集子实体进行保鲜。
图6显示了样品间基因表达主成分分析。子实体样品编号参照图5标题注释。
图7显示了样品间差异基因的热图分析。子实体样品编号参照图5标题注释。
图8显示了经水喷洒处理的草菇子实体4℃保鲜实验。h代表小时。
图9显示了经50μM喷洒处理的草菇子实体4℃保鲜实验。h代表小时。
图10显示了经150μM溶液浸泡2分钟处理的草菇子实体4℃保鲜实验。h代表小时。
具体实施方式
实施例1
①分子对接
图2中箭头所指的stick表示靶中的化合物L345-0044，其它stick表示UBEV2上的关键氨基酸残基，也正是这些氨基酸参与了与小分子化合物L345-0044的结合。L345-0044与Ile78的主链羰基，Asp79的侧链羧基形成了2条氢键。同时与结合位点的Thr73,Ile78,Leu83,Phe84,Asp86(侧链的疏水部分)，His138,Ile141等氨基酸形成较强的疏水相互作用。可见，氢键和疏水相互作用共同维持了化合物L345-0044与靶点UBEV2的结合。
②对接打分与分子量的比值
L345-0044对接打分7.04，位于文献报道(万佳宁等.草菇UBEV2蛋白同源模建筛选其小分子抑制剂.食用菌学报,2020,27(4):35-42)的UBEV2高通量虚拟筛选获得的150个化合物打分区间中间(6.58-8.06)。该文献报道将草菇子实体浸泡到L345-0044溶液能够减轻低温对草菇的伤害。该化合物的对接打分与分子量的比值是0.0258，排名前二，远高于均值0.018(表1)，这就提示对接打分与分子量的比值与小分子化合物对UBEV2活性的抑制作用成正相关。
表1
实施例2
①小纽扣期喷洒
草菇的生长分为菌丝，原基，小纽扣期，大纽扣期，蛋形期，伸长期，开伞期等时期。考虑到草菇的原基期菇太小，在这个时期喷洒，会损害草菇的生长。因此，我们选择了草菇的小纽扣期(图3)进行喷洒实验。使用L345-0044加水配比成50μM、100μM、150μM浓度的溶液，对每框(40cm*60cm)的菇进行喷洒，连续喷两天，第一天15ml，第二天35ml，每天一次，间隔24小时，喷洒以水滴挂住菇体为标准。第四天收集大小均一的草菇子实体进行4℃保鲜。
②喷洒处理下的4℃低温保鲜实验
结果显示：100μM处理的子实体，在24小时、48小时低温处理中，菇形保持较为完整，表面干燥；切面图显示子实体几乎没有褐变产生，维持了较为新鲜的状态(图4)。100μM处理的子实体的各项表观特征都显著优于对照和其它浓度喷洒作用后的子实体。
实施例3
①浸泡处理下的子实体的4℃保鲜实验
使用150μM的L345-0044溶液浸泡处理草菇子实体2min,对照采用水处理，然后分别放入4℃进行24h，48h保鲜实验。
②绝对定量转录组分析
对浸泡处理的样品放入到4℃进行24小时保鲜实验，提取对应样品进行绝对定量转录组分析，主要步骤为：样品经过RNA抽提、纯化、建库之后，采用第二代测序技术(Next-Generation Sequencing，NGS)，基于Illumina测序平台，对这些文库进行双末端(Paired-end，PE)测序。对测序获得reads进行过滤和参考基因组比对处理，获得基因表达数据,以此进行样品间的表达量分析。
③4℃保鲜下的喷洒处理样品的绝对定量转录组分析
对4℃保鲜下的100μM喷洒样品采用上述的绝对定量转录组技术进行二代测序，获得基因表达数据，以此进行样品间表达量分析。
结果显示100μM溶液喷洒处理24小时(P24H1,P24H2,P24H3)和48小时(P48H1,P48H2,P48H3)的样品相关度极高(>0.8)。这些样品与150μM溶液浸泡处理下低温保鲜24小时的样品(GL24H1,GL24H2,GL24H3)具有一定的相关性，但相关度还不及GL24H与对照水溶液浸泡处理下低温保鲜24小时的样品(G24H1,G24H2,G24H3)的相关度(图5)。主要成分分析显示抑制剂溶液处理的方式显著影响了样品间的表达谱，而不同低温保鲜时间对于喷洒处理下的样品表达谱影响不大(图6)。热图分析显示对照水浸泡处理的样品和150μM溶液浸泡处理的样品聚为一类，表明浸泡处理方式对于UBEV2的抑制效果有待改进(图7)。
以上结果表明相比浸泡处理的方式，喷洒处理的方式显著促进了抑制剂的作用效果，进而加强了草菇的抗冻作用。
对比例1
(1)采用水作为对照处理，进行同样剂量的喷洒实验。
(2)结果显示：经过水处理的子实体，在24小时低温保存中，菇形出现萎缩，塌陷；切面图显示子实体部分出现了褐变现象。在48小时低温保存中，菇形已经严重变形，塌陷；切面图显示子实体已经完全褐变和溶解(图7)。
对比例2
(1)采用50μM溶液作为对照，进行同样剂量的喷洒实验。
(2)结果显示：经过50μM溶液处理的子实体，在24小时低温保存中，菇形保持较为完好；切面图显示子实体出现了轻微褐变现象。在48小时低温保存中，菇形已经变形，部分塌陷；切面图显示子实体出现了严重的褐变和溶解现象(图8)。
对比例3
(1)采用150μM溶液作为对照，进行同样剂量的喷洒实验。
(2)结果显示：经过150μM溶液处理的子实体，在24小时低温保存中，菇形保持较为完好；切面图显示子实体出现了轻微褐变现象。在48小时低温保存中，菇形已经出现部分变形，塌陷；切面图显示子实体外围出现褐变和溶解现象(图9)。
对比例4
(1)采用150μM溶液作为对照，进行浸泡2分钟实验。
(2)结果显示：经过150μM溶液处理的子实体，在24小时低温保存中，菇形保持较为完好；切面图显示子实体出现了轻微褐变现象。在48小时低温保存中，菇形已经出现部分变形，塌陷；切面图显示子实体外围出现褐变和溶解现象(图10)。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
机译： 通过使用环氧合酶-2抑制剂提供类固醇保护作用的方法和包含环氧合酶-2抑制剂的组合物
机译： N-（4-（3--氯-羟基-2-1,3,5-三嗪il）苄基）-羧酰胺的衍生物，可作为微粒体前列腺素e2合酶的抑制剂（Mpegs-1，-1）组成和方法准备相同
机译： 在包含酶，酶抑制剂或受体配体和/或其前药的药物中，用于评估药物的药理作用的测试剂以及用于筛选具有优异管理作用和/或副作用小的药物的方法和试剂。
