一种测定农田环境水中兽用抗生素的方法

技术领域

本发明属于环境监测技术领域，具体涉及一种测定农田环境水中兽用抗生素的方法。

背景技术

随着越来越多的病原菌对常用典型抗生素药物产生耐药性，进一步加速了寻找替代药物的步伐，一些非典型的兽用抗生素药物逐渐进入人们的视线，例如去甲万古霉素、万古霉素、吡利霉素、克林霉素、泰妙菌素、沃尼妙林和泰万菌素。然而，越来越多的兽用抗生素被使用，可能导致农田环境中兽用抗生素残留。因此需要对农田环境中的兽用抗生素进行检测。

目前，对喹诺酮类、四环素类、青霉素类和大环内酯类等常用的典型兽用抗生素的检测方法已很成熟，既有国家标准、行业标准，也有不少兽药多残留同时测定的研究论文，但对一些非典型的兽用抗生素研究较少。另外目前非典型兽用抗生素的检测方法均是对单一类别兽用抗生素进行检测，导致检测效率低，需要不同处理方法和检测方法进行多次检测。

发明内容

本发明为了解决上述技术问题提供一种测定农田环境水中兽用抗生素的方法，能够针对非典型的兽用抗生素进行检测，另外能够同时检测多种兽用抗生素，大大提高了检测效率。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种测定农田环境水中兽用抗生素的方法，包括以下步骤：

S1、取来自农田环境的水样，离心后，取上清液，置于60mg/3cc的HLB固相萃取柱中，再加入浓度为10％体积分数的甲醇水溶液淋洗，弃去全部流出液，再减压抽干，用色谱纯甲醇洗脱，得到洗脱液；将所述洗脱液先浓缩至干，再溶解，过滤，得到处理后的样品；

S2、将步骤S1得到的处理后的样品采用液相色谱-串联质谱仪检测，即得到农田环境中兽用抗生素的含量。

本发明的有益效果是：

(1)采用本方法能够一次检测去甲万古霉素、万古霉素、吡利霉素、克林霉素、泰妙菌素、沃尼妙林和泰万菌素共7种兽用抗生素，不需要分类进行检测，大大提高了检测效率，使得只需要采集一次样品即可，非常方便；

(2)本方法对7种兽用抗生素的净化富集效果好，回收率高，检测的准确性较高，检测的标准偏差低，重现性较好，能够广泛应用在农田水环境的检测。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步，在步骤S1中，所述离心的转速为5000-10000r/min，时间为5-10min。

采用上述进一步方案的有益效果是：获得更澄清的样品，更利于富集。

进一步，在步骤S1中，所述HLB固相萃取柱先采用色谱纯甲醇和蒸馏水各清洗一次。

采用上述进一步方案的有益效果是：避免杂质影响。

进一步，在步骤S1中，所述浓缩至干为置于40-50℃水浴温度下，采用氮气吹干。

采用上述进一步方案的有益效果是：利于甲醇的挥发。

进一步，在步骤S1中，所述溶解采用的溶剂为浓度为10％体积分数的甲醇水溶液。

采用上述进一步方案的有益效果是：利于减少仪器测定时的溶剂效应和减少杂质的溶解。

进一步，在步骤S1中，所述过滤采用孔径为0.22μm的PTFE滤膜。

采用上述进一步方案的有益效果是：利于减少滤膜对化合物的吸附，提高回收率。

进一步，在步骤S2中，所述液相色谱-串联质谱法检测的色谱条件为：ACQUITYUPLC BEH C18色谱柱，内径为2.1mm，长度为100mm，粒径为1.7μm；流动相的流速为0.3mL/min，色谱柱的柱温为40℃；流动相为甲醇和0.1％体积分数的甲酸水溶液，进样量为2μL。

采用上述进一步方案的有益效果是：7种抗生素能够在较短的时间内达到较好的色谱分离，灵敏度较高，且干扰小；提高了检测效率。

进一步，在步骤S2中，所述液相色谱-串联质谱法检测的质谱条件为：离子源温度为150℃，毛细管电压为3.0kV；脱溶剂气体为氮气，脱溶剂气温度为300℃，脱溶剂气流速为800L/h，碰撞气体为氩气，碰撞气流速为0.15mL/min。

采用上述进一步方案的有益效果是：利于对7种抗生素的定性定量检测。

附图说明

图1为本发明的实验例2中，吡利霉素的提取离子色谱图；

图2为本发明的实验例2中，万古霉素的提取离子色谱图；

图3为本发明的实验例2中，去甲万古霉素的提取离子色谱图；

图4为本发明的实验例2中，泰万菌素的提取离子色谱图；

图5为本发明的实验例2中，沃尼妙林的提取离子色谱图；

图6为本发明的实验例2中，泰妙菌素的提取离子色谱图；

图7为本发明的实验例2中，克林霉素的提取离子色谱图；

图8为本发明的实验例3中，7种抗生素采用两种固相萃取柱的回收率柱状图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

本实施例提供一种测定农田环境水中兽用抗生素的方法，包括以下步骤：

S1、取来自农田环境的水样，摇匀后取10mL放入15mL离心管中，先采用转速为5000r/min离心5min，取出离心管，取60mg/3cc的HLB固相萃取柱先依次加入3mL的甲醇和3mL的超纯水各清洗一次，实现预处理，待清洗液完全流出后，取8mL离心好的上清液加入到HLB固相萃取柱中，加入3mL的10％体积分数的甲醇水溶液淋洗所述HLB固相萃取柱，弃去全部流出液，得到待洗脱的固相萃取柱，减压抽干所述待洗脱的固相萃取柱，采用3mL甲醇洗脱所述待洗脱的固相萃取柱，采用玻璃试管收集流出液体，得到洗脱液，将洗脱液置于40℃水浴温度下，采用氮气吹干，得到固体残渣，再将固体残渣采用1mL的10％体积分数的甲醇水溶液溶解，经0.22μm的PTFE滤膜过滤，得到处理后的样品。

S2、将步骤S1得到的处理后的样品采用液相色谱-串联质谱仪检测，即得到农田环境水中兽用抗生素的含量。

其中，液相色谱-串联质谱法检测的色谱条件为ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱，内径为2.1mm，长度为100mm，粒径为1.7μm。流动相的流速为0.3mL/min，色谱柱的柱温为40℃。进样量2μL；流动相A为甲醇，流动相B为0.1％体积分数的甲酸水溶液，梯度洗脱程序为：0～2.0min，90％～80％流动相B；2.0～3.5mim，80％～50％流动相B；3.5～5.0min，50％～40％流动相B；5.0～6.5min，40％～20％流动相B；6.5～7.0min，20％～10％流动相B，7.0～7.1min，10％～90％流动相B，7.1～8.5min，90％～90％流动相B。

其中，所述液相色谱-串联质谱法检测的质谱条件为：电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描方式，多反应监测(MRM)模式。质谱检测中的离子源温度为150℃，毛细管电压为3.0kV。质谱检测中的脱溶剂气体为氮气，脱溶剂气温度为300℃，脱溶剂气流速为800L/h，碰撞气体为氩气，碰撞气流速为0.15mL/min。

实施例2

S1、取来自农田环境的水样，摇匀后取10mL放入15mL离心管中，先采用转速为7000r/min离心10min，取出离心管，取60mg/3cc的HLB固相萃取柱先依次加入3mL的甲醇和3mL的超纯水各清洗一次，实现预处理，待清洗液完全流出后，取8mL离心好的上清液加入到HLB固相萃取柱中，加入3mL的10％体积分数的甲醇水溶液淋洗所述HLB固相萃取柱，弃去全部流出液，得到待洗脱的固相萃取柱，减压抽干所述待洗脱的固相萃取柱，采样3mL甲醇洗脱所述待洗脱的固相萃取柱，采用玻璃试管收集流出液体，得到洗脱液，将洗脱液置于45℃水浴温度下，采用氮气吹干，得到固体残渣，再将固体残渣采用1mL的10％体积分数的甲醇水溶液溶解，经0.22μm的PTFE滤膜过滤，得到处理后的样品。

S2、将步骤S1得到的处理后的样品采用液相色谱-串联质谱仪检测，即得到农田环境水中兽用抗生素的含量。

其中，液相色谱-串联质谱法检测的色谱条件为ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱，内径为2.1mm，长度为100mm，粒径为1.7μm。流动相的流速为0.3mL/min，色谱柱的柱温为40℃。进样量2μL；流动相A为甲醇，流动相B为0.1％体积分数的甲酸水溶液，梯度洗脱程序为：0～2.0min，90％～80％流动相B；2.0～3.5mim，80％～50％流动相B；3.5～5.0min，50％～40％流动相B；5.0～6.5min，40％～20％流动相B；6.5～7.0min，20％～10％流动相B，7.0～7.1min，10％～90％流动相B，7.1～8.5min，90％～90％流动相B。

其中，所述液相色谱-串联质谱法检测的质谱条件为：电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描方式，多反应监测(MRM)模式。质谱检测中的离子源温度为150℃，毛细管电压为3.0kV。质谱检测中的脱溶剂气体为氮气，脱溶剂气温度为300℃，脱溶剂气流速为800L/h，碰撞气体为氩气，碰撞气流速为0.15mL/min。

实施例3

S1、取来自农田环境的水样，摇匀后取10mL放入15mL离心管中，先采用转速为10000r/min离心8min，取出离心管，取60mg/3cc的HLB固相萃取柱先依次加入3mL的甲醇和3mL的超纯水各清洗一次，实现预处理，待清洗液完全流出后，取8mL离心好的上清液加入到HLB固相萃取柱中，加入3mL的10％体积分数的甲醇水溶液淋洗所述HLB固相萃取柱，弃去全部流出液，得到待洗脱的固相萃取柱，减压抽干所述待洗脱的固相萃取柱，采样3ml甲醇洗脱所述待洗脱的固相萃取柱，采用玻璃试管收集流出液体，得到洗脱液，将洗脱液置于50℃水浴温度下，采用氮气吹干，得到固体残渣，再将固体残渣采用1mL的10％体积分数的甲醇水溶液溶解，经0.22μm的PTFE滤膜过滤，得到处理后的样品。

S2、将步骤S1得到的处理后的样品采用液相色谱-串联质谱仪检测，即得到农田环境水中兽用抗生素的含量。

其中，液相色谱-串联质谱法检测的色谱条件为ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱，内径为2.1mm，长度为100mm，粒径为1.7μm。流动相的流速为0.3mL/min，色谱柱的柱温为40℃。进样量2μL；流动相A为甲醇，流动相B为0.1％体积分数的甲酸水溶液，梯度洗脱程序为：0～2.0min，90％～80％流动相B；2.0～3.5mim，80％～50％流动相B；3.5～5.0min，50％～40％流动相B；5.0～6.5min，40％～20％流动相B；6.5～7.0min，20％～10％流动相B，7.0～7.1min，10％～90％流动相B，7.1～8.5min，90％～90％流动相B。在流动相中加入一定的酸能改善化合物的峰形和保留，更有利于混合物的分离。

其中，所述液相色谱-串联质谱法检测的质谱条件为：电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描方式，多反应监测(MRM)模式。质谱检测中的离子源温度为150℃，毛细管电压为3.0kV。质谱检测中的脱溶剂气体为氮气，脱溶剂气温度为300℃，脱溶剂气流速为800L/h，碰撞气体为氩气，碰撞气流速为0.15mL/min。

实验例1

对需要检测的抗生素进行ESI扫描和质谱条件优化，以确定抗生素的质谱参数。具体的抗生素为去甲万古霉素、万古霉素、吡利霉素、克林霉素、泰妙菌素、沃尼妙林和泰万菌素。抗生素具体质谱参数如表1。

表1 7种抗生素的MRM质谱参数

*为定量离子

实验例2

将去甲万古霉素、万古霉素、吡利霉素、克林霉素、泰妙菌素、沃尼妙林和泰万菌素共7种抗生素加标到水样中进行高效液相色谱-串联质谱法检测，以甲醇-0.1％体积分数的甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，从而确定色谱条件，来保证能够分离和检测到对应的7种抗生素。其中，7种抗生素的添加量均为1ng/mL。具体如图1-图7。

从图1-图7可以看出7种抗生素能够在较短的时间内达到较好的色谱分离，灵敏度较高，且干扰小。其中每种抗生素色谱定性检测时，分为两对离子对，其中，图1为吡利霉素的提取离子色谱图，母离子/子离子1(411.16/112.06)，母离子/子离子2(411.16/363.13)。图2为万古霉素的提取离子色谱图，母离子/子离子1(724.93/144.06)，母离子/子离子2(724.93/100.06)。图3为去甲万古霉素的提取离子色谱图，母离子/子离子1(717.93/144.06)，母离子/子离子2(717.93/99.99)。图4为泰万菌素的提取离子色谱图，母离子/子离子1(1042.45/109.00)，母离子/子离子2(1042.45/174.07)。图5为沃尼妙林的提取离子色谱图，母离子/子离子1(565.39/263.06)，母离子/子离子2(565.39/163.86)。图6为泰妙菌素的提取离子色谱图，母离子/子离子1(494.33/192.00)，母离子/子离子2(494.33/119.00)。图7为克林霉素的提取离子色谱图，母离子/子离子1(424.99/126.06)，母离子/子离子2(424.99/377.09)。

实验例3

将去甲万古霉素、万古霉素、吡利霉素、克林霉素、泰妙菌素、沃尼妙林和泰万菌素共7种抗生素分别加标到水样中，采用C18(200mg/3cc)和Oasis HLB(60mg/3cc)2种固相萃取柱净化，并按照实施例1的方法来对比7种抗生素的回收率，具体如图8所示。

从图8可以看出，采用C18(200mg/3cc)固相萃取柱时，去甲万古霉素和万古霉素回收率偏低，而采用Oasis HLB(60mg/3cc)固相萃取柱时，7种抗生素回收率均达到70％以上。因此，采用本方法对7种抗生素的检测准确性高，在选定的仪器条件下测定，样品基质对目标化合物的定性和定量分析基本无干扰。

实验例4

用空白样品溶液将去甲万古霉素、万古霉素、吡利霉素、克林霉素、泰妙菌素、沃尼妙林和泰万菌素共7种抗生素配制成5个不同浓度的混合标准工作溶液，使得5个混合标准工作溶液中去甲万古霉素和万古霉素的浓度分别为2、4、20、100、200ng/mL，吡利霉素、克林霉素、泰妙菌素、沃尼妙林和泰万菌素的浓度分别为0.2、0.4、2、10、20ng/mL，按照本实施例1的方法进行检测，并拟合成线性回归方程，具体结果如表2。

表2 7种抗生素的回归方程、相关系数(r)、检测限(LOD)和定量限(LOQ)

从表2的数据可以看出，在2-200ng/mL范围内，去甲万古霉素和万古霉素线性关系良好，相关系数均>0.999；在0.2-20ng/mL范围内，吡利霉素、克林霉素、泰妙菌素、沃尼妙林、泰万菌素线性关系良好，相关系数均>0.999。通过加标回收实验得到去甲万古霉素和万古霉素的方法检测限为0.2ng/mL定量限为0.4ng/mL；吡利霉素、克林霉素、泰妙菌素、沃尼妙林、泰万菌素的方法检测限均达到0.02ng/mL定量限均达到0.04ng/mL。

实验例5

在环境水空白样品中添加不同浓度水平的混合标准工作溶液，使得环境水样品中去甲万古霉素和万古霉素的含量为0.4ng/mL、2ng/mL和20ng/mL，吡利霉素、克林霉素、泰妙菌素、沃尼妙林、泰万菌素的含量为0.04ng/mL、0.2ng/mL和2ng/mL，每个添加浓度设6个平行重复，同时做空白对照，按实施例1的方法进行操作，计算平均回收率及相对标准偏差(RSD)，结果如表3。

表3 7种抗生素在沼液中的加标回收率和RSD结果(n＝6)

从表3可以看出，7种抗生素在环境水样品中的回收率为73.7％-96.7％，相对标准偏差为1.8％-6.1％，说明本方法准确度较高、重现性较好，适用于环境水中这7种非典型抗生素的测定。

实验例6

实际运用本实施例1的方法对25个环境水样品进行检测，其中11个环境水样品中检出了泰妙菌素，检出值范围在0.30-32μg/L，而去甲万古霉素、万古霉素、吡利霉素、克林霉素、沃尼妙林和泰万菌素在这25个环境水样品中均未检出。

目前未有同时测定水环境中这7种抗生素的方法，一般都是同时测定其中一个类别的抗生素，如吡利霉素和克林霉素(林克胺类)，或泰妙菌素和沃尼妙林(双萜类抗生素)，或去甲万古霉素和万古霉素(糖肽类抗生素)，且测定的样品也多是畜禽产品、水产品。本方法具有先进性、创新性和可操作性，适用于同时测定水环境中7种非典型抗生素。

需要注意的是，本发明中的“包括”意指其除所述成分外，还可以包括其他成分，所述的“包括”，还可以替换为封闭式的“为”或“由……组成”。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。