一种提高精液保存品质的精液保存液及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及动物繁殖育种技术领域，具体地说，涉及一种提高精液保存品质的精液保存液及其制备方法与应用。

背景技术

精液冷冻保存与人工授精技术相结合，在现代畜牧业生产中发挥着巨大的作用，能大量减少公畜的饲养数量，降低生产成本，提高优秀种公畜的利用率，为畜牧业带来巨大的经济效益。现阶段，马和驴繁殖主要采用本交或将采出的精液(鲜精)不稀释或低倍稀释立即给发情母畜输精，这种方法适用于季节性发情而且数量较多的母畜。精液低温和冷冻保存技术能充分利用优良种畜的遗传资源，迅速扩大畜群的良种比例，且不受时间和空间限制。

在马属动物，人工授精可使精液利用效率提高5～20倍。但是马和驴的品种较多，养殖区一般分布较广，多在山区或交通不便区域，且饲养方式多以散户居多，母畜分布不集中，人工授精技术推广面积很小。由于马、驴鲜精体外保存时间极短，几小时后活力近乎丧失，这使得马、驴的人工授精技术应用受到限制。随着马、驴产业的发展，人工授精的应用势在必行，生产中迫切需要保存时间长和运输方便的优质精液作为技术支撑。

精液保存分为常温、低温和冷冻保存三种方法。常温保存技术研究开展得最早，相对比较成熟，但在常温下(25℃)，一方面微生物生长迅速会影响精液质量，另一方面常温保存时精子活力下降较快，保存时间1～3天。低温保存的温度为4℃，保存时间为一周左右，比常温保存时间长，比冷冻保存简单方便、成本低。冷冻保存是指将精液经过特殊处理后置于液氮或-80℃中保存，时间可达数年甚至数十年，通过液氮容器可实现长距离运输，能充分发挥良种公畜的遗传价值。

性能优良且适宜的精液保存液是保证保存精液质量的关键，目前关于马属动物的精液保存液的研究仍较少，其中关于驴精液低温和冷冻保存的研究更是十分有限，主要原因在于：(1)驴精子对低温特别敏感且个体间存在较大差异，在冷冻解冻过程中极易损伤；(2)精子密度小，精清中的电解质成分会促进精子早衰。因而，驴的冷冻精液生产操作程度复杂，难度大，严重制约着冷冻精液的应用。近年来，马属动物低剂量输精技术的发展对精液保存效果提出了更高要求。因此，提高冷冻解冻、液态长时间体外保存后的精液品质是畜牧生产上亟待解决的问题。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种能够提高动物精子质量的精液保存液及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种提高精液品质的精液保存液，所述精液保存液按体积份计算，包括：60-80份精液稀释基础液和20-30份卵黄液，其中：

所述精液稀释基础液包括A液和B液(由A液和B液组成)；所述A液包括混合糖、柠檬酸盐、氨基酸、缓冲试剂和抗生素；B液为脱脂奶液。

本发明提供了一种可以提高动物精液保存品质的精液保存液。本发明提供的保存液能够显著延长液态保存时间和提高常温、低温保存或冷冻解冻后的精子活力。

本发明所述的精液保存液，关于所述精液稀释基础液：

每100ml A液包括如下成分：

混合糖4-9g，柠檬酸盐0.1-0.6g，氨基酸10-150mmol，缓冲试剂0.5-3g，抗生素10-80万IU。

所述精液稀释基础液中，所述混合氨基酸选自L-脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、谷氨酸中的一种或多种。经过发明人大量的研究发现，选用L-脯氨酸的效果最好。

所述精液稀释基础液中，混合糖选自葡萄糖、乳糖、棉子糖和海藻糖中的至少两种，作为优选，所述混合糖包括比例为(3-8)：(0.1-0.5)：(0.1-0.5)的葡萄糖、乳糖、和棉子糖。这三种糖按比例复配能够为精子提供多种能量底物，增加保护效果。

进一步地，所述混合糖与氨基酸的比例为(5-7)g：(10-150)mmol；发明人意外的发现，糖与氨基酸存在协同功效，当控制在上述比例时，该协同作用可稳定发挥，特别是当糖为葡萄糖、乳糖和棉子糖的混合物，且氨基酸为L-脯氨酸时，保存效果稳定，显著好于其他混合糖和/或其他氨基酸组合。更优选地，所述混合糖与氨基酸的比例为(5-7)g：(10-100)mmol。

所述柠檬酸盐选自柠檬酸钾、柠檬酸钠和柠檬酸钙等中的一种或几种；优选地，所述柠檬酸盐为柠檬酸钠和柠檬酸钾的混合物，质量比为柠檬酸钠：柠檬酸钾＝(5-6)：(6-10)。优势为对维持稀释液相对稳定的pH值起重要作用。

所述缓冲试剂选自HEPES、Tris、TES、MOPS和TAPSO中的一种或几种，优选MOPS或HEPES。

所述抗生素选自青霉素、链霉素、庆大霉素中的两种，优选青霉素和链霉素按照(1-2)：1的比例复配。

所述B液为脱脂奶液，所述脱脂奶液中的脂肪含量低于0.1％、蛋白质高于3％；所述脱脂奶液中，脱脂奶粉的质量体积百分含量为5-20％。

本发明还提供一种B液的优选制备方法：以100ml计，包括脱脂奶粉6-10g，以无菌纯水定容至100ml；优选以如下方法制备得到：配制B液待充分溶解后，以115℃高压灭菌10min，再冷却至室温。其中，所述脱脂奶粉的脂肪含量需低于0.1％、蛋白质含量高于30％。

本发明所述的精液稀释基础液中，A液与B液的体积比为(4-6)：5；优选1:1。

本发明所述的低温和冷冻保存液，关于所述卵黄液：

所述卵黄液中，卵黄的体积百分含量不低于15％，其余成分优选为上述精液稀释基础液。

优选地，所述卵黄液中，卵黄的含量为20～25％。

所述卵黄来自于鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋中的一种或几种；优选鸡蛋。

鸡蛋应选择农家自产鸡蛋或者来源于无疫病的鸡场，且所使用鸡蛋须新鲜、完整、净洁，取用卵黄前先用75％酒精棉球对蛋壳表面进行消毒。待酒精挥发尽后，在鸡蛋腰中线处敲开一裂纹，将鸡蛋一分两半，利用二个蛋壳交替倾倒的方法，除去蛋清，留下卵黄。卵黄放在干净滤纸上滚去多余蛋清。用灭菌的注射器穿过卵黄膜抽取卵黄。

所述卵黄液优选以如下方法制备得到：取抽卵黄15-25mL(更优选20mL)，加入精液稀释基础液至100mL，充分搅拌；4℃条件下2000-3000g(更优选2800×g)离心1h；去除沉淀，保留上清液。

作为本发明的优选技术方案，提供一种精液低温和冷冻保存液，其中，每100mL的所述A液包括(由如下组分组成)：

葡萄糖4-8g、乳糖0.2-0.5g、棉子糖0.3-0.5g、柠檬酸钠0.06-0.1g、柠檬酸钾0.05-0.082g、HEPES或MOPS试剂0.8-1.3g、L-脯氨酸10-70mmol，灭菌纯水定容，再加入青霉素10-20万IU和链霉素10-20万IU；

优选地，本发明所述的精液保存液还包含1～10份甘油；或者，所述精液保存液还包含1-10份二甲基甲酰胺和1-10份维生素E。

本发明发现，简单地将甘油替换为二甲基甲酰胺，对于冷冻精液保存质量的提升作用会有所下降，而采用二甲基甲酰胺和维生素E配合使用，与单独添加二甲基甲酰胺相比，则可显著提升冷冻精液保存质量。

作为本发明的一种优选方案，所述精液保存液包含60-80％精液稀释基础液、20-30％卵黄液和1-10％甘油。

作为本发明的另一种优选方案，所述精液保存液包含60-80％精液稀释基础液、20-30％卵黄液、1-10％二甲基甲酰胺和1-10％维生素E。

本发明提供的上述精液保存液可用于精液的常温、低温或冷冻保存；其中，不含甘油、二甲基甲酰胺、维生素E的精液保存液可用于精液的常温或低温保存；含有甘油或含有二甲基甲酰胺和维生素E的所述精液保存液可用于精液的冷冻保存。本发明的精液保存液在用于精液的冷冻保存时，对于精液质量的提升作用更为显著。

第二方面，本发明提供上述精液保存液在精液保存中的应用，所述应用为：采用不含甘油、二甲基甲酰胺、维生素E的所述精液保存液进行精液的常温或低温保存，或者，采用含有甘油或含有二甲基甲酰胺和维生素E的所述精液保存液进行精液的冷冻保存。

本领域技术人员可以理解，在上述任意一项配方下等比例扩大或缩小均属于本发明的保护范围。

第三方面，本发明还提供上述提高精液品质保存液的制备方法，包括如下步骤：

1)配制A液，将混合糖、柠檬酸盐、缓冲试剂和混合氨基酸以灭菌超纯水定容后，加入抗生素，待所有物质充分溶解后，用0.22μm滤器过滤后备用；

2)将B液于115℃高压灭菌10-15min，冷却后备用；

3)将A液和B液混合，得到精液稀释基础液；

4)制备卵黄液；

抽取卵黄，加入所述精液稀释基础液后，在4℃条件下离心1h；去除沉淀保留上清液；

优选离心转速为(2000-3000)×g，(更优选2800×g)；

5)将精液稀释基础液、卵黄液混合，或将精液稀释基础液、卵黄液和甘油混合，或将精液稀释基础液、卵黄液、二甲基甲酰胺和维生素E混合，即得。

第四方面，本发明提供利用上述精液保存液的方法。

具体地，采用不含甘油、二甲基甲酰胺、维生素E的所述精液保存液进行精液的常温或低温保存，或者，采用含有甘油或含有二甲基甲酰胺和维生素E的所述精液保存液进行精液的冷冻保存；所述方法包括：精液的稀释；

本方法所述的精液，优选对精液采集去除胶状物，检测精液的活率、体积、密度，要求鲜精直线前进运动精子率≥70％。

所述稀释，是将精液与所述精液稀释基础液按照2：(1-3)的比例进行稀释，经平衡、离心后(进一步置于25℃平衡10min，600g离心10min弃去上清液)，再以所述精液保存液稀释至(2-10)×10

当采用含有甘油或含有二甲基甲酰胺和维生素E的所述精液保存液进行精液的冷冻保存时，在所述稀释后进行程序化冷冻(优选使用minitube程序化冷冻仪)，冷冻程序如表1所示：

表1精液冷冻保存的冷冻程序

经程序化冷冻至-140℃后，将得到的冻精投入液氮中至少停留5min，之后即可转移至液氮罐进行保存。

优选地，将冻精细管在4℃预平衡2-4小时后再进行冷冻的步骤。

按照本发明所提供的方式进行制备，操作简便，不会影响精子活性。

作为优选，本发明所提供的精液稀释液适用于马属动物的精液保存，因此，所述精液优选来自马属动物。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种可以提高动物精液品质的精液保存液。本发明提供的精液保存液能够显著提高常温保存、低温保存和冷冻保存的精液品质(精子活力等精子质量)，显著延长精液的保存时间，提高保存精液的受胎率，对于冷冻保存解冻后的精液品质的提升作用更优。本发明的精液保存方法操作简便，应用成本低廉，效果显著，对动物不产生任何有害影响。可以在马、驴等马属动物的精液保存及相关的胚胎移植产业和胚胎工程中广泛应用，具有广阔的市场前景。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例提供一种精液冷冻保存液及其制备。

1、成分：葡萄糖、乳糖、棉子糖、柠檬酸钠、柠檬酸钾、MOPS试剂、L-脯氨酸，以上药品均为分析纯；超纯水、脱脂奶粉、青霉素、链霉素、灭菌甘油、新鲜卵黄。

2、制备方法：配制精液冷冻保存液以200mL为例。

A液配置：以100mL计，利用分析天平分别称取葡萄糖6.0000g、乳糖0.3000g、棉子糖0.3000g、柠檬酸钠0.0600g、柠檬酸钾0.0820g、MOPS试剂1.0463g、L-脯氨酸10mmol，使用灭菌超纯水定容至100mL，加入青霉素10万IU、链霉素10万IU，使用0.22μm滤器过滤。

灭菌脱脂奶B液配置：以100mL计，利用分析天平称取脱脂奶粉8.0000g，灭菌超纯水定容至100mL，固体完全溶解后高压灭菌锅115℃高压灭菌10min，冷却至室温。

精液稀释基础液配置：以200mL计，使用量筒称取A液100mL、灭菌脱脂奶B液100mL，两者混合均匀即为200mL精液稀释基础液。

20％卵黄液配置：以200mL计。选择无疫病鸡场的鸡蛋，须新鲜、完整和净洁，取用卵黄前先用75％酒精棉球对蛋壳表面进行消毒。待酒精挥发后，在鸡蛋腰中线处敲开一裂纹，将鸡蛋分两半，利用二个蛋壳交替倾倒的方法，除去蛋清，留下卵黄。卵黄放在无菌滤纸上缓慢滚动以去除多余蛋清。用无菌注射器穿过卵黄膜取抽卵黄40mL，加入精液稀释基础液160mL；在4℃条件下，2800×g离心1h后去除沉淀，留上清液。

冷冻保存液配制：以100mL计，量取精液稀释基础液70mL、20％卵黄液25mL、甘油5mL，混合均匀，即为100mL冷冻保存液。

其他体积的液体按相应比例配置。

实施例2

本实施例提供一种精液冷冻保存液及其制备。

1、成分：葡萄糖、乳糖、棉子糖、柠檬酸钠、柠檬酸钾、HEPES试剂、L-脯氨酸，以上药品均为分析纯；超纯水、脱脂奶粉、青霉素、链霉素、灭菌甘油、新鲜卵黄。

2、制备方法：配制精液冷冻保存液以200mL为例。

A液配置：以100mL计，利用分析天平分别称取葡萄糖6.0000g、乳糖0.3000g、棉子糖0.3000g、柠檬酸钠0.0600g、柠檬酸钾0.0820g、HEPES试剂0.9520g、L-脯氨酸20mmol，使用灭菌超纯水定容至100mL，加入青霉素20万IU、链霉素20万IU，使用0.22μm滤器过滤。

灭菌脱脂奶B液配置：以100mL计，利用分析天平称取脱脂奶粉8.0000g，灭菌超纯水定容至100mL，固体完全溶解后高压灭菌锅115℃高压灭菌10min，冷却至室温。

精液稀释基础液配置：以200mL计，使用量筒称取A液100mL、灭菌脱脂奶B液100mL，两者混合均匀即为200mL精液稀释基础液。

20％卵黄液配置：以200mL计。选择农家自产鸡蛋或者来源于无疫病的鸡场鸡蛋，且所使用鸡蛋须新鲜、完整、净洁，取用卵黄前先用75％酒精棉球对蛋壳表面进行消毒。待酒精挥发干净后，鸡蛋腰中线处敲开一裂纹，将鸡蛋一分两半，利用二个蛋壳交替倾倒的方法，除去蛋清，留下卵黄。卵黄放在无菌滤纸上滚去多余蛋清。用灭菌的注射器穿过卵黄膜取抽卵黄40mL，加入精液稀释基础液160mL；4℃2800×g离心1h；去除沉淀保留上清液。

冷冻保存液配置：以100mL计，使用量筒称取精液稀释基础液70mL、20％卵黄液25mL、甘油5mL，混合均匀即为100mL冷冻保存液。

其他体积的液体按相应比例配置。

实施例3

本实施例提供一种精液冷冻保存液及其制备。

1、成分：葡萄糖、乳糖、棉子糖、柠檬酸钠、柠檬酸钾、HEPES试剂、L-脯氨酸，以上药品均为分析纯；超纯水、脱脂奶粉、青霉素、链霉素、灭菌甘油、新鲜卵黄。

2、制备方法：配制精液冷冻保存液以200mL为例。

A液配置：以100mL计，利用分析天平分别称取葡萄糖6.0000g、乳糖0.3000g、棉子糖0.3000g、柠檬酸钠0.0600g、柠檬酸钾0.0820g、HEPES试剂0.9520g、L-脯氨酸30mmol，使用灭菌超纯水定容至100mL，加入青霉素20万IU、链霉素20万IU，使用0.22μm滤器过滤。

灭菌脱脂奶B液配置：以100mL计，利用分析天平称取脱脂奶粉8.0000g，灭菌超纯水定容至100mL，固体完全溶解后高压灭菌锅115℃高压灭菌10min，冷却至室温。

精液稀释基础液配置：以200mL计，使用量筒称取A液100mL、灭菌脱脂奶B液100mL，两者混合均匀即为200mL精液稀释基础液。

20％卵黄液配置：以200mL计。选择农家自产鸡蛋或者来源于无疫病的鸡场鸡蛋，且所使用鸡蛋须新鲜、完整、净洁，取用卵黄前先用75％酒精棉球对蛋壳表面进行消毒。待酒精挥发干净后，鸡蛋腰中线处敲开一裂纹，将鸡蛋一分两半，利用二个蛋壳交替倾倒的方法，除去蛋清，留下卵黄。卵黄放在无菌滤纸上滚去多余蛋清。用灭菌的注射器穿过卵黄膜取抽卵黄40mL，加入精液稀释基础液160mL；4℃2800×g离心1h；去除沉淀保留上清液。

冷冻保存液配置：以100mL计，使用量筒称取精液稀释基础液70mL、20％卵黄液25mL、甘油5mL，混合均匀即为100mL冷冻保存液。

其他体积的液体按相应比例配置。

实施例4

本实施例提供一种精液冷冻保存液及其制备。

1、成分：葡萄糖、乳糖、棉子糖、柠檬酸钠、柠檬酸钾、HEPES试剂、L-脯氨酸，以上药品均为分析纯；超纯水、脱脂奶粉、青霉素、链霉素、灭菌甘油、新鲜卵黄。

2、制备方法：配制精液冷冻保存液以200mL为例。

A液配置：以100mL计，利用分析天平分别称取葡萄糖6.0000g、乳糖0.3000g、棉子糖0.3000g、柠檬酸钠0.0600g、柠檬酸钾0.0820g、HEPES试剂0.9520g、L-脯氨酸40mmol，使用灭菌超纯水定容至100mL，加入青霉素20万IU、链霉素20万IU，使用0.22μm滤器过滤。

灭菌脱脂奶B液配置：以100mL计，利用分析天平称取脱脂奶粉8.0000g，灭菌超纯水定容至100mL，固体完全溶解后高压灭菌锅115℃高压灭菌10min，冷却至室温。

精液稀释基础液配置：以200mL计，使用量筒称取A液100mL、灭菌脱脂奶B液100mL，两者混合均匀即为200mL精液稀释基础液。

20％卵黄液配置：以200mL计。选择农家自产鸡蛋或者来源于无疫病的鸡场鸡蛋，且所使用鸡蛋须新鲜、完整、净洁，取用卵黄前先用75％酒精棉球对蛋壳表面进行消毒。待酒精挥发干净后，鸡蛋腰中线处敲开一裂纹，将鸡蛋一分两半，利用二个蛋壳交替倾倒的方法，除去蛋清，留下卵黄。卵黄放在无菌滤纸上滚去多余蛋清。用灭菌的注射器穿过卵黄膜取抽卵黄40mL，加入精液稀释基础液160mL；4℃2800×g离心1h；去除沉淀保留上清液。

冷冻保存液配置：以100mL计，使用量筒称取精液稀释基础液70mL、20％卵黄液25mL、甘油5mL，混合均匀即为100mL冷冻保存液。

其他体积的液体按相应比例配置。

实施例5

本实施例提供一种精液冷冻保存液及其制备。

1、成分：葡萄糖、乳糖、棉子糖、柠檬酸钠、柠檬酸钾、HEPES试剂、L-脯氨酸，以上药品均为分析纯；超纯水、脱脂奶粉、青霉素、链霉素、灭菌甘油、新鲜卵黄。

2、制备方法：配制精液冷冻保存液以200mL为例。

A液配置：以100mL计，利用分析天平分别称取葡萄糖6.0000g、乳糖0.3000g、棉子糖0.3000g、柠檬酸钠0.0600g、柠檬酸钾0.0820g、HEPES试剂0.9520g、L-脯氨酸50mmol，使用灭菌超纯水定容至100mL，加入青霉素20万IU、链霉素20万IU，使用0.22μm滤器过滤。

灭菌脱脂奶B液配置：以100mL计，利用分析天平称取脱脂奶粉8.0000g，灭菌超纯水定容至100mL，固体完全溶解后高压灭菌锅115℃高压灭菌10min，冷却至室温。

精液稀释基础液配置：以200mL计，使用量筒称取A液100mL、灭菌脱脂奶B液100mL，两者混合均匀即为200mL精液稀释基础液。

20％卵黄液配置：以200mL计。选择农家自产鸡蛋或者来源于无疫病的鸡场鸡蛋，且所使用鸡蛋须新鲜、完整、净洁，取用卵黄前先用75％酒精棉球对蛋壳表面进行消毒。待酒精挥发干净后，鸡蛋腰中线处敲开一裂纹，将鸡蛋一分两半，利用二个蛋壳交替倾倒的方法，除去蛋清，留下卵黄。卵黄放在无菌滤纸上滚去多余蛋清。用灭菌的注射器穿过卵黄膜取抽卵黄40mL，加入精液稀释基础液160mL；4℃2800×g离心1h；去除沉淀保留上清液。

冷冻保存液配置：以100mL计，使用量筒称取精液稀释基础液70mL、20％卵黄液25mL、甘油5mL，混合均匀即为100mL冷冻保存液。

其他体积的液体按相应比例配置。

实施例6

本实施例提供一种精液冷冻保存液及其制备。

1、成分：葡萄糖、乳糖、棉子糖、柠檬酸钠、柠檬酸钾、HEPES试剂、L-脯氨酸，以上药品均为分析纯；超纯水、脱脂奶粉、青霉素、链霉素、灭菌甘油、新鲜卵黄。

2、制备方法：配制精液冷冻保存液以200mL为例。

A液配置：以100mL计，利用分析天平分别称取葡萄糖6.0000g、乳糖0.3000g、棉子糖0.3000g、柠檬酸钠0.0600g、柠檬酸钾0.0820g、HEPES试剂0.9520g、L-脯氨酸60mmol，使用灭菌超纯水定容至100mL，加入青霉素20万IU、链霉素20万IU，使用0.22μm滤器过滤。

灭菌脱脂奶B液配置：以100mL计，利用分析天平称取脱脂奶粉8.0000g，灭菌超纯水定容至100mL，固体完全溶解后高压灭菌锅115℃高压灭菌10min，冷却至室温。

精液稀释基础液配置：以200mL计，使用量筒称取A液100mL、灭菌脱脂奶B液100mL，两者混合均匀即为200mL精液稀释基础液。

20％卵黄液配置：以200mL计。选择农家自产鸡蛋或者来源于无疫病的鸡场鸡蛋，且所使用鸡蛋须新鲜、完整、净洁，取用卵黄前先用75％酒精棉球对蛋壳表面进行消毒。待酒精挥发干净后，鸡蛋腰中线处敲开一裂纹，将鸡蛋一分两半，利用二个蛋壳交替倾倒的方法，除去蛋清，留下卵黄。卵黄放在无菌滤纸上滚去多余蛋清。用灭菌的注射器穿过卵黄膜取抽卵黄40mL，加入精液稀释基础液160mL；4℃2800×g离心1h；去除沉淀保留上清液。

冷冻保存液配置：以100mL计，使用量筒称取精液稀释基础液70mL、20％卵黄液25mL、甘油5mL，混合均匀即为100mL冷冻保存液。

其他体积的液体按相应比例配置。

实施例7

本实施例提供一种精液冷冻保存液及其制备。

1、成分：葡萄糖、乳糖、棉子糖、柠檬酸钠、柠檬酸钾、HEPES试剂、L-脯氨酸，以上药品均为分析纯；超纯水、脱脂奶粉、青霉素、链霉素、灭菌甘油、新鲜卵黄。

2、制备方法：配制精液冷冻保存液以200mL为例。

A液配置：以100mL计，利用分析天平分别称取葡萄糖6.0000g、乳糖0.3000g、棉子糖0.3000g、柠檬酸钠0.0600g、柠檬酸钾0.0820g、HEPES试剂0.9520g、L-脯氨酸70mmol，使用灭菌超纯水定容至100mL，加入青霉素20万IU、链霉素20万IU，使用0.22μm滤器过滤。

灭菌脱脂奶B液配置：以100mL计，利用分析天平称取脱脂奶粉8.0000g，灭菌超纯水定容至100mL，固体完全溶解后高压灭菌锅115℃高压灭菌10min，冷却至室温。

精液稀释基础液配置：以200mL计，使用量筒称取A液100mL、灭菌脱脂奶B液100mL，两者混合均匀即为200mL精液稀释基础液。

20％卵黄液配置：以200mL计。选择农家自产鸡蛋或者来源于无疫病的鸡场鸡蛋，且所使用鸡蛋须新鲜、完整、净洁，取用卵黄前先用75％酒精棉球对蛋壳表面进行消毒。待酒精挥发干净后，鸡蛋腰中线处敲开一裂纹，将鸡蛋一分两半，利用二个蛋壳交替倾倒的方法，除去蛋清，留下卵黄。卵黄放在无菌滤纸上滚去多余蛋清。用灭菌的注射器穿过卵黄膜取抽卵黄40mL，加入精液稀释基础液160mL；4℃2800×g离心1h；去除沉淀保留上清液。

冷冻保存液配置：以100mL计，使用量筒称取精液稀释基础液70mL、20％卵黄液25mL、甘油5mL，混合均匀即为100mL冷冻保存液。

其他体积的液体按相应比例配置。

实施例8

本实施例提供一种精液冷冻保存液及其制备。

1、成分：葡萄糖、乳糖、棉子糖、柠檬酸钠、柠檬酸钾、HEPES试剂、L-脯氨酸，以上药品均为分析纯；超纯水、脱脂奶粉、青霉素、链霉素、二甲基甲酰胺、维生素E、新鲜卵黄。

2、制备方法：配制精液冷冻保存液以200mL为例。

A液配置：以100mL计，利用分析天平分别称取：葡萄糖6g、乳糖0.6g、棉子糖0.6g、柠檬酸钠0.16g、柠檬酸钾0.164g、HEPES 2.984g、脯氨酸30mmol；灭菌超纯水定容至100ml，使用0.22μm滤器过滤。

灭菌脱脂奶B液配置：以100mL计，利用分析天平称取脱脂奶粉16g，灭菌超纯水定容至100mL，固体完全溶解后高压灭菌锅115℃高压灭菌10min，冷却至室温，加入青霉素20万IU、链霉素20万IU。

精液稀释基础液配置：以200mL计，使用量筒称取A液100mL、灭菌脱脂奶B液100mL，两者混合均匀即为200mL精液稀释基础液。

20％卵黄液配置：以200mL计。选择农家自产鸡蛋或者来源于无疫病的鸡场鸡蛋，且所使用鸡蛋须新鲜、完整、净洁，取用卵黄前先用75％酒精棉球对蛋壳表面进行消毒。待酒精挥发干净后，鸡蛋腰中线处敲开一裂纹，将鸡蛋一分两半，利用二个蛋壳交替倾倒的方法，除去蛋清，留下卵黄。卵黄放在无菌滤纸上滚去多余蛋清。用灭菌的注射器穿过卵黄膜取抽卵黄40mL，加入精液稀释基础液160mL；4℃2800×g离心1h；去除沉淀保留上清液。

冷冻保存液配置：以100mL计，使用量筒称取精液稀释基础液69mL、20％卵黄液25mL、二甲基甲酰胺5mL，维生素E1mL，混合均匀即为100mL冷冻保存液。

其他体积的液体按相应比例配置。

实施例9

本实施例提供一种精液冷冻保存液及其制备。

1、成分：葡萄糖、乳糖、棉子糖、柠檬酸钠、柠檬酸钾、HEPES试剂、L-脯氨酸，以上药品均为分析纯；超纯水、脱脂奶粉、青霉素、链霉素、二甲基甲酰胺、维生素E、新鲜卵黄。

2、制备方法：配制精液冷冻保存液以200mL为例。

A液配置：以100mL计，利用分析天平分别称取：葡萄糖6g、乳糖0.6g、棉子糖0.6g、柠檬酸钠0.16g、柠檬酸钾0.164g、HEPES 2.984g、脯氨酸30mmol；灭菌超纯水定容至100ml，使用0.22μm滤器过滤。灭菌脱脂奶B液配置：以100mL计，利用分析天平称取脱脂奶粉16g，灭菌超纯水定容至100mL，固体完全溶解后高压灭菌锅115℃高压灭菌10min，冷却至室温，加入青霉素20万IU、链霉素20万IU。

精液稀释基础液配置：以200mL计，使用量筒称取A液100mL、灭菌脱脂奶B液100mL，两者混合均匀即为200mL精液稀释基础液。

20％卵黄液配置：以200mL计。选择农家自产鸡蛋或者来源于无疫病的鸡场鸡蛋，且所使用鸡蛋须新鲜、完整、净洁，取用卵黄前先用75％酒精棉球对蛋壳表面进行消毒。待酒精挥发干净后，鸡蛋腰中线处敲开一裂纹，将鸡蛋一分两半，利用二个蛋壳交替倾倒的方法，除去蛋清，留下卵黄。卵黄放在无菌滤纸上滚去多余蛋清。用灭菌的注射器穿过卵黄膜取抽卵黄40mL，加入精液稀释基础液160mL；4℃2800×g离心1h；去除沉淀保留上清液。

冷冻保存液配置：以100mL计，使用量筒称取精液稀释基础液68mL、20％卵黄液25mL、二甲基甲酰胺5mL、维生素E 2mL，混合均匀即为100mL冷冻保存液。

其他体积的液体按相应比例配置。

实施例10

本实施例提供一种精液冷冻保存液及其制备。

1、成分：葡萄糖、乳糖、棉子糖、柠檬酸钠、柠檬酸钾、HEPES试剂、L-脯氨酸，以上药品均为分析纯；超纯水、脱脂奶粉、青霉素、链霉素、二甲基甲酰胺、维生素E、新鲜卵黄。

2、制备方法：配制精液冷冻保存液以200mL为例。

A液配置：以100mL计，利用分析天平分别称取：葡萄糖6g、乳糖0.6g、棉子糖0.6g、柠檬酸钠0.16g、柠檬酸钾0.164g、HEPES 2.984g、脯氨酸30mmol；灭菌超纯水定容至100ml，使用0.22μm滤器过滤。灭菌脱脂奶B液配置：以100mL计，利用分析天平称取脱脂奶粉16g，灭菌超纯水定容至100mL，固体完全溶解后高压灭菌锅115℃高压灭菌10min，加入青霉素20万IU、链霉素20万IU。

精液稀释基础液配置：以200mL计，使用量筒称取A液100mL、灭菌脱脂奶B液100mL，两者混合均匀即为200mL精液稀释基础液。

20％卵黄液配置：以200mL计。选择农家自产鸡蛋或者来源于无疫病的鸡场鸡蛋，且所使用鸡蛋须新鲜、完整、净洁，取用卵黄前先用75％酒精棉球对蛋壳表面进行消毒。待酒精挥发干净后，鸡蛋腰中线处敲开一裂纹，将鸡蛋一分两半，利用二个蛋壳交替倾倒的方法，除去蛋清，留下卵黄。卵黄放在无菌滤纸上滚去多余蛋清。用灭菌的注射器穿过卵黄膜取抽卵黄40mL，加入精液稀释基础液160mL；4℃2800×g离心1h；去除沉淀保留上清液。

冷冻保存液配置：以100mL计，使用量筒称取精液稀释基础液66mL、20％卵黄液25mL、二甲基甲酰胺5mL、维生素E 4mL，混合均匀即为100mL冷冻保存液。

其他体积的液体按相应比例配置。

实施例11

本实施例提供一种精液冷冻保存液及其制备。

1、成分：葡萄糖、乳糖、棉子糖、柠檬酸钠、柠檬酸钾、HEPES试剂、L-脯氨酸，以上药品均为分析纯；超纯水、脱脂奶粉、青霉素、链霉素、二甲基甲酰胺、维生素E、新鲜卵黄。

2、制备方法：配制精液冷冻保存液以200mL为例。

A液配置：以100mL计，利用分析天平分别称取：葡萄糖6g、乳糖0.6g、棉子糖0.6g、柠檬酸钠0.16g、柠檬酸钾0.164g、HEPES 2.984g、脯氨酸30mmol；灭菌超纯水定容至100ml，使用0.22μm滤器过滤。

灭菌脱脂奶B液配置：以100mL计，利用分析天平称取脱脂奶粉16g，灭菌超纯水定容至100mL，固体完全溶解后高压灭菌锅115℃高压灭菌10min，加入青霉素20万IU、链霉素20万IU。

精液稀释基础液配置：以200mL计，使用量筒称取A液100mL、灭菌脱脂奶B液100mL，两者混合均匀即为200mL精液稀释基础液。

20％卵黄液配置：以200mL计。选择农家自产鸡蛋或者来源于无疫病的鸡场鸡蛋，且所使用鸡蛋须新鲜、完整、净洁，取用卵黄前先用75％酒精棉球对蛋壳表面进行消毒。待酒精挥发干净后，鸡蛋腰中线处敲开一裂纹，将鸡蛋一分两半，利用二个蛋壳交替倾倒的方法，除去蛋清，留下卵黄。卵黄放在无菌滤纸上滚去多余蛋清。用灭菌的注射器穿过卵黄膜取抽卵黄40mL，加入精液稀释基础液160mL；4℃2800×g离心1h；去除沉淀保留上清液。

冷冻保存液配置：以100mL计，使用量筒称取精液稀释基础液64mL、20％卵黄液25mL、二甲基甲酰胺5mL、维生素E 6mL，混合均匀即为100mL冷冻保存液。

其他体积的液体按相应比例配置。

实施例12

本实施例提供一种保存精液的方法，具体步骤如下：

1.精液采集

使用3-7岁种公驴，要求种公驴身体健康无疾病，体态优良，膘情中等偏上。在正式采精之前2个月要进行公驴调教，包括饲养和运动，饲养方面每天除去精料外还要饲喂6个鸡蛋和2个胡萝卜，运动方面每天至少在遛驴机内运动1个小时。在使用精液之前要进行采精2-3次，当精液达到正常并稳定的标准后，才可使用。使用假阴道人工采精，在假阴道内加入42-45℃、1000-1500ml自来水，使用一次性内衬，内部涂抹润滑剂至1/3处。吹气，使内胎鼓起，保持一定的压力，压力要根据公驴阴茎的长短和粗细调节。公驴阴茎勃起后，使用37℃无菌水冲洗干净并擦干。采精员站在驴右后侧，调教师牵引种公驴令其爬跨假台驴，公驴爬跨母驴后，将阴茎倒入采精筒，随后将采精筒保持不动，公驴射精后，放气，缓慢撤下采精器，立即将集精杯经传递窗拿进实验室内。

2.精液处理

精液拿入实验室后，纱布过滤去除胶状物质，沿量筒侧壁倒入量筒，测量精液体积，移取120μL原精加入3mL生理盐水比色皿中，使用精子密度仪测量精液密度。

温台、载玻片、盖玻片提前预热至37℃。使用移液枪从液面下取7μL滴加在载玻片上，盖上盖玻片防止气泡产生，使用精子全自动分析系统对精子运动参数进行检测。测定总运动精子率(TM)，直线前进运动精子率(PM)，曲线运动速度(VCL，μm/s)，平均路径速度(VAP，μm/s)，直线运动速度(VSL，μm/s)，前向运动精子率(PM)≥70％时方可进行冷冻。检验合格的精液分装入50mL离心管中，并加入等体积精液稀释基础液，25℃避光平衡10min，600×g离心10min弃上清。

3.精液细管制作

精液稀释完成后，装管。分装精液采用Minitube全自动灌装机灌装，每只冻精细管0.5mL精液稀释液。

4.精液冷冻

细管精液制作好后，在4℃下避光平衡2h后即可进行冷冻。使用程序冷冻仪按设定降温路线进行冷冻，冷冻程序见表1。当冷冻温度降低至-140℃时停止程序，打开冷冻仓的盖子，把细管冻精投入液氮中，在液氮中停留至少5min后，即可装入小纱布袋中转移至液氮罐保存。

对比例1

本对比例提供一种精液冷冻保存液及其制备，与实施例1的区别仅在于，不添加L-脯氨酸。

对比例2

本对比例提供一种精液冷冻保存液及其制备，与实施例8的区别仅在于，不添加维生素E。

试验例1

本试验例用于分析实施例1-7和对比例1中不同的精液保存液对于精液保存质量的影响，具体分析方法如下：

1.精液采集

使用3-7岁种公驴，要求种公驴身体健康无疾病，体态优良，膘情中等偏上。在正式采精之前2个月要进行公驴调教，包括饲养和运动，饲养方面每天除去精料外还要饲喂6个鸡蛋和2个胡萝卜，运动方面每天至少在遛驴机内运动1个小时。在使用精液之前要进行采精2-3次，当精液达到正常并稳定的标准后，才可使用。使用假阴道人工采精，在假阴道内加入42-45℃、1000-1500ml自来水，使用一次性内衬，内部涂抹润滑剂至1/3处。吹气，使内胎鼓起，保持一定的压力，压力要根据公驴阴茎的长短和粗细调节。公驴阴茎勃起后，使用37℃无菌水冲洗干净并擦干。采精员站在驴右后侧，调教师牵引种公驴令其爬跨假台驴，公驴爬跨母驴后，将阴茎倒入采精筒，随后将采精筒保持不动，公驴射精后，放气，缓慢撤下采精器，立即将集精杯经传递窗拿进实验室内。

2.精液处理

精液拿入实验室后，纱布过滤去除胶状物质，倒入沿量筒侧壁倒入量筒，测量精液体积，移取120μL原精加入3mL生理盐水比色皿中，使用精子密度仪测量精液密度。

温台、载玻片、盖玻片提前预热至37℃。使用移液枪从液面下取7μL滴加在载玻片上，盖上盖玻片防止气泡产生，使用精子全自动分析系统对精子运动参数进行检测。测定总运动精子率(TM)，直线前进运动精子率(PM)，曲线运动速度(VCL，μm/s)，平均路径速度(VAP，μm/s)，直线运动速度(VSL，μm/s)，前向运动精子率(PM)≥70％时方可进行冷冻。检验合格的精液分装入50mL离心管中，并加入等体积精液稀释基础液(设置不同组别，P0组加入对比例1中的精液稀释基础液；P1-P7组依次分别加入实施例1-7中的精液稀释基础液)，25℃避光平衡10min，600g离心10min弃上清。使用冷冻保存液稀释至约1×10

3.精液细管制作

精液稀释完成后，装管。分装精液采用Minitube全自动灌装机灌装，每只冻精细管0.5mL步骤2得到的精液稀释液。

4.精液冷冻

细管精液制作好后，在4℃下避光平衡2h后即可进行冷冻。使用程序冷冻仪按设定降温路线进行冷冻，冷冻程序见表1。当冷冻温度降低至-140℃时停止程序，打开冷冻仓的盖子，把细管冻精投入液氮中，在液氮中停留至少5min后，即可装入小纱布袋中转移至液氮罐保存。

5.细管冻精的解冻

驴细管冷冻精液保存大约7天后，采用水浴解冻的方法，从液氮中夹出细管冻精后，在空气停留5-8s后，投入到38℃温水的水浴锅中，轻轻搅动30s后，取出擦干细管外的水滴，剪开细管，将精液倒入1.5ml离心管中，37℃孵育10min。

6.精子运动参数检测

温台、载玻片、盖玻片提前预热至37℃。精液稀释液使用移液枪混匀后，从液面下取7μL滴加在载玻片上，盖上盖玻片防止气泡产生，使用精子全自动分析系统对精子运动参数进行检测。用20X的相差显微镜和电脑相连获取图像，每个样品读取5个视野，精子的运动参数使用计算机辅助精子分析技术(CASA)进行评估。分别评估总运动精子率(TM)，直线前进运动精子率(PM)，曲线运动速度(VCL，μm/s)，平均路径速度(VAP，μm/s)，直线运动速度(VSL，μm/s)。

7.数据分析

使用SPASS18.0(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)统计软件进行单因素方差分析(ANOVA)及Ducan检验，分析结果用平均值和标准差表示。

8.实验结果

驴精液冷冻保存解冻后，经CASA检测分析，其TM、PM、VCL、VSL、VAP结果，见表2。

添加L-脯氨酸实验组(P1-P7)与对照组(P0)相比TM、VCL有显著性升高。P2、P3、P4、P5组PM显著高于对照组，但与P6、P7组无显著差异，P6、P7组与对照组无显著差异。P2组VSL显著高于对照组，但与其他实验组无显著性差异，P3、P4、P5、P6、P7组VSL与对照组无显著性差异。P2、P3组与对照组相比VAP显著提高，与其他实验组相比无显著性差异，P1、P4、P5、P6、P7组与对照组VAP无显著性差异。P2组TM、PM、VCL、VSL、VAP各项精子运动参数均高于对照组，P3组TM、PM、VCL、VAP四项精子运动参数均高于对照组。

表2利用不同冷冻保存液保存精液的精子解冻后运动性能分析(1)

注：表中纵排上角标不同小写字母表示分组间差异显著(P<0.05)，abcdefg表示按各组均值降序排列。P0为对照组(不添加脯氨酸)，P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7分别为100mL A液中L-脯氨酸的含量为10mmol、20mmol、30mmol、40mmol、50mmol、60mmol、70mmol浓度组。总运动精子率(TM)，直线前进运动精子率(PM)，曲线运动速度(VCL，μm/s)，平均路径速度(VAP，μm/s)，直线运动速度(VSL，μm/s)。

试验例2

本试验例用于分析实施例8-11(P9-P12)和对比例2(P8)中不同的精液保存液对于精液保存质量的影响，具体分析方法与试验例相同，区别仅在于分析的精液保存液不同。驴精液冷冻保存解冻后，经CASA检测分析，其TM、PM、VCL、VSL、VAP结果，见表3。结果表明，添加不同浓度的维生素E对驴的冻精保护有一定的保护作用，在添加1％的浓度时，解冻活力有所提高，但是不明显，当继续添加浓度时，2％的浓度对精液解冻后的活力明细的提升，随着浓度的继续提高到4％和6％时，解冻活力开始下降，但是对照组相比，活力仍所有提高。

表3利用不同冷冻保存液保存精液的精子解冻后运动性能分析(2)

注：表中纵排上角标不同小写字母表示分组间差异显著(P<0.05)。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。