循环DKK3(Dickkopf相关蛋白3)在心房颤动评定中的应用

技术领域

本发明涉及一种用于评定受试者的心房颤动的方法，所述方法包括以下步骤：测定来自受试者的样品中DKK3的量，并将DKK3的量与参考量进行比较，从而评定心房颤动。此外，本发明涉及一种用于诊断心力衰竭和/或与心力衰竭相关联的至少一种心脏结构或功能异常的方法。

背景技术

心房颤动(AF)是最常见的心律失常类型，也是老年人口中最普遍的状况之一。心房颤动的特征是不规则的心脏跳动并且通常以短暂的异常跳动开始，该短暂的异常跳动会随着时间的推移增加并且可能成为永久性病症。估计270-610万美国人患有心房颤动，并且全球约有3300万人患有心房颤动(Chugh S.S.等人，Circulation 2014；129：837-47)。与窦性心律患者相比，AF患者具有更高的脑卒中率，发展成充血性心力衰竭的风险也更高。

诸如心房颤动的心律失常的诊断通常涉及对心律失常原因的测定及对心律失常的分类。根据美国心脏病学会(ACC)、美国心脏协会(AHA)和欧洲心脏病学会(ESC)的心房颤动分类的指南主要基于简单性和临床相关性。第一类别称为“首次检测到AF”。此类别中的人最初被诊断患有AF，并且可能已经具有或可能尚未具有先前未检测到的发作。如果首次检测到的发作在不到一周的时间内自行停止，但随后又发生了另一次发作，则类别变为“阵发性AF”。尽管此类别中的患者的发作可持续长达7天，但在大多数阵发性AF病例中，发作将在不到24小时内停止。如果发作持续超过一周，则将其分类为“持续性AF”。如果这种发作无法停止，即，无法通过电复律或药物复律停止，并且持续一年以上，则分类变为“永久性AF”。由于心房颤动是脑卒中和全身性栓塞的重要危险因素，因此非常需要早期诊断心房颤动(Hart等人，Ann Intern Med 2007；146(12)：857-67；Go AS等人JAMA 2001；285(18)：2370-5)。

DKK3也称为Dickkopf相关蛋白3、REIC、RIG、Dickkopf WNT信号传导通路抑制剂3。DKK3属于DKK家族，该家族编码分泌蛋白，并由脊椎动物中的四个主要成员组成(Dkk 1、Dkk2、Dkk 3、Dkk 4)。DKK包含信号序列，并共享两个保守的富含半胱氨酸的结构域，每个结构域显示半胱氨酸和其他保守氨基酸的特性间距。此外，DKK3具有sgy结构域，其仅在DKKL1(Soggy)中发现。各种研究发现DKK家族成员调节Wnt信号传导。

基因DKK3基因具有350bp的长度，位于染色体11p15.3上，由9个外显子组成，并有两个启动子。在源自多种人类肿瘤的细胞系中检测到主要启动子区域的甲基化，其中DKK3基因的表达降低(Kobayashi，Gene，282卷，1-2期，2002年1月9日，151-158页)。

DKK3基因编码在人类正常组织中广泛表达的多种转录物。DKK3基因被转录成三种不同的同工型；所有变体共有2至8个外显子，并编码350个氨基酸的功能蛋白。(Katase等人，Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol.2013；17(10)p.678-686)。此外，Leonard等人(PLOS，2017年7月24日)显示了鉴别DKK3b转录物，其是DKK3的同工型，源自位于DKK3基因的内含子2中的第二个转录起始位点。

Northern印迹分析表明，DKK3 mRNA在脑、心脏、肺、肝、胰腺、脾、肾、小肠、结肠、骨骼肌和胎盘中表达。其中，DKK3表达在心脏和脑中特别高(Katase等人，Atlas GenetCytogenet Oncol Haematol.2013；17(10)p.678-686)。DKK3在胚胎发育期间也在包括心脏在内的许多组织中表达。该基因的表达在多种癌细胞系中降低，并且它可以用作肿瘤抑制基因。

DKK3水平在老年人群中的循环血液中升高，并且其表达在前列腺基底上皮细胞的细胞衰老过程中上调，这表明DKK3可能在与衰老相关的疾患中起作用(Zenzmaier等人，Experimental Gerontology，43卷，9期，2008年9月，867-870页)。

在小鼠体内和体外执行的功能丧失和功能获得分析表明了DKK3在保护心脏不会发展病理性心肌肥大方面的调节作用。结果表明，DKK3的丧失增大压力超负荷引起的心肌肥大、纤维化和功能障碍，而DKK3的过表达保护心脏免受压力超负荷引起的心脏重构(Zhang等人，Cardiovascular Research，2014，104，p.35-45)。DKK3基因敲除小鼠进一步显示了尤其是血红蛋白和血细胞比容水平以及肺通气的变化。

Bao等人(Basic Res Cardiol.2015May；110(3))分析了在心肌梗死(MI)后DKK3在心脏重构中的功能作用。科学家通过外科左冠状动脉前降支结扎在表达心脏特异性DKK3的转基因小鼠和DKK3基因敲除(KO)小鼠及其非转基因和DKK3(+/+)同窝仔中诱发MI。他们的结果表明，MI后，DKK3缺乏症小鼠的死亡率增加，梗塞尺寸更大，并且加剧了左心室(LV)功能障碍。相反，DKK3过表达导致梗死后相反的表型。作者提出DKK3可代表MI后心力衰竭治疗的潜在治疗靶标。

此外，Yu等人(Circulation.2017；136：1022-1036)在基于人群的前瞻性Bruneck研究中发现，DKK3水平较高的人在五年期间不太可能患动脉粥样硬化，也不太可能死于心脏病发作。这种相关性独立于其他动脉粥样硬化风险因素，诸如高血压和胆固醇水平。该研究提供了DKK3在预防涉及内皮迁移和修复的动脉粥样硬化中的作用的证据。作者通过使用DDK3阻止动脉内脂肪物质的堆积，揭示了对动脉粥样硬化的治疗潜力意义。因此，DKK3可以作为响应分泌的参数来预防由动脉粥样硬化引起的心脏病发作。

US8617877描述了一种用于通过测量例如来自患者的生物样品中的DDK3蛋白并将所述测量值与基线值进行比较来筛选心脏病患者作为干细胞治疗的候选者的方法，其中与基线值相比统计上显著量的蛋白表明患者将可能受益于干细胞治疗。

然而，DKK3参与心房颤动和脑卒中仍然未知。Latini R.等人(J InternMed.2011Feb；269(2)：160-71)在患有心房颤动的患者中测量了各种循环生物标志物(hsTnT、NT-proBNP、MR-proANP、MR-proADM、和肽素(copeptin)和CT-内皮素原-1)。

需要可靠的方法来评定心房颤动，包括心房颤动的诊断，患有心房颤动患者的风险分层(诸如脑卒中的发生)，心房颤动严重程度的评定，以及患有心房颤动患者的治疗的评定。

发明内容

本发明的技术问题可以看作是提供满足上述需要的方法。本技术问题由权利要求书及下文所表征的实施例解决。

有利的是，在本发明的研究背景下发现，对来自受试者的样品中DKK3的量的测定允许心房颤动的改善的评定。由于本发明，可以例如诊断受试者是否患有心房颤动。本发明还提供一种用于脑卒中预测的方法。此外，可以例如区分患有心房颤动的受试者的阵发性心房颤动和持续性心房颤动。

因此，本发明涉及一种用于评定受试者的心房颤动的方法，该方法包括以下步骤：

a)测定来自受试者的样品中DKK3的量，以及

b)将DKK3的量与参考量进行比较，从而评定心房颤动。

在本发明的方法的一个实施例中，该方法进一步包括在步骤a)中测定来自受试者的样品中利钠肽和/或ESM1的量，以及在步骤b)中将利钠肽和/或ESM1的量与参考量进行比较。

因此，本发明涉及一种用于评定受试者的心房颤动的方法，该方法包括以下步骤：

a)测定来自受试者的样品中DKK3的量及利钠肽和/或ESM1的量，以及

b)将所述量与参考量进行比较，从而评定心房颤动。

心房颤动(AF)的评定应基于比较步骤b)的结果。

因此，本发明优选地包括以下步骤

a)测定来自受试者的样品中DKK3的量，及任选地利钠肽和/或ESM1的量，

b)将DKK3的量与参考量进行比较，并且任选地，将利钠肽和/或ESM1的量与参考量进行比较，以及

c)基于比较步骤b)的结果评定心房颤动。

根据本发明的方法包括基本上由上述步骤组成的方法或包括其他步骤的方法。此外，本发明的方法优选地是离体方法，更优选地是体外方法。此外，它还可以包括除上述明确提及的步骤之外的步骤。例如，其他步骤可涉及测定其他标志物和/或样品预处理或评估通过该方法获得的结果。该方法可以手动执行或由自动化辅助。优选地，步骤(a)、(b)和/或(c)可全部或部分地由自动化辅助，例如通过合适的机器人和感觉设备进行步骤(a)中的测定或步骤(b)中由计算机实现的计算。

附图说明

图1：两个组的加权Kaplan-Meier存活率估计值由基线DKK3测量值＜＝28NPX对比＞28NPX限定。

图2：通过MAPPING同期群的RNAseq评定的持续性AFib对比SR组织样品中的DKK3差异表达。与SR(FDR＝0,0001)相比，在持续性AF中，perAF中的DKK3表达高1.496倍。

图3：DKK3在PREDICTOR AFib子小组中的诊断值；AUC＝0.66。AF的诊断。

图4：GISSI AF AFib子小组的诊断值；AUC(24周)＝0.64，AUC(52周)＝0，65。AF的诊断。

具体实施方式

根据本发明，应评定心房颤动。如本文所使用的，术语“评定心房颤动”优选地指心房颤动的诊断，阵发性心房颤动和持续性心房颤动之间的区分，与心房颤动相关联的不良事件的风险的预测，应该接受心电图(ECG)检查的受试者的鉴别，或心房颤动治疗的评定。

如本领域技术人员应理解的，本发明的评定通常不旨在对100％的待测受试者是正确的。该术语优选地要求能够对受试者的统计上显著部分进行正确的评定(诸如本文所述的治疗的诊断、区分、预测、鉴别或评定)。可以由本领域技术人员使用各种众所周知的统计评估工具(例如，测定置信区间、p值测定、学生t检验、Mann-Whitney检验等)在无需进一步努力的情况下测定某一部分是否是统计上显著的。详情见Dowdy和Wearden，Statisticsfor Research，John Wiley&Sons，New York 1983。优选的置信区间为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。p值优选为0.4、0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。

本领域中已知的是，生物标志物可在各种疾病和疾患中增加或减少。这也适用于DKK3，例如已知在多种癌细胞系中会减少，并可能起抑制基因的作用。

然而，技术人员会考虑到这一点。因此，“心房颤动评定”应理解为辅助评定心房颤动，且因此理解为辅助诊断心房颤动，辅助区分阵发性心房颤动和持续性心房颤动，辅助预测与心房颤动相关联的不良事件的风险，辅助鉴别应接受心电图(ECG)检查的受试者，或辅助评定心房颤动的治疗。

在本发明的一个优选实施例中，心房颤动的评定是心房颤动的诊断。因此，诊断受试者是否患有心房颤动。

因此，本发明设想了一种用于诊断受试者的心房颤动的方法，该方法包括以下步骤：

a)测定来自受试者的样品中DKK3的量，以及

b)将DKK3的量与参考量进行比较，从而诊断心房颤动。

在一个实施例中，前述方法包括以下步骤：

a)测定来自受试者的样品中DKK3的量及利钠肽和/或ESM1的量，以及

b)将DKK3的量及利钠肽和/或ESM1的量与参考量进行比较，从而诊断心房颤动。

优选地，与用于诊断心房颤动的方法相关的待测受试者是被怀疑患有心房颤动的受试者。然而，还设想，先前已经诊断出受试者患有AF，并且通过实施本发明的方法来确认先前的诊断。

在本发明的另一个优选实施例中，心房颤动的评定是区分阵发性心房颤动与持续性心房颤动。因此，测定受试者患有阵发性还是持续性心房颤动。

因此，本发明设想了一种用于区分受试者的阵发性心房颤动和持续性心房颤动的方法，该方法包括以下步骤：

a)测定来自受试者的样品中DKK3的量，以及

b)将DKK3的量与参考量进行比较，从而区分阵发性心房颤动和持续性心房颤动。

在一个实施例中，前述方法包括以下步骤：

a)测定来自受试者的样品中DKK3的量及利钠肽和/或ESM1的量，以及

b)将DKK3的量及利钠肽和/或ESM1的量与参考量进行比较，从而区分阵发性心房颤动和持续性心房颤动。

在本发明的另一个优选实施例中，心房颤动的评定是与心房颤动相关联的不良事件(诸如脑卒中)的风险的预测。因此，预测受试者有和/或没有所述不良事件的风险。

因此，本发明设想了一种用于预测受试者的与心房颤动相关联的不良事件的风险的方法，该方法包括以下步骤：

a)测定来自受试者的样品中DKK3的量，以及

b)将DKK3的量与参考量进行比较，从而预测与心房颤动相关联的不良事件的风险。

在一个实施例中，前述方法包括以下步骤：

a)测定来自受试者的样品中DKK3的量及利钠肽和/或ESM1的量，以及

b)将DKK3的量及利钠肽和/或ESM1的量与参考量进行比较，从而预测与心房颤动相关联的不良事件的风险。

设想可以预测各种不良事件。要预测的优选不良事件是脑卒中。

因此，本发明特别设想一种用于预测受试者的脑卒中风险的方法，该方法包括以下步骤：

a)测定来自受试者的样品中DKK3的量，以及

b)比较DKK3的量与参考量，从而预测脑卒中的风险。

前述方法可以进一步包括基于步骤b)的比较结果来预测脑卒中的步骤c)。因此，步骤a)、b)、c)优选如下：

a)测定来自受试者的样品中DKK3的量，以及

b)将DKK3的量与参考量进行比较，以及

c)基于步骤b)的比较结果预测脑卒中

在本发明的另一个优选实施例中，心房颤动的评定是评定心房颤动的治疗。

因此，本发明设想了一种用于评定受试者的心房颤动的治疗的方法，该方法包括以下步骤：

a)测定来自受试者的样品中DKK3的量，以及

b)将DKK3的量与参考量进行比较，从而评定心房颤动的治疗。

在一个实施例中，前述方法包括以下步骤：

a)测定来自受试者的样品中DKK3的量及利钠肽和/或ESM1的量，以及

b)将DKK3的量及利钠肽和/或ESM1的量与参考量进行比较，从而评定心房颤动的治疗。

优选地，与前述区分、前述预测及心房颤动治疗的评定相关的受试者是患有心房颤动、特别是已知患有心房颤动(并因此具有已知心房颤动病史)的受试者。然而，对于上述预测方法，还设想受试者没有已知心房颤动病史。

在本发明的另一个优选实施例中，心房颤动的评定是鉴别应该接受心电图(ECG)检查的受试者。因此，鉴别是否应该接受心电图检查的受试者。

因此，本发明设想了一种用于鉴别应该接受心电图检查的受试者的方法，该方法包括以下步骤：

a)测定来自受试者的样品中DKK3的量，以及

b)将DKK3的量与参考量进行比较，从而鉴别应该接受心电图检查的受试者。

在一个实施例中，前述方法包括以下步骤：

a)测定来自受试者的样品中DKK3的量及利钠肽和/或ESM1的量，以及

b)将DKK3的量及利钠肽和/或ESM1的量与参考量进行比较，从而鉴别应该接受心电图检查的受试者。

优选地，与上述鉴别应该接受心电图检查的受试者的方法有关的受试者是没有已知心房颤动病史的受试者。在本文的别处定义了表达“没有已知心房颤动病史”。

术语“心房颤动”(缩写为“AF或AFib”)在本领域中是众所周知的。如本文所用，该术语优选地指以心房不协调激活和随之导致心房机械功能恶化为特征的室上性快速心律失常。特别地，该术语指以快速且不规则的跳动为特征的不正常的心律。它涉及心脏的两个上腔室。在正常的心律中，窦房结产生的脉冲通过心脏传播，并引起心肌收缩和血液泵送。在心房颤动时，窦房结的规则电脉冲被无组织、快速的电脉冲所取代，该无组织、快速的电脉冲导致不规则的心跳。心房颤动的症状是心悸、晕厥、呼吸急促或胸痛。然而，大多数发作都没有症状。在心电图上，心房颤动的特征是用在振幅、形状和定时上变化的快速振荡或震颤波代替一致的P波，该振荡或震颤波与房室传导完整时的不规则、频繁的快速心室反应有关。

美国心脏病学会(ACC)、美国心脏病协会(AHA)和欧洲心脏病学会(ESC)提出了以下分类体系(参见Fuster V.等人，Circulation 2006；114(7)：e257-354，本文件的全部内容通过引用合并于此，参见例如文件中的图3)：首次检测到AF、阵发性AF、持续性AF和永久性AF。

所有患有AF的人最初都属于被称为首次检测到AF的类别。然而，该受试者可能有或可能没有先前未被检测到的发作。如果AF持续超过一年，特别是不会发生(或仅在医疗干预下发生)窦性心律恢复，则受试者患有永久性AF。如果AF持续超过7天，则受试者患有持续性AF。该受试者可能需要药物或电干预来终止心房颤动。优选地，持续性AF在发作时发生，但心律失常不会自发(即在没有医学干预的情况下)恢复为窦性心律。阵发性心房颤动优选地指持续长达7天的间歇性心房颤动发作。在大多数阵发性AF的病例中，发作持续小于24小时。心房颤动发作是自发终止的，即在没有医学干预的情况下终止。因此，虽然阵发性心房颤动的发作优选自发终止，但是持续性心房颤动优选不自发终止。优选地，持续性心房颤动需要通过电复律或药理复律终止，或采用其他程序，诸如消融程序(Fuster V.等人，Circulation 2006；114(7)：e257-354)终止。持续性AF和阵发性AF均可能复发，因此，通过ECG记录来区分阵发性AF和持续性AF：当患者已经发生2次或更多次发作时，AF被认为是复发性的。如果心律失常自发终止，则将AF、特别是复发性AF指定为阵发性的。如果AF持续超过7天，则将其指定为持续性的。

在本发明的一个优选实施例中，术语“阵发性心房颤动”定义为自发终止的AF发作，其中所述发作持续少于24小时。在一个替代性实施例中，自发终止的发作持续长达7天。

这里所指的“受试者”优选地是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。优选地，该受试者是人受试者。

优选地，待测受试者为任何年龄，更优选地，待测受试者为50岁或更高年龄，更优选60岁或更高年龄，且最优选65岁或更高年龄。进一步地，设想待测受试者为70岁或更高年龄。

此外，设想待测受试者为75岁或更高年龄。同样，该受试者可能在50岁与90岁之间。

在评定心房颤动的方法的一个优选实施例中，待测受试者应患有心房颤动。因此，受试者应具有已知心房颤动病史。因此，在获得测试样品之前，受试者应该经历过心房颤动发作，并且例如通过ECG应该已经诊断出先前的心房颤动发作中的至少一种。例如，设想如果心房颤动的评定是区分阵发性心房颤动和持续性心房颤动，或者如果心房颤动的评定是预测与心房颤动相关联的不良事件的风险，或者如果心房颤动的评定是评定心房颤动的治疗，则受试者患有心房颤动。

在评定心房颤动的方法的另一个优选实施例中，例如，如果心房颤动的评定是诊断心房颤动或鉴别应该接受心电图(ECG)检查的受试者，则怀疑待测受试者患有心房颤动。

优选地，被怀疑患有心房颤动的受试者是在实施用于评定心房颤动的方法之前已经显示出心房颤动的至少一种症状的受试者。所述症状通常是短暂的，可能会在几秒钟内出现，并且可能会很快消失。心房颤动的症状包括头晕、昏厥、呼吸急促、特别是心悸。优选地，在获得样品之前的六个月内，受试者已经表现出至少一种心房颤动的症状。

替代地或另外地，被怀疑患有心房颤动的受试者应是70岁或更高年龄的受试者。

优选地，被怀疑患有心房颤动的受试者应没有已知心房颤动病史。

根据本发明，没有已知心房颤动病史的受试者优选是先前未诊断出患有心房颤动的受试者，即在实施本发明的方法之前(特别是在获得来自受试者的样品之前)。然而，该受试者可能已经具有或可能尚未具有先前未被诊断到的心房颤动发作。

优选地，术语“心房颤动”是指所有类型的心房颤动。因此，该术语优选涵盖阵发性心房颤动、持续性心房颤动或永久性心房颤动。然而，在本发明的一个实施例中，待测受试者未患有永久性心房颤动。因此，优选地，术语“心房颤动”仅是指阵发性心房颤动和持续性心房颤动。

如上所述，在除心房颤动以外的各种疾病和疾患中，生物标志物DKK3可能增加。在本发明的一个实施例中，设想受试者未患有此类疾病和疾患。例如，设想受试者将未患有慢性肾脏疾病、糖尿病、癌症、冠状动脉疾病、高血压和/或需要透析的肾衰竭。在一个实施例中，设想受试者没有脑卒中病史。

在一个评定心房颤动的实施例中，要根据评定心房颤动的方法进行测试的受试者未患有心力衰竭。术语“心力衰竭”是结合心力衰竭的诊断方法定义的。该定义相应地适用。

在心房颤动评定的一个替代性实施例中，受试者可患有或正患有心力衰竭。

当获得样品时，待测受试者可能经历或可能没有经历心房颤动发作。因此，在评定心房颤动的一个优选实施例中(诸如在心房颤动的诊断中)，当获得样品时，受试者没有经历心房颤动发作。在此实施例中，当获得样品时，受试者应具有正常的窦性心律(并且相应地应处于窦性心律)。因此，即使在(暂时)无心房颤动的情况下，也可以诊断心房颤动。根据本发明的方法，DKK3的升高应该在心房颤动发作后保留，从而提供对患有心房颤动的受试者的诊断。优选地，在实施本发明的方法之后(或者更确切地说，在获得样品之后)约三天内、约一个月内、约三个月内或约6个月内诊断AF。在一个优选实施例中，发作后约六个月内诊断心房颤动是可行的。在一个优选实施例中，发作后约六个月内诊断心房颤动是可行的。因此，本文所述的心房颤动的评定、特别是本文所述的与心房颤动的评定有关的诊断、风险预测或区分，优选在最后一次心房颤动发作后约三天后、更优选约一个月、甚至更优选约三个月后、并且最优选约六个月后执行。因此，设想优选在最后一次心房颤动发作后约三天后、更优选约一个月后、甚至更优选约三个月后、并且最优选约六个月后获得待测试样品。因此，心房颤动的诊断优选还包括心房颤动发作的诊断，这些发作优选在获得样品之前约三天内、更优选约三个月内、并且最优选约六个月内发生。

然而，还设想，当获得样品时(例如，关于脑卒中的预测)，受试者经历心房颤动的发作。

本发明的方法也可用于筛选更大的受试者群体。因此，设想对至少100名受试者、特别是至少1000名受试者进行关于心房颤动的评定。因此，在来自至少100名、特别是来自至少1000名受试者的样品中测定生物标志物的量。此外，设想评定至少10,000名受试者。

术语“样品”是指体液样品、分离细胞样品或来自组织或器官样品。体液样品可以通过众所周知的技术获得，并且包括血液、血浆、血清、尿液、淋巴液、痰、腹水，或任何其他身体分泌物或其衍生物的样品。组织或器官样品可以通过例如活检从任何组织或器官获得。分离细胞可以通过诸如离心或细胞分选等分离技术从体液或组织或器官中获得。例如，可以从表达或产生生物标志物的那些细胞、组织或器官中获得细胞、组织或器官样品。样品可以是冷冻、新鲜、固定(例如福尔马林固定)、离心和/或包埋(例如石蜡包埋)的等。在评定估样品中一种或多种生物标志物的量之前，细胞样品当然可以接受各种众所周知的收集后制备和贮存技术(例如核酸和/或蛋白质提取、固定、贮存、冷冻、超滤、浓缩、蒸发、离心等)。

在本发明的一个优选实施例中，样品是血液(即全血)、血清或血浆样品。血清是在使血液凝固后所获得的全血的液体级分。为了获得血清，通过离心去除血凝块并收集上清液。血浆是血液中无细胞的流体部分。为了获得血浆样品，将全血收集在抗凝处理过的试管(例如柠檬酸盐处理过的试管或EDTA处理过的试管)中。通过离心将细胞从样品中取出，并获得上清液(即血浆样品)。

如上所述，在获得样品时受试者可能处于窦性心律或可能患有AF心律发作。

生物标志物Dickkopf-相关蛋白3(缩写为DKK3)是本领域众所周知的。生物标志物通常也称为REIC、RIG、Dickkopf WNT信号传导通路抑制剂3。

DKK3在心脏、脑、视网膜、血管、肺、肝、胰腺、脾、肾、骨骼肌和胎盘中表达。其中，DKK3表达在心肌、大脑皮层脑和脊髓中特别高。

在本发明的一个优选实施例中，在来自受试者的样品中测定人DKK3多肽的量。人DKK3多肽的序列在本领域中是众所周知的，并且可以例如通过Uniprot数据库评定，参见条目Q9UBP4(DKK3_HUMAN)。DKK3是38，390Da多肽的分泌蛋白，选择性剪接导致多个转录变体编码相同的蛋白。蛋白包含sgy结构域和两个富含半胱氨酸的区域，介导与LRP5和LRP6的相互作用。

DKK3基因的长度为2650bp，位于染色体11p15.3上，由12个外显子组成，并具有至少两个启动子。DKK3基因编码在人类正常组织中广泛表达的多种转录物。DKK3基因转录为三种不同的同工型(NM_015881，2650bp，NM_013253，2635bp，以及NM_001018057，2587bp)。其中两个是由于第一个外显子的交替使用而产生的(即外显子1a和外显子1b，尽管它们都是非编码的)。还有一个变体缺少外显子1。所有变体共有外显子2至8，并编码350个氨基酸的功能蛋白。(Katase等人；Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol.2013；17(10)p.678-686)。此外，Leonard等人(PLOS，2017年7月24日)显示了鉴别DKK3b转录物，其是DKK3的同工型，源自位于DKK3基因的内含子2中的第二个转录起始位点。

在一个优选实施例中，测定DKK3转录物的同工型1、即具有如RefSeq登录号NM_015881所示的序列的同工型1的量。

在另一个优选实施例中，测定DKK3转录物的同工型2、即具有如RefSeq登录号NM_013253所示的序列的同工型2的量。

在另一个优选实施例中，测定DKK3转录物的同工型3、即具有如RefSeq登录号NM_001018057所示的序列的同工型3的量。

在另一个优选实施例中，测定DKK3b转录物的同工型4、即具有如Leonard等人(PLOS，2017年7月24日)所示的序列的同工型4的量。

在另一个优选实施例中，测定DKK3转录物的同工型1、2、3和同工型4、即总DKK3的量。

例如，可以用针对DKK3多肽的氨基酸15至350的单克隆抗体(诸如小鼠抗体)和/或用山羊多克隆抗体测定DKK3的量。

在另一个优选实施例中，与利钠肽和/或ESM1结合测定DKK3。

术语“利钠肽”包括心房利钠肽(ANP)型和脑利钠肽(BNP)型肽。因此，根据本发明的利钠肽包含ANP型和BNP型肽及其变体(参见例如Bonow RO.等人，Circulation 1996；93：1946-1950)。

ANP型肽包含pre-proANP、proANP、NT-proANP和ANP。

BNP型肽包含pre-proBNP、proBNP、NT-proBNP和BNP。

前体原肽(在pre-proBNP的情况下为134个氨基酸)包含短信号肽，其被酶裂解以释放前导肽(在proBNP的情况下为108个氨基酸)。将前导肽进一步裂解为N端前导肽(NT-pro肽，在NT-proBNP的情况下为76个氨基酸)和活性激素(在BNP的情况下为32个氨基酸，在ANP的情况下为28个氨基酸)。

根据本发明的优选的利钠肽是NT-proANP、ANP、NT-proBNP、BNP。ANP和BNP是活性激素，并且具有比其各自的非活性对应物NT-proANP和NT-proBNP更短的半衰期。BNP在血液中代谢，而NT-proBNP作为完整分子在血液中循环，因此被肾脏清除。

利用NT-proBNP进行预分析更强，允许将样品轻松运输至中心实验室(Mueller T，Gegenhuber A，Dieplinger B，Poelz W，Haltmayer M.Long-term stability ofendogenous B-type natriuretic peptide(BNP)and amino terminal proBNP(NT-proBNP)in frozen plasma samples.Clin Chem Lab Med 2004；42：942-4.)。血液样品可以在室温下储存几天，或者可以邮寄或运输而不会造成恢复损失。相反，在室温或4℃下将BNP储存48小时导致至少20％的浓度损失(Mueller T，Gegenhuber A，等人，Clin Chem LabMed 2004；42：942-4；Wu A H，Packer M，Smith A，Bijou R，Fink D，Mair J，Wallentin L，Johnston N，Feldcamp C S，Haverstick D M，Ahnadi C E，Grant A，Despres N，BluesteinB，Ghani F.Analytical and clinical evaluation of the Bayer ADVIA Centaurautomated B-type natriuretic peptide assay in patients with heart failure：amultisite study.Clin Chem 2004；50：867-73.)。因此，取决于目的时间过程或性质，利钠肽的活性形式或非活性形式的测量可能是有利的。

根据本发明的最优选的利钠肽是NT-proBNP和BNP，特别是NT-proBNP。如以上简要讨论的，根据本发明所指的人NT-proBNP是一种多肽，其优选包含对应于人NT-proBNP分子的N-末端部分的长度为76个的氨基酸。人BNP和NT-proBNP的结构已在现有技术中详细描述，例如，WO 02/089657、WO 02/083913和Bonow RO.等人，New Insights into thecardiac natriuretic peptides.Circulation 1996；93：1946-1950。优选地，本文所用的人NT-proBNP是如EP 0648228B1中公开的人NT-proBNP。

术语“ESM1”也称为内皮细胞特异性分子，包括由20kDa成熟多肽和30kDa O-联聚糖链及其变体组成的蛋白聚糖(Bechard D等人，J Biol Chem 2001；276(51)：48341-48349)

在本发明的一个优选实施例中，在来自受试者的样品中测定人ESM-1多肽的量。人ESM-1多肽的序列是本领域众所周知的(例如参见Lassale P.等人，J.Biol.Chem.1996；271：20458-20464并且可以例如通过Uniprot数据库进行评定，参见条目Q9NQ30(ESM1_HUMAN)。通过选择性剪接产生ESM-1的两种同工型，即同工型1(具有Uniprot标识符Q9NQ30-1)和同工型2(具有Uniprot标识符Q9NQ30-2)。同工型1的长度为184个氨基酸。在同工型2中，缺少同工型1的氨基酸101至150。氨基酸1至19形成信号肽(可能会被裂解)。

在一个优选实施例中，测定ESM-1多肽的同工型1、即具有如UniProt登录号Q9NQ30-1所示的序列的同工型1的量。

在另一个优选实施例中，测定ESM-1多肽的同工型2、即具有如UniProt登录号Q9NQ30-2所示的序列的同工型2的量。

在另一个优选实施例中，测定ESM-1多肽的同工型1和同工型2、即总ESM-1的量。

例如，可以用针对ESM-1多肽的氨基酸20至184的单克隆抗体(诸如小鼠抗体)和/或用山羊多克隆抗体测定ESM-1的量。

例如，可以用两种针对ESM-1多肽的氨基酸20至184的单克隆抗体(诸如兔或小鼠抗体)测定ESM-1的量，该多肽反映两种同工型1或2(缺少残留的101-150)。

术语“测定”如本文所述的生物标志物(诸如DKK3或利钠肽)的量是指生物标志物的量化，例如使用本文别处描述的适当检测方法来测量样品中生物标志物的水平。术语“测量”和“测定”在本文中可互换使用。

在一个实施例中，生物标志物的量是通过以下方式来测定的：使样品与特异性地结合生物标志物的试剂接触，由此在该试剂与所述生物标志物之间形成复合物，检测所形成的复合物的量，并由此测量所述生物标志物的量。

本文提及的生物标志物(诸如DKK3)可以使用本领域中一般已知的方法来检测。检测方法通常包括量化样品中生物标志物的量的方法(定量方法)。本领域技术人员通常已知以下方法中的何种适合于生物标志物的定性和/或定量检测。可以使用商购可得的Western和免疫测定，如ELISA、RIA、基于荧光和发光的免疫测定和邻近延伸测定法来方便地测定样品中的例如蛋白质。检测生物标志物的其他合适方法包括测量肽或多肽特有的物理或化学性质，诸如其精确的分子质量或NMR谱。所述方法包括，例如生物传感器、耦合到免疫测定的光学装置、生物芯片、分析装置(诸如质谱仪、NMR分析仪或色谱装置)。进一步地，方法包括基于微板ELISA的方法、全自动或机器人免疫测定(例如在Elecsys

对于本文所述的生物标志物蛋白的检测，可以使用这种检定形式的各种免疫测定技术，参见例如美国专利号4016043、4424279和4018653。这些技术包括非竞争性类型的单位点和双位点或“夹心”测定，以及传统的竞争性结合测定。这些测定还包括标记抗体与靶标生物标志物的直接结合。

采用电化学发光标签的方法是众所周知的。此类方法利用特殊金属复合物的借助于氧化实现激发态的能力，所述特殊金属复合物从该激发态衰变为基态，从而发出电化学发光。关于综述请参见Richter，M.M.，Chem.Rev.2004；104：3003-3036。

在一个实施例中，用于测量生物标志物的量的检测抗体(或其抗原结合片段)被钌化或铱化。因此，抗体(或其抗原结合片段)应包含钌标签。在一个实施例中，所述钌标签是联吡啶钌(II)复合物。或抗体(或其抗原结合片段)应包含铱标签。在一个实施例中，所述铱标签是如WO 2012/107419中所公开的复合物。

在用于检测DKK3的夹心测定的一个实施例中，该测定包括特异性地结合DKK3的生物素化的第一单克隆抗体(作为捕获抗体)；以及特异性地结合DKK3的第二单克隆抗体(作为检测抗体)的钌化F(ab′)2片段。两种抗体与样品中的DKK3形成夹心免疫测定复合物。

在用于检测利钠肽的夹心测定的一个实施例中，该测定包括特异性地结合利钠肽的生物素化的第一单克隆抗体(作为捕获抗体)；以及特异性地结合利钠肽的第二单克隆抗体(作为检测抗体)的钌化F(ab′)2片段。两种抗体与样品中的利钠肽形成夹心免疫测定复合物。

测量多肽(诸如DKK3或利钠肽)的量可优选地包括以下步骤：(a)将多肽与特异性地结合所述多肽的试剂接触，(b)(任选地)移除未结合的试剂，(c)测量结合的结合试剂的量，即在步骤(a)中形成的试剂的复合物的量。根据一个优选实施例，所述接触、移除和测量步骤可由分析器单元执行。根据一些实施例，所述步骤可由所述系统的单个分析器单元或由彼此可操作通信的多于一个分析器单元来执行。例如，根据一个特定实施例，本文所公开的所述系统可包括用于执行所述接触和移除步骤的第一分析器单元；以及第二分析器单元，所述第二分析器单元通过传输单元(例如，机械臂)可操作地连接到所述第一分析器单元，所述第二分析器单元执行所述测量步骤。

特异性地结合生物标志物的试剂(在此也称为“结合试剂”)可以共价或非共价地耦合到标签，从而允许检测和测量结合的试剂。可通过直接或间接方法进行标记。直接标记涉及将标签直接(共价或非共价)耦合到结合试剂。间接标记涉及二级结合试剂与第一结合试剂的结合(共价或非共价)。该二级结合试剂应特异性地与第一结合试剂结合。所述二级结合试剂可以与适当的标签耦合，并且/或者是三级结合试剂的与二级结合试剂结合的靶标(受体)。合适的二级和更高阶的结合试剂可包括抗体、二抗和众所周知的链霉亲和素-生物素体系(Vector Laboratories，Inc.)。结合试剂或底物也可以用本领域已知的一个或多个标签“标记”。此类标签可以是更高阶的结合试剂的靶标。合适的标签包括生物素、洋地黄毒苷、His标签、谷胱甘肽-S-转移酶、FLAG、GFP、myc标签、甲型流感病毒血凝素(HA)、麦芽糖结合蛋白等。在肽或多肽的情况下，该标签优选地位于N-末端和/或C-末端。合适的标签是可通过合适的检测方法检测到的任何标签。典型的标签包括金颗粒、乳胶珠粒、吖啶酯(acridan ester)、鲁米诺、钌复合物、铱复合物、酶活性标签、放射性标签、磁性标签(“例如磁珠”，包括顺磁标签和超顺磁标签)和荧光标签。酶活性标签包括例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶，以及它们的衍生物。用于检测的合适底物包括二氨基联苯胺(DAB)、3，3′-5，5′-四甲基联苯胺、NBT-BCIP(4-硝基蓝四唑氯化物和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐，可作为现成储备溶液从Roche Diagnostics购得)、CDP-Star

多肽的量也可以优选地如下测定：(a)将包含如本文别处所述的多肽的结合试剂的固体支持物与包含所述肽或多肽的样品接触，以及(b)测量与支持物结合的肽或多肽的量。制造支持物的材料在本领域中是众所周知的，并且尤其包括商用柱材料、聚苯乙烯珠粒、乳胶珠粒、磁性珠粒、胶体金属颗粒、玻璃和/或硅片和表面、硝化纤维带、膜、片材、耐久细胞(duracytes)、反应盘的孔和壁、塑料管等。

在另一方面中，在测量形成的复合物的量之前，从结合试剂与至少一种标志物之间形成的复合物中移除样品。因此，在一个方面中，该结合试剂可固定在固体支持物上。在另一方面中，通过应用洗涤溶液，可以从固体支持物上形成的复合物中移除样品。

“夹心测定”是最有用和最常用的测定之一，包括夹心测定技术的许多变型。简单地说，在典型的测定中，未标记的(捕获)结合试剂被固定或可以固定在固体底物上，并且使待测样品与捕获结合试剂接触。在适当的孵育期后，在一段时间足以允许形成结合试剂-生物标志物复合物，然后添加用能够产生可检测信号的报告分子标记的第二(检测)结合试剂，以及孵育允许足以形成结合试剂-生物标志物-标记的结合试剂的另一复合物的时间。可将任何未反应的材料洗去，并且通过观察由与检测结合试剂结合的报告分子产生的信号来测定生物标志物的存在。结果可以通过简单观察可见信号来定性，或者可以通过与含有已知量的生物标志物的对照样品进行比较来量化。

典型夹心测定的孵育步骤可以根据需要和在适当时进行变化。此类变化包括例如同时孵育，其中将两种或更多种结合试剂和生物标志物共孵育。例如，将待分析的样品和标记的结合试剂同时添加到固定的捕获结合试剂中。也可以首先孵育待分析的样品和标记的结合试剂，然后添加结合到固相或能够结合到固相的抗体。

特定结合试剂与生物标志物之间形成的复合物应与样品中存在的生物标志物的量成比例。应理解的是，将要应用的结合试剂的特异性和/或敏感性限定了样品中包含的能够被特异性地结合的至少一种标志物的比例程度。也可在本文别处找到关于可以如何进行测量的进一步细节。形成的复合物的量应转化为生物标志物的量，从而反映样品中真实存在的量。

术语“结合试剂”、“特异性结合试剂”、“分析物特异性结合试剂”、“检测剂”和“与生物标志物特异性地结合的试剂”在本文中可互换使用。优选地，它涉及这样的试剂，所述试剂包含特异性地结合对应的生物标志物的结合部分。“结合试剂”、“检测剂”、“试剂”的实例是核酸探针、核酸引物、DNA分子、RNA分子、适体、抗体、抗体片段、肽、肽核酸(PNA)或化合物。优选的试剂是特异性地结合待测定生物标志物的抗体。本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性(即其抗原结合片段)即可。优选地，该抗体是多克隆抗体(或其抗原结合片段)。更优选地，抗体是单克隆抗体(或来自其的抗原结合片段)。因此，如本文别处所述，设想使用在DKK3的不同位置处结合的两种单克隆抗体(在夹心免疫测定中)。因此，将至少一种抗体用于测定DKK3的量。

在一个实施例中，至少一种抗体是小鼠单克隆抗体。在另一个实施例中，至少一种抗体是兔单克隆抗体。在又一个实施例中，抗体是山羊多克隆抗体。在又一个实施例中，抗体是绵羊多克隆抗体。

术语“特异性结合”或“特异性地结合”是指结合对分子在它们没有与其他分子显著结合的条件下表现为彼此结合的结合反应。当提及蛋白质或肽作为生物标志物时，术语“特异性结合”或“特异性地结合”优选地指结合试剂以至少10

在一个实施例中，本发明的方法基于检测包含人DKK3和非人或嵌合DKK3特异性结合试剂的蛋白复合物。在此类实施例中，本发明继续阐述一种用于评定受试者的心房颤动的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将来自所述受试者的样品与非人DKK3特异性结合试剂一起孵育，(b)测量(a)中形成的DKK3特异性结合试剂与DKK3之间的复合物，以及(c)将测得的复合物量与参考量进行比较。复合物的量等于或高于参考量指示心房颤动的诊断(并因此而存在心房颤动)、持续性心房颤动的存在、应接受ECG检查的受试者或有不良事件风险的受试者。复合物的量低于参考量指示没有心房颤动；存在阵发性心房颤动、不应接受ECG检查的受试者或没有不良事件风险的受试者。

如本文所用的术语“量”包括本文提及的生物标志物(诸如DKK3或利钠肽)的绝对量、所述生物标志物的相对量或浓度，以及与其相关或可从其导出的任何值或参数。此类值或参数包括来自通过直接测量从所述肽获得的所有具体物理或化学性质的强度信号值，例如质谱或NMR谱中的强度值。此外，所包含的是通过在本说明书别处指定的间接测量获得的所有值或参数，例如，响应于肽或从特异性地结合的配体获得的强度信号而从生物读出系统测定的反应量。应理解的是，与上述量或参数相关的值也可以通过所有标准数学运算获得。

如本文所用的术语“比较”是指将来自受试者的样品中的生物标志物(诸如DKK3和利钠肽，诸如NT-proBNP或BNP和/或ESM1)的量与本说明书别处指定的生物标志物的参考量进行比较。应理解的是，如本文所用的比较通常指对应的参数或值的比较，例如，将绝对量与绝对参考量进行比较，而将浓度与参考浓度进行比较，或将从样品中的生物标志物获得的强度信号与从参考样品获得的相同类型的强度信号进行比较。可手动或计算机辅助进行比较。因此，可以由计算装置进行比较。例如，可以将来自受试者的样品中生物标志物的测定或检测量的值与参考量相互比较，并且可以由执行比较算法的计算机程序自动执行所述比较。执行所述评估的计算机程序将以适当的输出格式提供所需的评定。对于计算机辅助比较，可将所测定的量的值与由计算机程序存储在数据库中的与适当参考相对应的值进行比较。计算机程序可进一步评估比较的结果，即以适当的输出格式自动提供所需的评定。对于计算机辅助比较，可将所测定的量的值与由计算机程序存储在数据库中的与适当参考相对应的值进行比较。计算机程序可进一步评估比较的结果，即以适当的输出格式自动提供所需的评定。

根据本发明，应将生物标志物DKK3的量和任选地利钠肽和/或ESM1的量与参考进行比较。参考优选为参考量。术语“参考量”被技术人员很好地理解。应该理解，参考量应允许本文所述的心房颤动评定。例如，关于用于诊断心房颤动的方法，参考量优选地指这样的量，所述量允许将受试者分配到(i)患有心房颤动的受试者的组，或(ii)未患有心房颤动的受试者的组。可从要与测试样品一起(即同时或随后)分析的参考样品测定适当的参考量。

应当理解的是，将DKK3的量与DKK3的参考量相比较，而将利钠肽的量与利钠肽的参考量相比较。如果测定了两种标志物的量，则也可以设想基于DKK3和利钠肽的量来计算综合评分。在随后的步骤中，将评分与参考评分进行比较。

此外，应当理解的是，将DKK3的量与ESM1的参考量相比较，而将ESM1的量与ESM1的参考量相比较。如果测定了两种标志物的量，则也可以设想基于DKK3和ESM1的量来计算综合评分。在随后的步骤中，将评分与参考评分进行比较。

原则上，可以基于给定生物标志物的平均值或均值，通过施加标准统计方法来计算如上文所指定的受试者同期群的参考量。特别地，测试(诸如旨在诊断发生事件或未发生事件的方法)的准确性通过其接收器操作特性(ROC)而被最好地描述(特别地参见ZweigMH.等人，Clin.Chem.1993；39：561-577)。ROC曲线图是在观察到的整个数据范围内连续改变决策阈值所产生的所有敏感性对比特异性对的曲线。诊断方法的临床性能取决于其准确性，即其能够正确地将受试者分配到某一预后或诊断中。ROC曲线通过将适用于区分的整个阈值范围的敏感性对比1-特异性绘制成曲线而显示了两种分布之间的重叠。y轴上是敏感性，即真阳性分数，其被定义为真阳性测试结果数与真阳性测试结果数和假阴性测试结果数之积的比率。其仅从受影响的子组计算。x轴上是假阳性分数，即1-特异性，其被定义为假阳性结果数与真阴性结果数和假阳性结果数之积的比率。这是一个特异性指数，并且完全由未受影响的子组计算得出。由于真阳性分数和假阳性分数是完全分开计算的，所以通过使用来自两个不同子组的测试结果，ROC曲线与同期群中事件的患病率无关。ROC曲线上的每一点代表与特定决策阈值对应的敏感性/1-特异性对。有完全区别(两种结果分布没有重叠)的测试具有穿过左上角的ROC曲线，其中真阳性分数为1.0或100％(完全敏感性)，并且假阳性分数为0(完全特异性)。无区别(两个组的结果分布相同)的测试的理论曲线是从左下角到右上角的45°对角线。大多数曲线落在这两个极端之间。如果ROC曲线完全落到低于45°对角线，则可以通过将“阳性”的标准从“大于”逆转为“小于”或反之亦然来轻松纠正。定性地，曲线越接近左上角，则测试的总体准确度就越高。根据期望的置信区间，可以从ROC曲线导出阈值，从而允许分别在适当的敏感性和特异性平衡下对给定事件进行诊断。因此，优选地，通过建立如上所述的所述同期群的ROC并由此导出阈值量，可以生成用于本发明方法的参考，即允许评定心房颤动的阈值。根据诊断方法所需的敏感性和特异性，ROC曲线允许得出合适的阈值。应理解的是，最佳敏感性是例如排除患有心房颤动的受试者(即排除)所需的，而最佳特异性是针对据评定患有心房颤动的受试者(即确定)设想的。在一个实施例中，本发明的方法允许预测受试者有与心房颤动相关联的不良事件的风险，诸如心房颤动和/或脑卒中的发生或复发。

在一个优选实施例中，本文的术语“参考量”是指预定值。所述预定值应允许评定心房颤动，从而诊断心房颤动，区分阵发性心房颤动和持续性心房颤动，预测与心房颤动相关联的不良事件的风险，鉴别应该接受心电图(ECG)检查的受试者，或评定心房颤动的治疗。应当理解，参考量可以基于评定的类型而不同。例如，用于区分AF的DKK3的参考量通常将高于用于诊断AF的参考量。然而，技术人员将考虑到这一点。

如上所述，术语“评定心房颤动”优选地指诊断心房颤动的诊断，阵发性心房颤动和持续性心房颤动之间的区分，与心房颤动相关联的不良事件的风险的预测，应该接受心电图(ECG)检查的受试者的鉴别，或心房颤动治疗的评定。在下文中，将更详细地描述本发明的方法的这些实施例。以上的定义相应地适用。

如本文所用的术语“诊断”是指评定根据本发明的方法所指的受试者是否患有心房颤动(AF)。在一个实施例中，诊断出受试者患有AF。在一个优选实施例中，诊断出受试者患有阵发性AF。在一个替代性实施例中，诊断出受试者未患有AF。

根据本发明，可以诊断所有类型的AF。因此，心房颤动可以是阵发性AF、持续性AF或永久性AF。优选地，特别是在未患有永久性AF的受试者中，诊断阵发性或心房颤动。

对受试者是否患有AF的实际诊断可以包括其他步骤，诸如确认诊断(例如，通过诸如Holter-ECG的ECG确认)。因此，本发明允许评定患者患有心房颤动的可能性。DKK3的量高于参考量的受试者可能患有心房颤动，而DKK3的量低于参考量的受试者不太可能患有心房颤动。因此，在本发明的上下文中，术语“诊断”还涵盖帮助医师评定受试者是否患有心房颤动。

优选地，来自测试受试者的样品中DKK3的量(及任选地利钠肽的量)与参考量(或多个参考量)相比增加指示受试者患有心房颤动，和/或来自测试受试者的样品中DKK3的量(及任选地利钠肽的量)与参考量(或多个参考量)相比减少指示受试者未患有心房颤动。

在一个优选实施例中，参考量(即参考量DKK3，及利钠肽的参考量，如果测定了利钠肽的话)应允许区分患有心房颤动的受试者和未患有心房颤动的受试者。优选地，所述参考量是预定值。

在另一个优选实施例中，参考量(即参考量DKK3，及ESM1的参考量，如果测定了ESM1的话)应允许区分患有心房颤动的受试者和未患有心房颤动的受试者。优选地，所述参考量是预定值。

在一个实施例中，本发明的方法允许诊断患有心房颤动的受试者。优选地，如果DKK3的量(及任选地利钠肽的量)高于参考量，则受试者患有AF。在一个实施例中，如果DKK3的量高于参考量的特定百分位数(例如，第99个百分位数)参考上限(URL)，则受试者患有AF。

在另一个优选实施例中，本发明的方法允许诊断受试者未患有心房颤动。优选地，如果DKK3的量(以及任选地利钠肽的量)低于参考量(诸如特定百分位数URL)，则受试者未患有AF。因此，在一个实施例中，术语“诊断心房颤动”是指“排除心房颤动”。

排除心房颤动特别重要，因为可以避免进一步的心房颤动诊断的诊断测试，诸如ECG测试。因此，由于本发明，可以避免不必要的医疗保健费用。

因此，本发明还涉及一种用于排除心房颤动的方法，该方法包括以下步骤：

a)测定来自受试者的样品中DKK3的量，以及

b)将DKK3的量与参考量进行比较，从而排除心房颤动。

优选地，受试者的样品中生物标志物DKK3的量与参考量(诸如排除心房颤动的参考)相比减少指示未患有心房颤动的受试者，因此排除受试者的心房颤动。例如，可以在来自未患有AF的受试者的样品中或其一组的样品中测定DKK3的参考量。

当组合测定生物标志物DKK3及利钠肽和/或ESM1时，可以实现甚至更加可靠的排除。因此，步骤a)和b)优选如下：

a)测定来自受试者的样品中DKK3的量及利钠肽和/或ESM1的量，以及

b)将DKK3的量及利钠肽和/或ESM1的量与参考量进行比较从而排除心房颤动。

优选地，两种生物标志物的量、即生物标志物DKK3的量和利钠肽的量，

或两种生物标志物的量、即生物标志物DKK3的量和ESM1的量，

或三种生物标志物的量、即生物标志物DKK3的量、利钠肽的量和ESM1的量，

受试者样品中与相应的参考量(诸如排除心房颤动的参考量)相比减少指示没有患有心房颤动的受试者，因此排除受试者的心房颤动。例如，利钠肽和/或ESM1的参考量可以在未患有AF的受试者的样品或其一组受试者的样品中测定。

在诊断心房颤动的方法的一个实施例中，所述方法进一步包括基于诊断结果推荐和/或启动心房颤动治疗的步骤。优选地，如果诊断出受试者患有AF，则推荐或开始治疗。心房颤动的优选治疗在本文别处公开。

如本文所用的术语“区分”是指区分受试者的阵发性心房颤动和持续性心房颤动。如本文所用的术语优选包括区分地诊断受试者的阵发性心房颤动和持续性心房颤动。因此，本发明的方法允许评定患有心房颤动的受试者是患有阵发性心房颤动还是持续性心房颤动。实际的区分可以包括其他步骤，诸如区分的确认。因此，在本发明的上下文中，术语“区分”还涵盖帮助医师区分阵发性AF和持续性AF。

优选地，来自受试者的样品中DKK3的量(及任选地利钠肽的量)与参考量(或多个参考量)相比增加指示受试者患有持续性心房颤动，和/或来自受试者的样品中DKK3的量(及任选地利钠肽的量)与参考量(或多个参考量)相比减少指示受试者患有阵发性心房颤动。在两种AF类型(阵发性和持续性)中，与非AF受试者的参考量相比，DKK3的量增加。

在一个优选实施例中，参考量应允许区分阵发性心房颤动的受试者和持续性心房颤动的受试者。优选地，所述参考量是预定值。

在区分阵发性心房颤动和持续性心房颤动的上述方法的一个实施例中，受试者未患有永久性心房颤动。

本发明的方法还设想了一种用于预测不良事件风险的方法。

在一个实施例中，本文所述的不良事件风险可以是与心房颤动相关联的任何不良事件的预测。优选地，所述不良事件选自心房颤动的复发(诸如复律后的心房颤动的复发)和脑卒中。因此，应预测受试者(患有心房颤动的患者)将来患有不良事件(诸如脑卒中或心房颤动复发)的风险。

此外，设想与心房颤动相关联的所述不良事件是没有已知心房颤动病史的受试者的心房颤动的发生。

在一个特别优选实施例中，预测脑卒中的风险。

因此，本发明涉及一种用于预测受试者的脑卒中风险的方法，该方法包括以下步骤

a)测定来自受试者的样品中DKK3的量，以及

b)比较DKK3的量与参考量，从而预测脑卒中的风险。

优选地，如本文所用的术语“预测风险”是指评定受试者将患有本文所指的不良事件(例如，脑卒中的不良事件)的概率。典型地，预测受试者是有患有所述不良事件的风险(因此风险升高)还是没有患有所述不良事件的风险(因此风险降低)。因此，本发明的方法允许区分有患有所述不良事件的风险的受试者和没有患有所述不良事件的风险的受试者。进一步地，设想本发明的方法允许区分降低的、平均的或升高的风险的受试者。

如上所述，应预测在一定时间窗口内患有所述不良事件的风险(和概率)。在本发明的一个优选实施例中，预测窗口为约三个月、约六个月或约一年的时段。在另一个优选实施例中，预测窗口为约五年的时段(例如，用于预测脑卒中)。此外，预测窗口可为约六年(例如用于预测脑卒中)的时段。或者，预测窗口可以是约10年。此外，设想预测窗口为1年至10年的时段。

优选地，从本发明的方法的完成起计算所述预测窗口。更优选地，从获得待测样品的时间点计算所述预测窗口。如本领域技术人员应理解的，风险的预测通常不旨在对100％的待测受试者是正确的。然而，该术语要求能够以适当且正确的方式对受试者的统计上显著部分进行预测。可以由本领域技术人员使用各种众所周知的统计评估工具(例如，测定置信区间、p值测定、学生t检验、Mann-Whitney检验等)在无需进一步努力的情况下测定某一部分是否是统计上显著的。详情见Dowdy和Wearden，Statistics for Research，JohnWiley&Sons，New York 1983。优选的置信区间为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。p值优选为0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。

在一个优选实施例中，“预测患有所述不良事件的风险”的表述是指要通过根据本发明的方法分析的受试者被分配到有患有所述不良事件的风险的受试者组中，或被分配到没有患有所述不良事件(诸如，脑卒中)的风险的受试者组中。因此，可以预测受试者是否有患有所述不良事件的风险。如本文所使用的，“有患有所述不良事件的风险的受试者”优选地具有升高的患有所述不良事件的风险(优选在预测窗口内)。优选地，与受试者同期群中的平均风险相比，所述风险是升高的。如本文所用的，“没有患有所述不良事件的风险的受试者”优选地具有降低的患有所述不良事件的风险(优选在预测窗口内)。优选地，与受试者同期群中的平均风险相比，所述风险是降低的。优选在约一年的预测窗口内，具有患有所述不良事件的风险的受试者优选具有至少20％或更优选至少30％的患有所述不良事件(诸如，心房颤动的复发或发生)的风险。优选在一年的预测窗口内，不具有患有所述不良事件的风险的受试者优选具有低于12％，更优选低于10％的患有所述不良事件的风险。

关于脑卒中的预测，优选在约五年、或者特别约六年的预测窗口内，具有患有所述不良事件的风险的受试者优选具有至少10％或更优选至少13％的患有所述不良事件的风险。优选在约五年、或者特别约六年的预测窗口内，不具有患有所述不良事件的风险的受试者优选具有低于10％，更优选低于8％，或者最优选低于5％的患有所述不良事件的风险。如果受试者未接受抗凝治疗，则风险可能更高。技术人员将考虑到这一点。

优选地，来自受试者的样品中DKK3的量(及任选地利钠肽的量)与参考量(或多个参考量)相比增加指示有与心房颤动相关联的不良事件的风险的受试者，和/或来自受试者的样品中DKK3的量(及任选地利钠肽的量)与参考量(或多个参考量)相比减少指示没有与心房颤动相关联的不良事件的风险的受试者。

在一个优选实施例中，参考量应允许区分有本文所指的不良事件的风险的受试者和没有所述不良事件的风险的受试者。优选地，所述参考量是预定值。

在前述方法的一个优选实施例中，预测脑卒中的风险。优选地，所述脑卒中应与心房颤动相关联。更优选地，脑卒中应由心房颤动引起。

优选地，如果脑卒中与心房颤动的发作之间存在时间关系，则脑卒中与心房颤动相关联。更优选地，如果脑卒中由心房颤动引起，则脑卒中与心房颤动相关联。最优选地，如果脑卒中可以由心房颤动引起，则脑卒中与心房颤动相关联。例如，心房颤动可引起心源性脑卒中(通常也称为栓塞性或血栓栓塞性脑卒中)。优选地，可以通过口服抗凝剂防止与AF相关联的脑卒中。

因此，待预测的脑卒中优选是心源性脑卒中。

同样优选地，如果待测受试者患有心房颤动和/或具有已知心房颤动病史，则认为脑卒中与心房颤动相关联。同样，在一个实施例中，如果怀疑受试者患有心房颤动，则可认为脑卒中与心房颤动相关联。

术语“比较”、“量”、“受试者”和“测定”等在本文别处定义。这些定义相应地适用。例如，样品优选是血液、血清或血浆样品。

在预测不良事件(诸如脑卒中)的前述方法的一个优选实施例中，待测受试者患有心房颤动。更优选地，受试者具有已知心房颤动病史。根据用于预测不良事件的方法，受试者优选患有永久性心房颤动，更优选患有持续性心房颤动，最优选患有阵发性心房颤动。

在预测不良事件的方法的一个实施例中，患有心房颤动的受试者在获得样品时经历心房颤动发作。在预测不良事件的方法的另一个实施例中，患有心房颤动的受试者在获得样品时没有经历心房颤动发作(因此应当具有正常的窦性心律)。此外，要预测其风险的受试者可能正在接受抗凝治疗。

在预测不良事件的方法的另一个实施例中，待测受试者没有已知心房颤动病史。特别地，设想受试者未患有心房颤动。

在本发明的基础研究中，进一步证明，DKK3的测定允许提高受试者的临床脑卒中风险评分的预测准确性。因此，与DKK3的测定或单独的临床脑卒中风险评分的测定相比，临床脑卒中风险评分的测定和DKK3的测定的组合可以更可靠地预测脑卒中。

因此，用于预测脑卒中风险的方法可进一步包括将DKK3的量与临床脑卒中风险评分结合。基于DKK3的量与临床风险评分的组合，预测测试受试者的脑卒中风险。

在上述方法的一个实施例中，该方法进一步包括比较DKK3的量与参考量。在这种情况下，比较结果与临床脑卒中风险评分结合。

因此，本发明特别涉及一种用于预测受试者的脑卒中风险的方法，该方法包括以下步骤

a)测定来自受试者的样品中DKK3的量，以及

b)将DKK3的量与临床脑卒中风险评分结合，从而预测所述受试者的脑卒中风险。

根据此方法，设想受试者是具有已知临床脑卒中风险评分的受试者。因此，临床脑卒中风险评分的值是受试者已知的。

或者，该方法可包括获得或提供临床脑卒中风险评分的值。优选地，该值是数字。在一个实施例中，临床脑卒中风险评分是通过医师可用的基于临床的工具中的一种生成的。优选地，值是通过测定受试者的临床脑卒中风险评分的值而提供的。更优选地，值是从受试者的患者记录数据库和病史获得的。因此，评分的值也可以使用该受试者的历史数据或公布的数据来测定。

根据本发明，将DKK3的量与临床脑卒中风险评分结合。这意味着优选地，将DKK3的量的值与临床脑卒中风险评分结合。因此，将这些值有效结合以预测受试者患有脑卒中的风险。通过结合该值，可以计算单个值，该单个值本身可用于预测。

临床脑卒中风险评分在本领域中是众所周知的。例如，所述评分在Kirchhof P.等人(European Heart Journal 2016；37：2893-2962)中进行了描述，该文件的全部公开内容通过引用合并于此。在一个实施例中，评分是CHA

本发明进一步涉及一种用于提高受试者的临床脑卒中风险评分的预测准确性的方法，该方法包括以下步骤

a)测定样品中DKK3的量，以及

b)将DKK3的量与临床脑卒中风险评分结合，从而提高所述临床脑卒中风险评分的预测准确性。

该方法可包括进一步的步骤：c)基于步骤b)的结果提高所述临床脑卒中风险评分的预测准确性。

本文中给出的与评定心房颤动的方法有关的定义和解释，特别是预测不良事件(诸如脑卒中)的风险的定义和解释优选地同样适用于上述方法。例如，设想受试者是具有已知临床脑卒中风险评分的受试者。或者，该方法可包括获得或提供临床脑卒中风险评分的值。

根据本发明，将DKK3的量与临床脑卒中风险评分结合。这意味着优选地，将DKK3的量的值与临床脑卒中风险评分结合。因此，将这些值有效结合，以提高所述临床脑卒中风险评分的预测准确性。

根据本发明方法的该实施例，应评定要使用生物标志物测试的受试者是否应接受心电图(ECG)检查，即心电图评定。应当进行所述评定用于诊断，即检测所述受试者中是否存在AF。

如本文所用，术语“鉴别受试者”优选地指使用与受试者的样品中DKK3的量相关的生成的信息或数据来鉴别应当接受ECG检查的受试者。所鉴别的受试者患有AF的可能性增加。进行ECG评定作为确认。

心电图(简称ECG)是通过合适的ECG记录心脏电活动的过程。ECG设备记录由心脏产生的电信号，这些信号在整个身体中传播到皮肤。通过使测试受试者的皮肤与ECG设备所包含的电极接触来实现电信号的记录。获取记录的过程是非侵入性的且无风险。进行ECG用于诊断心房颤动，即用于评定测试受试者中是否存在心房颤动。在本发明的方法的实施例中，ECG设备是单导联设备(诸如单导联手持式ECG设备)。在另一个优选实施例中，ECG设备是12导联ECG设备，诸如Holter监测仪。

优选地，来自测试受试者的样品中DKK3的量(及任选地利钠肽的量)与参考量(或多个参考量)相比增加指示应当接受ECG检查的受试者，和/或来自受试者的样品中DKK3的量(及任选地利钠肽的量)与参考量(或多个参考量)相比减少指示不应当接受ECG检查的受试者。

在一个优选实施例中，参考量应允许区分应当接受ECG的受试者和不应当接受ECG检查的受试者。优选地，所述参考量是预定值。

如本文所用，术语“评定心房颤动治疗”优选地指评定旨在治疗心房颤动的治疗。

待评定的治疗可以是旨在治疗心房颤动的任何治疗。优选地，所述治疗选自由以下各项组成的组：至少一种抗凝剂的施用、节律控制、心率控制、复律和消融。所述治疗是本领域公知的，并且例如在Fuster V等人Circulation2011；123：e269-e367中评述，该文件的全部内容通过引用合并于此。

在一个实施例中，治疗是施用至少一种抗凝剂。施用至少一种抗凝剂应旨在减少或预防血液凝固和相关的脑卒中。在一个实施例中，至少一种抗凝剂选自由以下项组成的组：肝素、香豆素衍生物(诸如华法林或双香豆素)、组织因子途径抑制剂(TFPI)、抗凝血酶III、因子Ixa抑制剂，因子Xa抑制剂、因子Va和VIIIa的抑制剂以及凝血酶抑制剂(抗IIa型)。

在一个优选实施例中，评定心房颤动治疗是监测所述治疗。在该实施例中，参考量优选是较早获得的样品(即，在步骤a中的测试样品之前获得的样品)中DKK3的量。

任选地，除DKK3的量外，还测定利钠肽和/或ESM1的量。

因此，本发明涉及一种用于监测受试者的心房颤动治疗的方法，所述受试者优选患有心房颤动，其中所述方法包括以下步骤

a)测定来自受试者的样品中DKK3的量(及任选地利钠肽的量)，以及

b)将DKK3的量与参考量进行比较，其中所述参考量是在步骤a)中的样品之前已经从所述受试者获得的样品中DKK3的量，及任选地将利钠肽和/或ESM1的量与参考量进行比较，其中所述参考量是在步骤a)中的样品之前已经从所述受试者获得的样品中利钠肽和/或ESM1的量

步骤a)中的样品在本文中也称为“测试样品”，步骤b)中的样品在本文中称为“参考样品”。

如本文所用的术语“监测”优选地涉及评定如本文别处所提及的治疗的效果。因此，监测治疗(诸如抗凝治疗)的功效。

前述方法可以包括基于在步骤c)中执行的比较步骤的结果来监测治疗的其他步骤。如本领域技术人员应理解的，风险的预测通常不旨在对100％的待测受试者是正确的。然而，该术语要求能够以适当且正确的方式对受试者的统计上显著部分进行预测。因此，实际监视可以包括诸如确认的其他步骤。

优选地，通过实施本发明的方法，可以评定受试者是否对所述治疗有反应。如果受试者在获得第一样品与第二样品之间的状况得到改善，则受试者对治疗有反应。优选地，如果在获得第一样品与第二样品之间状况恶化，则受试者对治疗没有反应。

优选地，在开始所述治疗之前获得参考样品。更优选地，在开始所述治疗之前的一周内、特别是两周内获得样品。然而，还考虑可以在所述治疗开始之后(但是在获得测试样品之前)获得参考样品。在这种情况下，监测正在进行的治疗。

因此，应在参考样品之后获得测试样品。应当理解，应在所述治疗开始后获得测试样品。

此外，特别考虑在获得参考样品后的合理时间段之后获得测试样品。应当理解，本文提到的生物标志物的量不会立即改变(例如在1分钟或1小时内)。因此，此上下文中的“合理”是指获得第一样品和测试样品之间的间隔，该间隔允许调整生物标志物。因此，优选地，在所述参考样品之后至少一个月、至少三个月、或者特别是在所述参考样品之后至少六个月获得测试样品。

优选地，测试样品中生物标志物(即DKK3及任选地利钠肽和/或ESM1)的量与参考样品中生物标志物的量相比增加、并且更优选显著增加、并且最优选统计上显著增加指示对治疗有反应的受试者。因此，治疗是有效的。还优选地，测试样品中生物标志物的量与参考样品中生物标志物的量相比减少、更优选显著减少、并且最优选统计上显著减少指示对治疗没有反应的受试者。因此，治疗是无效的。

如果治疗降低了受试者复发心房颤动的风险，则认为该受试者对治疗有反应。如果治疗不具有受试者复发心房颤动的风险，则认为该受试者对治疗没有反应。

在一个实施例中，如果受试者对治疗没有反应，则增加治疗强度。此外，设想如果受试者对治疗有反应，则降低治疗强度。例如，可以通过增加所施用药物的剂量来增加治疗强度。例如，可以通过减少所施用药物的剂量来降低治疗强度。

在另一个优选实施例中，心房颤动治疗的评定是心房颤动治疗的指导。如本文所用的术语“指导”优选地涉及基于治疗期间对生物标志物即DKK3的测定来调整治疗强度，诸如增加或减少口服抗凝剂的剂量。

在另一个优选实施例中，心房颤动治疗的评定是心房颤动治疗的分层。因此，应鉴别有资格接受某种心房颤动治疗的受试者。如本文所用的术语“分层”优选地涉及基于特定风险、所鉴别的分子路径、和/或特定药物或程序的预期功效来选择适当的治疗。根据检测到的风险，特别是与心律失常相关的症状很少或没有症状的患者将有资格接受心室率控制、复律或消融，否则他们将仅接受抗血栓治疗。

术语“显著”和“统计上显著”是本领域技术人员已知的。因此，本领域技术人员可以使用各种公知的统计评定工具无需进一步努力地测定增加或减少是显著的还是统计上显著的。例如，显著增加或减少是至少10％特别是至少20％的增加或减少。

本发明进一步涉及一种辅助评定心房颤动的方法，所述方法包括以下步骤：

a)根据评定心房颤动的方法从本文所述的受试者获得样品，

b)测定所述样品中生物标志物DKK3的量，及任选地利钠肽和/或ESM1的量，以及

c)向受试者的主治医师提供关于测定的生物标志物DKK3的量及任选地关于测定的利钠肽和/或ESM1的量的信息，从而辅助评定所述受试者的心房颤动。

主治医师应为要求测定一种或多种生物标志物的医师。上述方法应帮助主治医师评定心房颤动。因此，该方法不包括以上结合评定心房颤动的方法提及的诊断、预测、监测、区分、鉴别。

上述样品获得方法的步骤a)不包括从受试者处提取样品。优选地，通过接收来自所述受试者的样品来获得该样品。因此，可以递送样品。

在一个实施例中，所述方法是辅助脑卒中预测的方法，所述方法包括以下步骤：

a)根据评定心房颤动的方法、特别是根据预测心房颤动的方法从本文所述的受试者获得样品，

b)测定所述样品中生物标志物DKK3的量，及任选地利钠肽和/或ESM1的量，以及

c)向受试者的主治医师提供关于测定的生物标志物DKK3的量及任选地关于测定的利钠肽和/或ESM1的量的信息，从而辅助预测脑卒中。

本发明进一步涉及一种方法，该方法包括：

a)提供对生物标志物DKK3的测试，及任选地对利钠肽和/或ESM1的测试，以及

b)提供关于在心房颤动的评定中使用通过所述一个或多个测试获得或可获得的测试结果的说明。

前述方法的目的优选地是在心房颤动评定中的辅助。

说明应包含实施评定如上所述的心房颤动的方法的方案。进一步地，说明应包含DKK3的参考量的至少一个值，及任选地利钠肽的参考量的至少一个值。

该“测试”优选为适于执行评定心房颤动的方法的试剂盒。术语“试剂盒”在下文中解释。例如，所述试剂盒应包括至少一种用于生物标志物DKK3的检测剂和任选地至少一种用于利钠肽的检测剂。这两种生物标志物的检测剂可在一个试剂盒或两个单独的试剂盒中提供。

通过所述测试获得或可获得的测试结果是一个或多个生物标志物的量的值。

在一个实施例中，步骤b)包括提供关于在脑卒中的预测(如本文别处所述)中使用通过所述一个或多个测试获得或可获得的测试结果的说明。

此外，本发明涉及以下物质：

i)生物标志物DKK3，及任选地利钠肽和/或ESM1，和/或

ii)至少一种与DKK3特异性地结合的检测剂，及任选地至少一种与利钠肽特异性地结合的检测剂，

在来自受试者的样品中，用于评定心房颤动的用途。

在一个实施例中，本发明涉及以下物质：

i)生物标志物DKK3，及任选地利钠肽和/或ESM1，和/或

ii)至少一种与DKK3特异性地结合的检测剂，及任选地至少一种与利钠肽特异性地结合的检测剂，

在来自受试者的样品中，用于预测脑卒中的用途。

本发明进一步涉及以下物质：

i)生物标志物DKK3，和/或

ii)至少一种与DKK3特异性地结合的检测剂，

在来自受试者的样品中，

与临床脑卒中风险评分结合，

用于预测受试者患脑卒中的风险的用途。

而且，本发明涉及在来自受试者的样品中i)生物标志物DKK3和/或ii)至少一种与DKK3特异性地结合的检测剂的用途，用于提高临床脑卒中风险评分的预测准确性。

已经结合用于评定心房颤动的方法定义了与上述用途相关的术语，诸如“样品”、“受试者”、“检测剂”、“DKK3”、“特异性地结合”、“心房颤动”和“评定心房颤动”。定义和解释相应地适用。

优选地，上述用途是体外用途。此外，该检测剂优选为抗体，诸如单克隆抗体(或其抗原结合片段)。

进一步地，在本发明的研究中已经显示，测定来自受试者的样品中DKK3的量允许诊断心力衰竭以及与心力衰竭相关联的心脏的结构或功能异常。因此，本发明还考虑一种用于基于生物标志物DKK3诊断心力衰竭和/或与心力衰竭相关联的至少一种结构或功能异常的方法。

本文以上给出的定义比照适用于以下内容(除非另有说明)。

因此，本发明进一步涉及一种用于诊断受试者的心力衰竭和/或与心力衰竭相关联的至少一种心脏结构或功能异常的方法，所述方法包括以下步骤：

a)测定来自受试者的样品中DKK3的量，以及

b)将DKK3的量与参考量进行比较，从而诊断心力衰竭和/或与心力衰竭相关联的至少一种心脏结构或功能异常。

如本文所用，术语“诊断”是指评定根据本发明的方法所指的受试者是否患有心力衰竭和/或患有与心力衰竭相关联的至少一种心脏结构或功能异常。在一个实施例中，诊断出受试者患有心力衰竭和/或与心力衰竭相关联的至少一种心脏结构或功能异常。在一个替代性实施例中，诊断出受试者未患有心力衰竭和/或与心力衰竭相关联的至少一种心脏结构或功能异常(排除心力衰竭和/或至少一种心脏结构和或功能异常)。

受试者是否患有心力衰竭和/或患有所述至少一种异常的实际诊断可以包括诸如确认诊断的其他步骤。因此，心力衰竭和/或与心力衰竭相关联的辅助至少一种心脏结构或功能异常的诊断被理解为心力衰竭和/或至少一种结构或功能异常的诊断。因此，在本发明的上下文中，术语“诊断”还涵盖帮助医师评定受试者是否患有心力衰竭和/或所述至少一种异常。

术语“心力衰竭”(缩写为“HF”)是技术人员众所周知的。如本文所用，该术语优选地涉及本领域技术人员已知的心脏收缩和/或舒张功能受损并伴有明显的心力衰竭迹象。优选地，本文所指的心力衰竭也是慢性心力衰竭。根据本发明的心力衰竭包括明显和/或晚期心力衰竭。在明显的心力衰竭中，受试者表现出本领域技术人员已知的心力衰竭症状。

在本发明的一个实施例中，术语“心力衰竭”是指具有降低的左心室射血分数(HFrEF)的心力衰竭。

在本发明的另一个实施例中，术语“心力衰竭”是指具有保留的左心室射血分数(HFpEF)的心力衰竭。

HF可分为不同程度的严重性。

根据NYHA(纽约心脏协会)分类，将心力衰竭患者分类为属于NYHA I、NYHA II、NYHA III和NYHA IV级。心力衰竭患者的心包、心肌、冠状动脉循环或心脏瓣膜已经发生结构和功能变化。他将无法完全恢复健康，需要治疗。NYHA I级患者没有明显的心血管疾病症状，但是已经有了功能受损的客观证据。NYHA II级患者的身体活动受到轻微限制。NYHAIII级患者表现出明显的身体活动受限。NYHA IV级患者无法在没有不适的情况下进行任何身体活动。他们在休息时表现出心脏功能不全的症状。

此功能分类由美国心脏病学会和美国心脏协会的最新分类加以补充(参见J.Am.Coll.Cardiol.2001；38；2101-2113，updated in 2005，seeJ.Am.Coll.Cardiol.2005；46；e1-e82)。定义了4个阶段A、B、C和D。A和B阶段不是HF，但被认为辅助在发展“真正”HF之前及早鉴别患者。最好将A和B阶段患者定义为具有发生HF的风险因素的患者。例如，尚未表现出左心室(LV)功能受损、肥大或几何腔畸形的冠状动脉疾病、高血压或糖尿病患者将被视为A阶段，而无症状但表现出LV肥大和/或LV功能受损的患者将被指定为B阶段。C阶段则表示患有当前或过去与基础结构性心脏病相关的HF症状的患者(大部分患者具有HF)，而D阶段表示真正难治性HF的患者。

如本文所用，术语“心力衰竭”优选地包括上述ACC/AHA分类的阶段A、B、C和D。此外，该术语包括NYHA I、NYHA II、NYHA III和NYHA IV级。因此，受试者可能会或可能不会显示典型的心力衰竭症状。

在一个优选实施例中，术语“心力衰竭”是指根据上述ACC/AHA分类的心力衰竭阶段A，或者特别是心力衰竭阶段B。鉴别这些早期阶段特别是阶段A是有利的，因为可以在发生不可逆损害之前就开始治疗。

与心力衰竭相关联的至少一种心脏结构或功能异常优选地选自心肌、心外膜、瓣膜或冠状动脉循环的功能和/或结构损害；泵血或充盈能力受损，通常是收缩或舒张功能障碍；左心室的几何形状改变；与几何腔畸形有关的高血压；左心室肥大；左心室结构改变伴有或不伴有左心室肥大；隔膜直径增加；后壁直径增加，同心心肌增大，偏心心肌增大，左心室舒张功能障碍。

在本发明的一个实施例中，与心力衰竭相关联的心脏的结构或功能异常是左心室肥大。

如本文别处所述，在除心房颤动以外的各种疾病和疾患中，生物标志物DKK3可能增加。在本发明的前述方法的一个实施例中，设想受试者未患有此类疾病和疾患。例如，设想受试者将未患有慢性肾脏疾病、糖尿病、癌症、冠状动脉疾病、高血压和/或需要透析的肾衰竭。进一步地，设想受试者没有脑卒中病史。

根据诊断心力衰竭和/或与心力衰竭相关联的至少一种心脏结构或功能异常的方法来进行测试的受试者优选地未患有心房颤动。然而，还设想受试者患有心房颤动。结合评定心力衰竭的方法定义术语“心房颤动”。

优选地，待测受试者被怀疑患有心力衰竭和/或与心力衰竭相关联的至少一种心脏结构或功能异常。

术语“参考量”已经结合评定心房颤动的方法定义。原则上，可以如上所述用于诊断心力衰竭和/或与心力衰竭相关联的测定至少一种心脏结构或功能异常的方法中应用的参考量。

优选地，来自受试者的样品中DKK3的量与参考量相比增加指示受试者患有心力衰竭和/或患有与心力衰竭和/或相关联的至少一种心脏结构或功能异常，和/或其中来自受试者的中DKK3的量与参考量相比降低指示受试者未患有心力衰竭和/或未患有与心力衰竭相关联的样品至少一种心脏结构或功能异常。

在用于诊断受试者的心力衰竭和/或与心力衰竭相关联的样品至少一种心脏结构异常或功能异常的方法的一个实施例中，步骤a)进一步包括测定来自受试者的中利钠肽和/或ESM1的量。在该方法的步骤b)中，将由此测定的该标志物的量与参考量进行比较。

优选地，NT-proBNP/DKK3的比例指示区分患有心房颤动与心力衰竭的受试者-如下文所述。

此外，本发明涉及以下物质：

i)生物标志物DKK3，及任选地利钠肽和/或ESM1，和/或

ii)至少一种与DKK3特异性地结合的检测剂，及任选地至少一种与利钠肽特异性地结合的检测剂，

在受试者的中用于诊断心力衰竭和/或与心力衰竭相关联的样品至少一种心脏结构或功能异常的用途。

本发明进一步涉及一种辅助诊断受试者的心力衰竭和/或与心力衰竭相关联的至少一种心脏结构或功能异常的方法，所述方法包括以下步骤：

a)根据诊断受试者的心力衰竭和/或与心力衰竭相关联的样品至少一种心脏结构或功能异常的方法，从本文所述的受试者获得，

b)测定所述样品中生物标志物DKK3的量，及任选地利钠肽和/或ESM1的量，以及

c)向受试者的主治医师提供关于测定的生物标志物DKK3的量及任选地关于测定的利钠肽和/或ESM1的量的信息，从而辅助诊断所述受试者的心力衰竭和/或与心脏衰竭相关联的至少一种心脏结构或功能异常。

主治医师是要求测定一种或多种生物标志物的医师。上述方法应帮助主治医师评定心房颤动。因此，该方法不包括以上结合诊断心力衰竭和/或与心力衰竭相关联的至少一种心脏结构或功能异常的方法所指的诊断、预测、监测、区分、鉴别。

上述样品获得方法的步骤a)不包括从受试者处提取样品。优选地，通过接收来自所述受试者的样品来获得该样品。因此，样品应该已被递送。

本发明进一步涉及一种方法，该方法包括：

a)提供对生物标志物DKK3的测试，及任选地对利钠肽的测试，以及

b)提供用于使用通过所述测试在诊断心力衰竭和/或与心力衰竭相关联的至少一种心脏结构或功能异常中获得或可获得的测试结果的说明。

前述方法的目的优选地是辅助诊断心力衰竭和/或至少一种心脏结构或功能异常。

说明应包含用于执行本文以上描述的诊断心力衰竭和/或至少一种心脏结构或功能异常的方法的协议。进一步地，说明应包含DKK3的参考量的至少一个值，及任选地利钠肽的参考量的至少一个值。

“测试”优选是适于执行诊断心力衰竭和/或至少一种心脏结构或功能异常的方法的试剂盒。术语“试剂盒”在下文中解释。例如，所述试剂盒应包括至少一种用于生物标志物DKK3的检测剂和任选地至少一种用于利钠肽的检测剂。这两种生物标志物的检测剂可在一个试剂盒或两个单独的试剂盒中提供。

通过所述测试获得或可获得的测试结果是一个或多个生物标志物的量的值。

本发明还涉及一种试剂盒。优选地，所述试剂盒适于执行本发明的方法，即，用于评定心房颤动的方法，或用于诊断心力衰竭和/或与心力衰竭相关联的至少一种心脏结构或功能异常的方法。所述试剂盒应包含至少一种特异性地结合DKK3的试剂。在一个优选实施例中，所述试剂盒应进一步包含与利钠肽(诸如NT-proBNP)和/或ESM1特异性地结合的试剂。或者，所述试剂盒包括用于实施所述方法的说明。

如本文所用的术语“试剂盒”是指上述组分的集合，优选地，是分开提供或在单个容器内提供的。容器还包括用于实施本发明方法的说明。这些说明可以是手册的形式，或者可以由计算机程序代码提供，该计算机程序代码能够执行在本发明的方法中提及的计算和比较，并且当在计算机或数据处理设备上实现时相应地建立评定或诊断。计算机程序代码可提供于数据存储介质或装置诸如光学存储介质(例如，光盘)上或直接提供于计算机或数据处理装置上。此外，试剂盒可优选包含用于校准目的的生物标志物DKK3的标准量。在一个优选实施例中，试剂盒还包含用于校准目的的利钠肽和/或ESM1的标准量。

在一个实施例中，所述试剂盒用于体外评定心房颤动。

在另一个实施例中，所述试剂盒用于体外诊断心力衰竭和/或与心力衰竭相关联的至少一种心脏结构或功能异常。

心房颤动和心力衰竭有共同的容易诱发疾病(诸如冠状动脉疾病)发展的风险因素。另外的既定知识是，心力衰竭患者经常会发生心房颤动，反之亦然。

实例表明DKK3是心房颤动和心力衰竭两者的标志物(参见图6)。因此，生物标志物可用于心力衰竭的诊断和心房颤动的评定。例如，基于DKK3的测定(如上所述)，可以排除受试者的心力衰竭或心房颤动的存在。

如果DKK3的水平与参考量相比增加，则受试者原则上可能患有心房颤动或心力衰竭，或两者兼有。在这种情况下，区分心力衰竭和心房颤动将是有利的。可以通过计算来自受试者的样品中利钠肽(例如NT-proBNP或BNP)和/或ESM1的量与来自受试者的样品中DKK3的量之比来进行区分。

尽管来自患有心房颤动的受试者的样品中利钠肽的量增加，但来自心力衰竭患者的样品中利钠肽的量通常比心房颤动患者高得多。例如，在来自患有心房颤动但未患有心力衰竭的受试者的样品中，在本发明基础的研究中观察到高达3000pg/ml的NT-proBNP水平。相比之下，患有心力衰竭的受试者的NT-proBNP水平高达15000pg/ml。

由于在患有心房纤颤的受试者和患有心力衰竭的受试者中，利钠肽、特别是NT-proBNP的水平存在差异，因此有可能在DKK3水平升高的受试者中(即，样品中DKK3的量与参考量相比增加的受试者中)区分心力衰竭和心房颤动。

优选地，通过执行以下进一步的步骤来进一步支持或验证心力衰竭或心房颤动的诊断：计算在以上描述的评定心房颤动的方法的步骤a)中测定的、或在诊断心力衰竭和/或与心力衰竭相关联的至少一种心脏结构或功能异常的方法的步骤a)中测定的利钠肽和/或ESM1的量与DKK3的量的比例。在进一步的步骤中，将所述计算的比例与参考比例(利钠肽和/或ESM1的量与DKK3的量)进行比较。所述参考比例应允许区分心力衰竭和心房颤动(特别是DKK3量增加的受试者)。

因此，评定心房颤动的方法(诸如诊断心房颤动的方法)和诊断心力衰竭和/或与心力衰竭相关联的至少一种心脏结构或功能异常的方法二者可以包括以下其他步骤

-计算步骤中测定的利钠肽和/或ESM1的量与步骤a)中测定的DKK3的量的比例，以及

-将所述计算出的比例与参考比例进行比较。

计算步骤优选为步骤c)，比较步骤优选为步骤d)。

如果进行步骤c)和d)，则在评定心房颤动和诊断心力衰竭的方法的步骤a)中测定生物标志物DKK3以及利钠肽和/或ESM1的量。然而，在这种情况下，在步骤b)中不需要将利钠肽和/或ESM1的量与参考量进行比较。本发明的方法可以在有和没有步骤b)中的该比较的情况下进行。

由此，证实、确认或支持心房颤动的诊断或心力衰竭的诊断和/或与心力衰竭相关联的至少一种心脏结构或功能异常。特别地，该比例允许减少误报的数量。

上述计算和比较步骤优选在步骤a)中测定的样品中DKK3的量与参考量相比增加的受试者中进行。

关于评定心房颤动的方法，特别是关于心房颤动的诊断，适用以下：优选地，与参考比例相比降低的比例指示、即进一步指示患有心房颤动的受试者。因此，这样的比例基于步骤a)和b)确认了心房颤动的诊断。与参考比例相比增加的比例指示心力衰竭。因此，这样的比例表明受试者可能不会患有心房颤动。因此，应建议或开始进一步的诊断措施，诸如诊断心房颤动的ECG。

关于诊断心力衰竭的方法，适用以下：优选地，与参考比例相比增加的比例指示患有心力衰竭的受试者。因此，增加的比例基于步骤a)和b)确认了心力衰竭的诊断。与参考比例相比降低的比例指示受试者没有心力衰竭的诊断。因此，这样的比例表明受试者没有心房颤动。

因此，本发明报告了一种用于在受试者中诊断两种疾病并检测所述风险因素的方法，该方法包括以下步骤：测定来自受试者的样品中DKK3和NT-proBNP的量，以及比较DKK3和NT-proBNP的量作为比例。与患有心房颤动的受试者相比，被怀疑患有心力衰竭的受试者应具有更高比例的NT-proBNP/DKK3。

本说明书中引用的所有参考文献的全部公开内容和在本说明书中特别提及的公开内容均以引用方式并入本文。

实例

本发明仅通过以下实例来说明。无论如何，所述实例不得以限制本发明范围的方式进行解释。

实例1：DKK3在AF患者心脏组织中的差异表达

已在来自n＝40个样品的右心耳的心肌组织样品中测定了差异DKK3表达水平

RNAseq分析

在由于CABG的开胸手术或瓣膜手术中对心房组织进行采样。AF或SR(对照)的证据是在手术期间同时进行心内膜心外膜高密度激动标测产生的。AF患者和对照在性别、年龄和合并症方面相匹配。

心房组织样品已准备好用于

·AF患者；n＝11个样品

·对照SR患者；n＝29个样品

应用算法RSEM和DESEQ2在RNAseq分析中测定DKK3的差异表达。

如图2所示，在11例患有持续性AF的患者和29例窦性心律对照的分析的心房组织中发现DKK3表达上调

表达的倍数变化(FC)为1.496。FDR(错误发现率)为0.00001。

在受损的末端器官、心房组织中测定了DKK3的变化表达。将DKK3mRNA水平与心房组织高密度标测的结果进行比较。如电标测所示，在具有传导紊乱的心房组织样品中检测到升高的DKK3 mRNA水平。脂肪浸润或间质纤维化可能引起电导紊乱。在患有心房颤动的患者的心房组织中观察到DKK3的差异表达支持了FABP在循环中从心肌、特别是从右心耳释放，并且升高的血清/血浆滴度辅助检测AF发作。

结论是，DKK3从心脏释放到血液中，并且可能辅助检测AF发作并预测发生AF相关脑卒中的风险。

实例2：在Predictor同期群中检测心房颤动-特别是在老年普通人群中筛查并鉴别有心房颤动的患者

PREDICTOR研究是针对老年人(≥65岁)、显然是健康受试者(n＝2001)的人群试验。参加者被转到心脏病学中心进行临床检查以及综合的多普勒超声心动图和心电图测量。患者主要患有心力衰竭B阶段。然而，一些患者患有心力衰竭A或C阶段。心房颤动子同期群包括29名在其就诊期间持续发作心房颤动的受试者和83名匹配的对照。

在选自PREDICTOR研究的心房颤动子同期群中测定DKK3。与对照相比，在来自正在进行心房颤动的受试者的样品中观察到升高的循环DKK3水平。

实例3：阵发性心房颤动的检测

在GISSI-AF试验的生物标志物子研究中，在研究开始时以及随访6个月和12个月后收集了血液样品。有关GISSI-AF试验的更多详细信息，参见主要出版物：GISSI-AFInvestigators，New Engl J Med 2009；360：1606-17。有关生物标志物子研究的更多详细信息，参见：Latini R等人，J Intern Med2011；269：160-71。

对于382例患者，在基线下获得来自血浆样品的DKK3值。24周后，在360例患者中，38例发生阵发性心房颤动。52周后，357例中有48例发生心房颤动。

在选自GISSI AF研究的心房颤动子同期群中测定DKK3。与对照相比，在来自正在进行心房颤动的受试者的样品中观察到升高的循环DKK3水平。

实例4：脑卒中的预测

分析方法

在具有记录的心房颤动的患者的前瞻性多中心登记中评定了循环DKK3预测脑卒中发生风险的能力(Conen D.，Forum Med Suisse2012；12：860-862)。使用Borgan(2000)中描述的分层病例同期群设计测量DKK3。

对于在随访(“事件”)期间经历脑卒中的70例患者中的每一个，选择1个匹配的对照。基于年龄、性别、高血压病史、心房颤动类型和心力衰竭病史(CHF病史)的人口统计学和临床信息匹配对照。

有事件的69例患者和没有事件的69例患者可获得DKK3结果。

使用Olink平台测量DKK3，因此没有绝对浓度值可用并且可以报告。结果将以任意信号标度(NPX)报告。

为了量化DKK3的单变量预后值，使用具有脑卒中结果的成比例危险模型。

用由DKK3给出的预后信息的两种不同组合来评定DKK3的单变量预后性能。

第一成比例危险模型包括以中位数(28NPX)二值化的DKK3，因此比较DKK3低于或等于中位数的患者与DKK3高于中位数的患者的风险。

第二成比例危险模型包括原始的DKK3水平，但转换为log2尺度。执行log2转换是为了实现更好的模型校准。

因为来自关于病例对照同期群的单纯成比例危险模型的估计将存在偏差(由于病例与对照的变化比例)，所以使用了加权成比例危险模型。权重基于为病例对照同期群选择的每个患者的逆概率，如Mark(2006)中描述的。

为了获得基于二分基线DKK3测量(＜＝28NPX对比＞28NPX)的两组中绝对生存率的估计，创建了Kaplan-Meier曲线的加权形式，如Mark(2006)中描述的。

为了评定DKK3的预后值是否独立于已知的临床和人口学风险因素，计算加权的成比例cox模型，该加权的成比例cox模型还包括以下变量：年龄、性别、CHF病史、高血压病史、脑卒中/TIA/血栓栓塞病史、血管疾病史和糖尿病史。

为了评定DKK3提高脑卒中预后的现有风险评分的能力，通过DKK3(log2转换的)扩展CHADS

将CHADS

结果

表1显示了两个单变量加权成比例危险模型的结果，该两个单变量加权成比例危险模型包括经二值化或log2转换的DKK3。

在这两个模型中，发生脑卒中的风险与DKK3的基线值之间的关联非常显著。

二值化的DKK3的危险比意味着基线DKK3＞28NPX的患者组的脑卒中风险比基线DKK3＜＝28NPX的患者组的脑卒中风险高1.8倍。然而，置信区间包括1，这意味着中位数不是最佳截止值，或者二值化不适用于DKK3。

包括作为经log2转换的线性风险预测因子的DKK3的成比例危险模型的结果表明，经log2转换的值DKK3与发生脑卒中的风险正相关。危险比2.8可以解释为DKK3增加2倍与脑卒中风险增加2.8有关。

表1：包括经二值化和log2转换的DKK3的单变量加权成比例危险模型的结果。

图1示出了基线DKK3测量值(＜＝28NPX对比＞28NPX)的两个患者组的加权Kaplan-Meier曲线。

表2显示了包括DKK3(经log2转换的)的成比例危险模型与临床和人口统计学变量相结合的结果。虽然DKK3的危险比的点估计仍显著高于1，但p值现在高于0.05。

然而，考虑到危险比仍然很高并且仅包括表2中所示的临床变量的模型的c指数随着DKK3的加入而提高了0.0055，可以预期DKK3对具有更多观察事件的更大同期群的影响将是显著的。

表2：包括DKK3及相关的临床和人口统计学变量的多变量成比例危险模型。

表3显示了加权成比例危险模型的结果，该加权成比例危险模型结合了CHADS

表3：结合CHADS

表4显示了加权成比例危险模型的结果，该加权成比例危险模型结合了CHA

表4：结合CHA

表5显示了加权成比例危险模型的结果，该加权成比例危险模型结合了ABC评分与DKK3(经log2转换的)。与表2相似，DKK3的危险比仍高于1，但p值仍未达到0.05。在此也要考虑相对较少量的事件。

表5：结合ABC评分与DKK3的加权成比例危险模型(经log2转换的)

表6示出了DKK3单独、CHADS

向CHA

对于CHADS

表6DKK3、CHADS

结果表明，DKK3可以以多种方式用于预测新患者的未来脑卒中风险，无论是单独使用，还是作为组合使用，以显著提高预测脑卒中风险中的临床评分(诸如CHADS

对于新患者，可以测量DKK3，并将其与预先定义的截止值进行比较。如果新患者的测量值高于预先确定的截止值，则认为患者有高脑卒中风险，并可发起适当的临床措施。

还可以基于不断增加的一组截止值来定义多于两个风险组。然后基于DKK3的测量值将患者分配到风险组中的一个风险组中。在不同的风险组中，脑卒中的风险预计会增加。

或者，也可以基于预先定义的适当转换函数，将DKK3的结果直接转换为连续的风险评分。

此外，可以将DKK3的值与基于临床和人口统计学变量的风险评分(例如CHA

对于新患者，应评定风险评分的值并将该值以适当的方式与测量的DKK3值(潜在的经log2转换的)相结合，例如通过创建风险评分结果和具有适当预定义权重的DKK3值的加权和(例如如表3所示)。

实例3：生物标志物测量

在市场上可买到的Dickkopf相关蛋白3(DKK3)的O-link多标志物小组中测量DKK3；来自瑞典O-link的邻位延伸分析。