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使用具有完全或部分缺失的whiB4基因的物种谷氨酸棒杆菌的L-赖氨酸分泌细菌发酵生产L-赖氨酸的方法

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摘要

本发明基本上涉及一种使用具有完全或部分缺失的whiB4基因的物种谷氨酸棒杆菌的L‑赖氨酸分泌细菌发酵生产L‑赖氨酸的方法。

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公开/公告号CN113166787A

专利类型发明专利
公开/公告日2021-07-23

原文格式PDF
申请/专利权人赢创运营有限公司;
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申请/专利号CN201980078782.1
发明设计人 G·蒂尔巴赫;F·施耐德;K·福斯;T·贝克尔;
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申请日2019-11-27
分类号C12P13/08(20060101);
代理机构72002 永新专利商标代理有限公司;
代理人柴丽敏
地址德国埃森
入库时间 2023-06-19 11:55:48

说明书

L-赖氨酸用于人类医学、制药工业、食品工业、以及特别用于动物营养。

L-赖氨酸是通过物种谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)菌株的发酵产生的。由于经济上的重要性，正在不断进行改善生产方法的工作。改善可能涉及发酵技术，例如搅拌和供应氧气，或涉及营养培养基的组合物，例如发酵过程中的糖浓度，或涉及将发酵液通过例如干燥和造粒发酵液或离子交换色谱加工成合适的产品形式，或者可能涉及微生物本身的固有性能特性。

用于改善这些微生物的性能特性的方法是那些诱变、选择和筛选突变体的方法。多年来，通过修饰(即增强或减弱)单个涉及L-赖氨酸生物合成的基因并研究对L-赖氨酸生产的影响，重组DNA技术的方法同样用于改善物种谷氨酸棒杆菌的产L-赖氨酸菌株。

已经分别公开了各种细菌或物种谷氨酸棒杆菌菌株的染色体的核苷酸序列，以及它们的分析。该信息可在公共可访问的数据库中获得，并可用于菌株开发目的。一个这样的数据库是NCBI(National Center for Biotechnology Information，U.S.NationalLibrary of Medicine 8600Rockville Pike，Bethesda MD，20894USA)的GenBank数据库。

在针对生物体测序的染色体注释过程期间，通过向数据库提供信息的提供者，向鉴定的结构例如基因或编码序列提供称为locus_tag的唯一标识符。

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032染色体的核苷酸序列及其分析由Ikeda and Nakagawa(Applied Microbiology and Biotechnology 62,99-109(2003))描述并在EP1108790中描述。该信息可在NCBI以登录号NC_003450获得。在以登录号NC_003450公开的染色体序列中，locus_tag NCgl0275标识了编码调节蛋白的核苷酸序列。还注释了该蛋白与转录因子WhiB相似。多肽的氨基酸序列以标识符NP_599532可得。

在EP1108790中，在序列311下公开了编码序列。在SEQ ID NO:3811下公开了相应的氨基酸序列。

locus_tag NCgl0275的核苷酸序列和EP1108790的序列311是相同的。

Kalinowski等人独立地描述了谷氨酸棒杆菌ATCC13032染色体的核苷酸序列及其分析(Journal of Biotechnology 104(1-3),5-25(2003))。该信息可在NCBI以登录号NC_006958获得。Locus_tag CGTRNA_RS01480标识了编码描述为WhiB家族转录调节因子的基因产物的核苷酸序列。本领域中也使用了old_locus_tag名称cg0337。多肽的氨基酸序列以标识符WP_003863319可得。

locus_tag NCgl0275和CGTRNA_RS01480的核苷酸序列是相同的。

有关由old_locus_tag cg0337标识的基因的转录信号的信息，可参见Pfeifer-Sancar等人(BMC Genomics 14:888(2013))。

Choi等人鉴定出NCgl0275基因产物为谷氨酸棒杆菌的WhiB样蛋白，并将该基因命名为whcA(FEMS Microbiology Letters 290,32-38(2009))。Choi等人表明，whcA基因在谷氨酸棒杆菌的氧化应激反应中起负面作用。在这些研究期间，Choi等人在菌株AS019E12的whcA基因内构建了一个缺失。菌株AS019E12源自ATCC13059(参见：Follettie et al.；Journal of Bacteriology 175(13),4096-4103(1993))。

Lee等人还将谷氨酸棒杆菌的whcA基因称为whiB4(Journal of Biotechnology168(2):149-54(2013))。

Silberbach等人在应答长期铵限制的基因列表中提到了具有NCBI no.NCgl0275的whiB4基因(Applied and Environmental Microbiology 71(5),2391-2402(2005))。

WO03/040181描述了编码调节蛋白的基因、其功能的调控，及其用于生产精细化学品的用途。WO03/040181的SEQ ID NO：12示出了功能注释为细胞分裂转录因子WHMD的多肽的氨基酸序列(参见标识符RXA00593)。其还公开了在氨基酸序列的位置18处含有缬氨酸而不是丙氨酸的变体。WO03/040181的SEQ ID NO：12下所公开的氨基酸序列与locus_tagNCgl0275下公开的氨基酸序列是相同的。

US20150329883描述了具有提高活性的NCgl0275基因产物的遗传工程化谷氨酸棒杆菌及其在琥珀酸生产中的用途。

WO 2004/013341 A1描述了通过提供包含反馈抗性天冬氨酸激酶和转录因子MikE17的表达降低或消除的棒杆菌属(Corynebacterium)而发酵生产L-赖氨酸。

本发明的目的是提供通过物种谷氨酸棒杆菌的细菌来发酵生产L-赖氨酸的新措施。

为了实现上述目的，本发明提供了一种利用物种谷氨酸棒杆菌的细菌发酵生产L-赖氨酸的新型方法，该物种谷氨酸棒杆菌的细菌具有分泌L-赖氨酸的能力，并通过消除转录因子WhiB4(由locus_tag NCgl0275标识)而被修饰，转录因子WhiB4在所述消除之前包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

本发明还提供了由发酵液制造含所述L-赖氨酸的产品的方法。

本发明的根本目的通过权利要求书中所述的方法解决。

因此，本发明提供了以下内容：

一种用于发酵生产L-赖氨酸的方法，其包括以下步骤：

a)提供具有以下特征的物种谷氨酸棒杆菌的细菌：

具有分泌L-赖氨酸的能力，

优选在其染色体中包含多核苷酸，所述多核苷酸编码对L-赖氨酸和L-苏氨酸的混合物的抑制不敏感的天冬氨酸激酶多肽，优选包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，其中位置311处的氨基酸苏氨酸被异亮氨酸取代，以及

通过消除包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列(优选该SEQ ID NO：2的氨基酸序列由SEQ ID NO：1的位置1001至1348的核苷酸序列编码)并具有转录因子的活性的多肽而被修饰，其中所述消除是通过至少缺失对应于所述多肽的位置31至92的氨基酸的编码序列的部分而实现的，

b)将该细菌在合适的培养基中于合适的条件下进行培养，

c)在该培养基中积累所述L-赖氨酸以形成含L-赖氨酸的发酵液。

SEQ ID NO：2涉及所述消除之前多肽的氨基酸序列。

对应于SEQ ID NO：2的氨基酸位置31至92的编码序列的部分从SEQ ID NO：1的位置1091延伸至1276。

发现与未修饰的细菌相比，根据本发明的方法提供的修饰的细菌在合适的发酵条件下以关于选自以下一个或多个参数增长的方式将L-赖氨酸分泌到合适的培养基中：产物浓度(即分别为每体积或每质量单位培养基/发酵液产生的L-赖氨酸的量(例如g/l或g/kg))、产物产量(即产生的L-赖氨酸的量每碳源消耗(例如g/g或kg/kg))、产物形成率(即分别为每体积或每质量单位培养基/发酵液产生的L-赖氨酸的量和单位时间(例如g/l×h或g/kg×h))和具体产物形成率(即每单位时间产生的L-赖氨酸的量和生产者的质量单位(例如g/h×g干质量)。

在优选的实施方案中，根据本发明的方法中提供的细菌通过至少缺失对应于SEQID NO：2的氨基酸位置10至113的编码序列的部分来进行修饰。

对应于SEQ ID NO：2的氨基酸位置10至113的编码序列的部分从SEQ ID NO：1的位置1028延伸至1339。

在另一个优选的实施方案中，根据本发明的方法中提供的细菌通过至少缺失SEQID NO：1的位置1001至1348所示的完整编码序列，优选地通过至少缺失所述完整编码序列和邻近的终止密码子(如SEQ ID NO：1的位置1001至1351所示)来进行修饰。

本文提到的，特别是在产物形成的情况下提到的术语“L-赖氨酸”还包含其离子形式和盐，例如L-赖氨酸单盐酸盐或L-赖氨酸硫酸盐。

为了实施本发明，使用物种谷氨酸棒杆菌的细菌。用于本发明方法的合适的细菌为谷氨酸棒杆菌的L-赖氨酸分泌菌株，例如由菌株ATCC13032等通过一个或多个菌株开发步骤获得的以及如本发明所述修饰的L-赖氨酸分泌菌株。

菌株ATCC13032(也可以以DSM20300获得)是物种谷氨酸棒杆菌的分类学类型菌株。

在过去几十年中，从菌株例如ATCC13032、ATCC14067、ATCC13869等开始，在本领域中获得了多种棒状杆菌属(Corynebacterium)(特别是物种谷氨酸棒杆菌)的L-赖氨酸分泌菌株。它们是由于菌株开发程序获得的，所述程序尤其使用方法如经典诱变、抗代谢物抗性的选择以及通过遗传工程方法对L-赖氨酸的生物合成途径的基因进行扩增和启动子修饰。

物种谷氨酸棒杆菌的L-赖氨酸分泌菌株是本领域所熟知的，并且可以如本发明所述进行修饰。例如，US 7,338,790 B2描述了菌株DM1797。其还以保藏号DSM16833保藏于DSMZ。DM1797是N’-甲基-N-硝基-亚硝基胍(N’-methyl-N-nitro-nitrosoguanidine)诱变后获得的菌株ATCC13032的氨乙基半胱氨酸抗性突变体。例如Blombach等人(Applied andEnvironmental Microbiology 75(2),419-427,2009)描述了菌株DM1933，其也以保藏号DSM25442保藏于DSMZ。通过菌株开发的几个步骤从ATCC13032获得菌株DM1933。此外，可以使用以DSM32514保藏于DSMZ的L-赖氨酸分泌谷氨酸棒杆菌菌株DM2031。菌株DM2031是DM1933进一步开发的衍生物，其具有增强的L-赖氨酸分泌能力。其他L-赖氨酸分泌谷氨酸棒杆菌菌株在例如WO2008033001和EP0841395中描述。

根据本发明的方法中使用的物种谷氨酸棒杆菌的L-赖氨酸分泌菌株优选在其染色体中包含编码对L-赖氨酸和L-苏氨酸的混合物的抑制不敏感的天冬氨酸激酶多肽变体的多核苷酸。所述变体在本领域中也称为反馈抗性天冬氨酸激酶。

反馈抗性天冬氨酸激酶多肽变体是指当与野生形式的酶(其包含在野生菌株如ATCC13032、ATCC14067和ATCC13869中)比较时，对L-赖氨酸和L-苏氨酸的混合物(例如各自10mM)或L-赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸和L-苏氨酸的混合物(例如50mM S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸和10mM L-苏氨酸)的抑制较不敏感或不敏感的天冬氨酸激酶。天冬氨酸激酶的EC编号为EC 2.7.2.4。编码反馈抗性天冬氨酸激酶多肽变体的谷氨酸棒杆菌的多核苷酸的描述例如在US5688671、US6844176和US6893848中给出。总结列表尤其可以在WO2009141330中找到。本领域中用于编码天冬氨酸激酶多肽的基因的符号通常是lysC。也找到缩写ask。在基因编码反馈抗性多肽变体的情况下，本领域通常使用符号如lysC

因此，如本发明所述修饰的物种谷氨酸棒杆菌的所述L-赖氨酸分泌菌株优选含有至少一个拷贝的多核苷酸，其编码对L-赖氨酸和L-苏氨酸的混合物的抑制不敏感的天冬氨酸激酶多肽变体。

所述编码所述天冬氨酸激酶多肽变体的多核苷酸可以被其天然启动子(即包含在菌株ATCC13032中的启动子)或本领域已知的任何其他合适启动子表达。

SEQ ID NO：3显示了菌株ATCC13032的天冬氨酸激酶多肽的编码序列的核苷酸序列，并且SEQ ID NO：4显示了所编码多肽的氨基酸序列。本领域已知(参见US6893848)，用Ile交换SEQ ID NO：4的位置311处的氨基酸Thr使得酶对L-赖氨酸和L-苏氨酸的混合物的抑制较不敏感。

因此，优选所述天冬氨酸激酶多肽变体的氨基酸序列包含在位置311处含有异亮氨酸的SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

通过交换SEQ ID NO：3位置932处的核碱基胞嘧啶(c)以得到胸腺嘧啶(t)，可以实现所述氨基酸交换。因此，苏氨酸的acc密码子被改变为异亮氨酸的atc密码子。

因此，优选地是，所述天冬氨酸激酶多肽变体的核苷酸序列包含在位置932处含有胸腺嘧啶的SEQ ID NO：3的核苷酸序列。

本领域进一步已知，用atg交换天冬氨酸激酶多肽的编码序列的gtg起始密码子增强多肽的表达(参见例如EP2796555)。

因此，在另一个实施方案中，编码所述天冬氨酸激酶多肽变体的核苷酸序列以起始密码子atg开始。

转录因子或序列特异性DNA结合因子是通过与特定DNA序列结合来控制从DNA到信使RNA的遗传信息转录速率的多肽。

术语DSM表示位于德国不伦瑞克(Braunschweig,Germany)的保藏单位德国微生物保藏中心(Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen，即DSMZ)。术语ATCC表示位于美国弗吉尼亚州马纳萨斯(Manasass,Virginia,US)的保藏单位美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)。

谷氨酸棒杆菌，特别是菌株ATCC13032和在菌株开发程序期间由其获得的L-赖氨酸分泌菌株，在其染色体中含有，尤其含有一个编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的基因。多肽的功能在本领域中广泛地描述为转录因子。编码序列如SEQ ID NO：1的位置1001至1348所示。编码序列可含有不改变多肽的氨基酸序列的沉默突变。该情况在本领域也称为遗传密码的简并性。

在本发明工作期间，通过从细菌中消除WhiB4多肽来修饰物种谷氨酸棒杆菌的L-赖氨酸分泌细菌。通过至少缺失对应于SEQ ID NO：2的氨基酸位置31至92的多肽的编码序列的部分而实现所述消除。发现与未经修饰的细菌相比，所述修饰提高了其在发酵过程中分泌L-赖氨酸的能力。

本领域技术人员知道如何在谷氨酸棒杆菌中实现所述消除的许多诱变方法。

一种突变谷氨酸棒杆菌基因的常用方法是Schwarzer and Pühler描述的基因置换方法(Bio/Technology 9,84-87(1991))，并由

Peters-Wendisch等人(Microbiology 144,915-927(1998))使用基因置换方法失活谷氨酸棒杆菌编码丙酮酸羧化酶的pyc基因。在US7585650中，将该方法应用于zwf基因以实现葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的Zwf亚基的氨基酸序列位置321处的氨基酸交换。

在基因置换方法中，通过包含所讨论基因的核苷酸序列或其含有突变的部分的分离的多核苷酸，提供至少一个核碱基的突变，例如缺失、插入或取代。

使用从SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6中选择的引物，可通过PCR对包含基因内部的诱变位点的核苷酸序列进行扩增。通过对PCR产物进行测序来鉴定期望的突变体。关于该方法的详细信息可尤其参见US7754446。

在本发明的上下文中，所讨论基因的核苷酸序列是由NCgl0275标识的whiB4基因。

在本发明的上下文中，该突变是至少缺失对应于多肽的编码氨基酸序列(参见SEQID NO：1和SEQ ID NO：2)的位置31至92的氨基酸的编码序列的部分。

所述缺失突变的结果是，多肽从谷氨酸棒杆菌中消除。

所述消除的结果是，通过缺失，谷氨酸棒杆菌的染色体中创建了两个核苷酸各自新的联结(junction)点或联结位点。

所述联结点还可称为突变位点。

所讨论基因的突变核苷酸序列或其含有突变的部分包含i)突变位点5'端的核苷酸序列，其在本领域中也称为5'-侧翼序列或上游序列，ii)突变位点3'端的核苷酸序列，其在本领域中也称为3'-侧翼序列或下游序列，和iii)i)和ii)之间的突变位点的核苷酸序列。由于所述缺失突变，突变位点除了缺少特定序列外，还以形成新的联结点的侧翼序列为特征。

同源重组需要所述5'-侧翼序列和3'-侧翼序列，且通常具有至少200bp、至少400bp、至少600bp或至少800bp的长度。最大长度通常为1000bp、1500bp或2000bp。

在本发明的上下文中，包含突变的核苷酸序列的多核苷酸的实例如SEQ ID NO：5所示。其缺少SEQ ID NO：1所示的编码序列和邻近的终止密码子。SEQ ID NO：5的位置17至816的核苷酸序列是5’侧翼序列，其对应于SEQ ID NO：1的位置201至1000。SEQ ID NO：5的位置817至1616的核苷酸序列是3’侧翼序列，其对应于SEQ ID NO：1的位置1352至2151相对应。

如SEQ ID NO：5的位置816至817所示，所创建的新的联结点将SEQ ID NO：1的位置1000处的核苷酸与SEQ ID NO：1的位置1352处的核苷酸直接连接。所述新的联结点可以由包含如SEQ ID NO：5的位置811至822所示的attgtcttaatt的核苷酸序列标识。

SEQ ID NO：5所示的多核苷酸在其5’端和3’端含有用于克隆目的的序列。

在本发明的上下文中，包含突变的核苷酸序列的多核苷酸的另一个实例如SEQ IDNO：6所示。其缺少分别对应于SEQ ID NO：2的氨基酸位置10至113或对应于SEQ ID NO：1的核苷酸位置1028至1339的编码序列的部分。SEQ ID NO：6的位置1至800的核苷酸序列是5’侧翼序列，其对应于SEQ ID NO：1的位置228至1027。SEQ ID NO：6的位置801至1600的核苷酸序列是3’侧翼序列，其对应于SEQ ID NO：1的位置1340至2139。

如SEQ ID NO：6的位置816至817所示，所创建的新的联结点将SEQ ID NO：1的位置1027处的核苷酸与SEQ ID NO：1的位置1340处的核苷酸直接连接。所述新的联结点可由包含如SEQ ID NO：6的位置794至807所示的gcagcgcgccgggg的核苷酸序列标识。

SEQ ID NO：6所示的多核苷酸可在其5’端和3’端装备用于克隆目的序列。

将提供的突变核苷酸序列克隆到不能在谷氨酸棒杆菌中自主复制的质粒载体中，例如由

同源重组事件也可称为交换(crossing over)。

在根据本发明的发酵方法中，根据本发明修饰并具有分泌L-赖氨酸能力的谷氨酸棒杆菌在合适的培养基中在合适的条件下培养。由于所述分泌所述L-赖氨酸的能力，L-赖氨酸的浓度在发酵方法过程中在培养基中增加并积累，因此生产L-赖氨酸。

该发酵方法可以是不连续方法(例如分批方法或补料分批方法)或连续方法。用于通过发酵方法生产L-赖氨酸的合适培养基含有碳源、氮源、磷源、无机离子和其他所需的有机化合物。合适的碳源包括葡萄糖、果糖、蔗糖以及相应的原料如淀粉水解产物、糖蜜或高果糖玉米糖浆。可以使用有机含氮化合物如蛋白胨、肉提取物、大豆水解产物或尿素，或无机化合物如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸铵、氨气或氨水作为氮源。可以使用磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐作为磷源。无机离子如钾、钠、镁、钙、铁和其它微量元素等，以硫酸、磷酸或盐酸的盐提供。其他有机化合物是必需生长因子如维生素，例如硫胺素或生物素或L-氨基酸例如L-高丝氨酸。培养基组分可以以单批的形式加入培养物中，或在培养过程中以合适的方式补料。

在发酵方法过程中，培养物的pH可以通过以合适的方式使用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸来控制。通常将pH的值调节至6.0至8.5，优选6.5至8.0。为了控制发泡，可以使用消泡剂，例如聚乙二醇脂肪酸酯。为了保持质粒的稳定性，可以向培养基中加入合适的选择性物质，例如抗生素。发酵方法优选在需氧条件下进行。为了维持这些条件，将氧气或含氧气体混合物(例如空气)引入培养物中。在适当的情况下，在升高的压力(例如在0.03-0.2MPa的升高的压力)进行发酵方法。培养物温度通常为25℃至40℃，优选30℃至37℃。在不连续方法中，继续培养直至形成足以回收的L-赖氨酸的量。然后完成培养。这个目标通常在10小时到160小时内完成。在连续方法中，更长的培养时间是可能的。

合适的培养基和培养条件的实例可以尤其参见专利文件US5770409、US5990350、US 5275940、US5763230和US6025169。

因此，发酵方法产生含有所需L-赖氨酸的发酵液。

然后将含有L-赖氨酸的产物从发酵液中以液体或固体形式回收或制备。

“发酵液”是指培养基，在其中培养本发明所述的谷氨酸棒杆菌一定时间并在某些条件下培养。

当发酵方法完成时，所得的发酵液因此包含：

a)本发明的谷氨酸棒杆菌的生物质(细胞质量)，所述生物质是由于所述谷氨酸棒杆菌的细胞的繁殖而产生的，

b)在发酵方法过程中积累的所需L-赖氨酸，

c)在发酵方法过程中积累的有机副产物，和

d)在发酵方法中所使用的培养基未被消耗的组分。

除了产生L-赖氨酸外，有机副产物包括在发酵方法过程中可由本发明的谷氨酸棒杆菌形成的化合物。

从培养容器或发酵罐中移出发酵液，在适当时收集，并用于提供液体或固体形式的含有L-赖氨酸的产物。表述“回收含L-赖氨酸产物”也用于此。在最简单的情况下，已从发酵罐中移出的含L-赖氨酸发酵液本身构成回收的产物。

随后可以对发酵液进行一种或多种选自下组的措施：

a)部分(>0％至<80％)至完全(100％)或几乎完全(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％)去除水，

b)部分(>0％至<80％)至完全(100％)或几乎完全(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％)去除生物质，任选地后者在去除前失活，

c)部分(>0％至<80％)至完全(100％)或几乎完全(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％、≥99.3％、≥99.7％)去除在发酵方法过程中形成的有机副产物，和

d)部分(>0％至<80％)至完全(100％)或几乎完全(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％，≥99.3％，≥99.7％)分别去除在发酵方法中未被消耗掉的所使用培养基的残余组分或残余输入材料。

本领域可获得关于措施a)、b)、c)和d)的大量技术指导。

除去水(措施a))尤其可以通过蒸发(例如使用降膜蒸发器)、通过反渗透或纳滤来实现。由此获得的浓缩物可以通过喷雾干燥或喷雾造粒进一步处理。同样可以使用喷雾干燥或喷雾造粒直接干燥发酵液。

因此，根据本发明的方法包含从所述发酵液中提取或基本上消除水。特别地从发酵液中提取至少40％(w/w)、优选至少90％(w/w)、更优选至少95％(w/w)的水。

除去生物质(措施b))尤其可以通过离心、过滤或倾析或其组合来实现。

除去有机副产物(措施c))或除去培养基的残余组分(措施d)尤其可以通过色谱(例如离子交换色谱)、用活性炭处理或结晶来实现。如果培养基的有机副产物或残余组分以固体存在于发酵液中，则可通过措施b)除去它们。

因此，根据本发明的L-赖氨酸产物的制备包含纯化步骤，优选选自离子交换色谱、用活性炭处理或结晶。

L-赖氨酸产物的下游加工方案可以在R.Kelle等人的文章“L-lysineProduction”(L.Eggeling and M.Bott(Handbook of Corynebacterium glutamicum,CRCPress,2005))中找到。US5279744教导了通过离子交换色谱制备纯化的L-赖氨酸产物。US5431933教导了干燥L-氨基酸产物(例如L-赖氨酸产物)的制备，其含有发酵液的大部分构成。

因此，实现了L-赖氨酸的浓缩或纯化，并提供了具有所需所述L-赖氨酸含量的产物。

可以通过利用离子交换色谱，优选阳离子交换色谱分离L-赖氨酸来进行L-赖氨酸的分析以测定其在发酵过程中的一个或多个时间的浓度，随后使用茚三酮进行柱后衍生来进行，如Spackman等人所述(Analytical Chemistry 30：1190-1206(1958))。也可以使用邻苯二甲醛而不是茚三酮进行柱后衍生。关于离子交换色谱的概述文章可以在Pickering(LC.GC(Magazine of Chromatographic Science 7(6)：484-487(1989))中找到。同样可以进行柱前衍生，例如使用邻苯二甲醛或异硫氰酸苯酯，并可以通过反相色谱法(RP)(优选以高效液相色谱法(HPLC)的形式)分馏所得的氨基酸衍生物。这种类型的方法描述于例如Lindroth等人(Analytical Chemistry 51：1167-1174(1979))。通过光度测定(吸收，荧光)进行检测。关于氨基酸分析的综述尤其可以在Lottspeich and Zorbas的教科书“Bioanalytik”(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，Germany 1998)中找到。

实验部分

A)材料和方法

本文简要描述了所用的分子生物学试剂盒、引物和化学品以及所应用方法的一些细节。

1.化学品

a.购自Sigma Aldrich的来自卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)的卡那霉素溶液(St.Louis，USA，目录号K0254)。

b.萘啶酮酸钠盐购自Sigma Aldrich(St.Louis，USA，目录号N4382)。

c.如果没有另外说明，则其它所有化学品均是购自Merck(Darmstadt，Germany)，Sigma Aldrich(St.Louis，USA)或Carl-Roth(Karlsruhe，Germany)的分析纯。

2.培养

如果没有另外说明，则所有培养/孵育程序如以下所述进行：

a.来自Merck的LB培养液(MILLER)(Darmstadt,Germany；目录号110285)用于在液体培养基中培养大肠杆菌菌株。将液体培养物(10ml液体培养基/含有3个挡板的100mlErlenmeyer烧瓶)在来自Infors GmbH(Bottmingen,Switzerland)的Infors HT Multitron标准培养箱摇床中以37℃和200rpm孵育。

b.来自Merck的LB琼脂(MILLER)(Darmstadt,Germany目录号110283)用于在琼脂平板上培养大肠杆菌菌株。将琼脂平板于37℃在来自VWR(Radnor，USA)的

a.来自Merck的脑心浸液培养液(BHI)(Darmstadt,Germany；目录号110493)用于在液体培养基中培养谷氨酸棒杆菌菌株。将液体培养物(10ml液体培养基/含有3个挡板的100ml Erlenmeyer烧瓶)在来自Infors GmbH(Bottmingen,Switzerland)的Infors HTMultitron标准培养箱摇床中以33℃和200rpm孵育。

b.来自Merck的脑心琼脂(BHI-琼脂)(Darmstadt,Germany；目录号113825)用于在琼脂平板上培养谷氨酸棒杆菌菌株。将琼脂平板于33℃在来自Heraeus Instruments的具有

3.测定光密度

a.使用来自Eppendorf AG(Hamburg，Germany)的BioPhotometer在600nm(OD600)测定摇瓶培养物中细菌悬浮液的光密度。

b.使用来自Tecan Group AG(

4.离心

a.台式离心机离心体积达2ml的反应管

使用Eppendorf 5417R离心机，使用1ml或2ml反应管(例如Eppendorf

b.台式离心机离心体积达50ml的管

使用Eppendorf 5810R离心机，使用15ml或50ml离心管(例如Falcon

5.DNA分离

a.使用来自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep Kit(Hilden,Germany,Cat.No.27106)从大肠杆菌(E.coli)细胞中分离质粒DNA。

b.使用Eikmanns等人的方法(Microbiology 140,1817-1828,1994)从谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)中分离总DNA。

6.聚合酶链反应(PCR)

在Gibson组装或Sanger测序之前，使用PCR与校对(高保真)聚合酶扩增期望的DNA节段。

使用非校对聚合酶试剂盒直接从大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌菌落中确定是否存在期望的DNA片段。

a.使用来自New England BioLabs Inc.的

表4：使用来自NEB Inc.的

b.使用来自Qiagen的Taq PCR Core Kit(Taq Kit)(Hilden,Germany；Cat.No.201203)扩增期望的DNA节段，以确认其存在。根据制造商的说明使用该试剂盒(参见表5)。

表5：使用来自Qiagen的Taq PCR Core Kit(Taq Kit)进行PCR的热循环条件

c.根据制造商的说明，使用来自Takara Bio Inc的

表6：使用来自Takara Bio Inc.的

d.引物

由Eurofins Genomics GmbH(Ebersberg,Germany)利用McBride和Caruthers描述的亚磷酰胺法(Tetrahedron Lett.24,245-248,1983)合成所使用的寡核苷酸。

e.模板

使用从谷氨酸棒杆菌液体培养物中分离的质粒DNA或分离的总DNA的适当稀释溶液，或使用菌落中含有的总DNA作为PCR模板(菌落PCR)。对于所述菌落PCR，通过用牙签从琼脂平板上的菌落中取出细胞材料，并将该细胞材料直接放入PCR反应管中来制备模板。将细胞材料在来自SEVERIN

f.PCR循环仪

PCR实验在来自Eppendorf AG(Hamburg,Germany)的PCR循环仪型Mastercycler或Mastercycler nexus gradient中进行。

7.DNA限制性内切酶消化

使用来自ThermoFisher Scientific的FastDigest限制性内切酶(FD)和相关缓冲剂(Waltham,USA,Cat.No.FD0684)进行质粒DNA的限制性消化。根据制造商手册的说明进行该反应。

8.测定DNA片段的大小

使用来自Qiagen(Hilden,Germany)的QIAxcel，通过自动毛细管电泳测定DNA片段的大小。

9.PCR扩增产物(amplificate)和限制性DNA片段的纯化

根据制造商的说明，使用来自Qiagen的QIAquick PCR Purification Kit(Hilden,Germany；Cat.No.28106)清理PCR扩增产物和限制性DNA片段。

10.测定DNA浓度

使用来自PEQLAB Biotechnologie GmbH(Erlangen,Germany)(2015年被VWR收购)的NanoDrop Spectrophotometer ND-1000，测量DNA浓度。

11.Gibson组装

使用Gibson等人的方法(Science 319,1215—20,2008)制备表达载体和允许将所期望突变整合到染色体中的载体。使用来自New England BioLabs Inc.的GibsonAssembly Kit(Ipswich,USA；Cat.No.E2611)来实现此目的。将包含限制性载体和至少一个DNA插入物的反应混和物在50℃孵育60分钟。使用0.5μl的组装混合物进行转化实验。

12.大肠杆菌的化学转化

a.化学感受态大肠杆菌Stellar

这些细胞用作通过Gibson组装获得的反应混合物的转化宿主。在37℃将转化批次培养过夜，约18小时，在补充有50mg/l卡那霉素的LB琼脂上筛选含质粒的转化体。

b.大肠杆菌K-12菌株S17-1用作结合转移基于pK18mobsacB的质粒的供体，从大肠杆菌到谷氨酸棒杆菌。Simon,R.等人描述了菌株S17-1(Bio/Technology 1,784-794,1983)。它可从美国典型培养物保藏中心以保藏号ATCC47055获得。

化学感受态大肠杆菌S17-1细胞如下制备：用100μl菌株S17-1的细菌悬浮液接种10ml LB培养基(10ml液体培养基/含有3个挡板的100ml Erlenmeyer烧瓶)的预培养物，并将培养物在37℃和250rpm孵育过夜约18小时。用300μl预培养物接种主培养物(含有3个挡板的250ml Erlenmeyer烧瓶中含有的70ml LB)，并在37℃孵育至OD600为0.5-0.8。将培养物以4℃和4000rpm离心6分钟，并弃去上清液。将细胞沉淀重悬于20ml无菌冰冷的50mMCaCl

为了转化S17-1细胞，使用根据Tang等人的方案(Nucleic Acids Res.22(14),2857-2858,1994)，并热休克45秒。

13.谷氨酸棒杆菌的接合

谷氨酸棒杆菌菌株的液体培养物在BHI培养基中于33℃进行。热休克在48.5℃进行9分钟。通过将接合批次铺板在EM8琼脂(表7)上来选择得自第一重组事件的转接合子，所述EM8琼脂补充有25mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸。将EM8琼脂平板在33℃孵育72小时。

表7：EM8琼脂的成分

使用无菌牙签将转接合子转移到BHI琼脂上，该琼脂补充有25mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酮酸。将琼脂平板在33℃孵育20小时。然后将以这种方式产生的各个转接合子的培养物在33℃于含有3个挡板的100ml Erlenmeyer烧瓶中含有的10ml BHI培养基中进一步繁殖24小时。为了分离具有遇到第二重组事件的克隆，从适当稀释的液体培养物中取出等分试样并在补充有10％蔗糖的BHI琼脂上铺板(通常100至200μl)。将琼脂平板在33℃孵育48小时。然后检查在含蔗糖琼脂平板上生长的菌落的表型卡那霉素敏感性。为此，使用牙签从菌落中移出细胞材料并将其转移到含有25mg/l卡那霉素的BHI琼脂上，以及转移到含有10％蔗糖的BHI琼脂上。将琼脂平板在33℃孵育60小时。利用PCR，检查证明对卡那霉素敏感并对蔗糖具有抗性的转接合子克隆中期望的遗传特征整合进入染色体。

14.测定核苷酸序列

由Eurofins Genomics GmbH(Ebersberg,Germany)利用Sanger等人的双脱氧链终止法(Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74,5463–5467,1977)，在Applied

15.大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌菌株的甘油原液

为了大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌菌株的长时间储存，制备甘油原液。将选择的大肠杆菌克隆在补充有2g/l葡萄糖的10ml LB培养基中培养。将选择的谷氨酸棒杆菌克隆在补充有2g/l葡萄糖的2倍浓缩BHI培养基中培养。用50mg/l卡那霉素补充含质粒的大肠杆菌菌株的培养物。用25mg/l卡那霉素补充含质粒的谷氨酸棒杆菌菌株的培养物。将培养基装在含有3个挡板的100ml Erlenmeyer烧瓶中。用取自菌落的一环细胞接种。然后在大肠杆菌的情况下将培养物在37℃和200rpm孵育约18小时，在谷氨酸棒杆菌的情况下将培养物在33℃和200rpm孵育约18小时。在所述孵育期后，向培养物中加入1.2ml 85％(v/v)无菌甘油。然后将获得的含甘油的细胞悬浮液等分成2ml部分，并储存在-80℃。

16.根据Wouter Duetz的培养系统

根据Duetz(Trends Microbiol.2007；15(10)：469-75)的毫升级培养系统用于研究构建的谷氨酸棒杆菌菌株的性能。为此目的，使用来自EnzyScreen BV的24深孔微孔板(24孔WDS板)(Heemstede,Netherlands；目录号CR1424)，其填充有2.5mL培养基。

菌株的预培养物在10ml的2倍浓缩BHI培养基中进行。将培养基装在含有3个挡板的100ml Erlenmeyer烧瓶中。用100μl甘油原液培养物接种，并将培养物在33℃和200rpm孵育24小时。

在所述孵育期后，测定预培养物的光密度OD600。通过用预培养物的等分式样接种24孔WDS板的含2.5ml培养基的孔使得光密度OD600为0.1来制作主培养物。

使用主培养物CGXII培养基作为培养基。CGXII培养基的成分如

表8：Keilhauer的CGXII培养基的成分

将这些主培养物在来自Infors GmbH(Bottmingen，Switzerland)的Infors HTMultitron标准培养箱摇床中于33℃和300rpm孵育约45小时，直至完全消耗葡萄糖。

用来自LifeScan(Johnson&Johnson Medical GmbH，Neuss，Germany)的血糖仪OneTouch

培养后，将培养物悬浮液转移到深孔微孔板中。适当稀释一部分培养物悬浮液以测量OD600。将培养物的另一部分离心，并分析上清液中的L-氨基酸，特别是L-赖氨酸和残余葡萄糖的浓度。

17.氨基酸分析仪

使用来自SYKAM Vertriebs GmbH(Fürstenfeldbruck，Germany)的SYKAM S433氨基酸分析仪，通过离子交换色谱测定培养物上清液中的L-氨基酸(特别是L-赖氨酸)的浓度。使用来自SYKAM的具有球形聚苯乙烯基阳离子交换剂(Peek LCA N04/Na，尺寸150×4.6mm)的柱作为固相。取决于L-氨基酸，使用用于洗脱的缓冲剂A和B的混合物进行等度运行以进行分离，或使用所述缓冲剂通过梯度洗脱进行分离。使用20l含有263g柠檬酸三钠、120g柠檬酸、1100ml甲醇，100ml 37％HCl和2ml辛酸的水溶液(最终pH 3.5)作为缓冲剂A。使用20l含有392g柠檬酸三钠、100g硼酸和2ml辛酸的水溶液(最终pH 10.2)作为缓冲剂B。通过柱后衍生用茚三酮将游离氨基酸着色，并在570nm处用光度法检测。

B)实验结果

谷氨酸棒杆菌菌株DM1933的NCgl0275(whiB4)基因的序列

菌株DM1933是Blombach等人描述的L-赖氨酸分泌谷氨酸棒杆菌菌株(Appliedand Environmental Microbiology 75(2),419-427,2009)。DM1933也以保藏号DSM25442保藏于DSMZ。

通过Illumina全基因组测序技术(Illumina Inc.，San Diego，CA，US)测定菌株DM1933的染色体的核苷酸序列。参见例如Benjak等人(2015)Whole-Genome Sequencingfor Comparative Genomics and De Novo Genome Assembly.In:Parish T.,Roberts D.(eds)Mycobacteria Protocols.Methods in Molecular Biology,Vol 1285.HumanaPress,NY,US)和Bennet,S.(Pharmacogenomics 5(4),433-438,2004)。

发现NCgl0275(whiB4)编码序列的核苷酸序列(包括其上游和下游的核苷酸序列)如SEQ ID NO：1所示与ATCC13032的相同。

DM1933在其染色体中含有编码反馈抗性天冬氨酸激酶多肽的天冬氨酸激酶基因的变体。所述反馈抗性天冬氨酸激酶多肽具有序列表中SEQ ID NO：3的氨基酸序列，其中氨基酸序列位置311处的氨基酸L-苏氨酸(Thr)被L-异亮氨酸(Ile)置换。在Blombach等人(参见Blombach et al.,Applied and Environmental Microbiology 75(2),419-427,2009的表1)和US 7,338,790中，缩写“lysC T311I”用于表示所述交换。

质粒pK18mobsacB_DwhiB4的构建

构建质粒pK18mobsacB_DwhiB4，以使缺失(包含NCgl0275(whiB4)编码序列和邻近终止密码子)整合到期望的谷氨酸棒杆菌菌株的染色体中。该质粒基于

为此，分别产生了三个多核苷酸或DNA分子：一个多核苷酸称为whiB4_up，其包含NCgl0275(whiB4)的编码序列的上游序列(5’-侧翼序列)；第二多核苷酸称为whiB_down，其包含NCgl0275(whiB4)的编码序列的下游序列(3’-侧翼序列)。第三多核苷酸是通过用限制性内切酶XbaI处理进行线性化的质粒pK18mobsacB。多核苷酸whiB4_up和whiB4_down在Gibson组装过程中进行融合，以得到多核苷酸DwhiB4，其包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列，含在pK18mobsacB_DwhiB4中。

使用从谷氨酸棒杆菌ATCC13032培养物中分离的全DNA作为模板，通过PCR合成多核苷酸whiB4_up和whiB4_down。用15秒延伸步骤(参见表4，步骤4)使用Phusion Kit进行PCR。使用引物1f-NCgl0275和1r-NCgl0275扩增上游序列(多核苷酸whiB4_up)；使用引物2f-NCgl0275和2r-NCgl0275_2扩增下游序列(多核苷酸whiB4_down)(表9)。这些引物也示出在序列表的SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：11中。

表9：Phusion Kit PCR期间所用的引物与扩增产物大小列表

扩增产物whiB_up的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。扩增产物whiB_down的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。

扩增产物whiB4_up包含ATCC13032的whiB4编码序列的上游区域的829个核苷酸的序列。在其5’端，装配有与用XbaI切割的pK18mobsacB的序列重叠的序列。在其3’端，装配有与扩增产物whiB4_down的序列重叠的序列。

扩增产物whiB4_down包含ATCC13032的whiB4编码序列的下游区域的828个核苷酸的序列。在其5’端，装配有与扩增产物whiB4_up的序列重叠的序列。在其3’端，装配有与用XbaI切割的pK18mobsacB的序列重叠的序列。所述重叠序列是Gibson组装技术所需的。

质粒pK18mobsacB用限制性内切酶XbaI线性化。消化混合物通过毛细管电泳控制、纯化以及DNA浓度量化。为组装质粒pK18mobsacB_DwhiB4，使用Gibson Assembly Kit将三个多核苷酸(即，用XbaI切割的载体pK18mobsacB、扩增产物whiB_up和扩增产物whiB_down)混合。因此获得的组装混合物用于转化化学感受态大肠杆菌Stellar

根据表5中所示的方案，使用Sapphire Mix和引物1f-NCgl0275及2r-NCgl0275_2，通过菌落PCR对30个卡那霉素抗性转化体进行分析。这些引物在表10中示出，并在序列表的SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：11下。通过毛细管电泳控制扩增产物的大小。

表10：Taq

因此表征为含有期望大小质粒的转化体之一称为Stellar/pK18mobsacB_DwhiB4，并保存为甘油原液。

从所述转化体中分离质粒pK18mobsacB_DwhiB4的DNA，并使用表11中所示的引物DNCgl0275_seq_1、DNCgl0275_seq_2和pCV22_1.p，通过Sanger测序对Gibson组装期间pK18mobsacB内创建的多核苷酸DwhiB进行分析。所述引物也示出在序列表的SEQ ID NO：14至SEQ ID NO：16中。

表11：用于Sanger测序的引物列表

对因此获得的核苷酸序列的分析显示，pK18mobsacB_DwhiB4中包含的多核苷酸DwhiB4具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。

菌株DM1933_ΔwhiB的构建

pK18mobsacB_DwhiB质粒用于将完整whiB4编码序列和邻近终止密码子的缺失整合到L-赖氨酸生产者DM1933的染色体中。

适当时，完整whiB4编码序列和邻近终止密码子的所述缺失缩写为ΔwhiB4、DwhiB或deltawhiB4。

用实施例2中获得的pK18mobsacB_DwhiB4的质粒DNA转化大肠杆菌菌株S17-1的化学感受态细胞。

使用表12中列出的引物Ncgl0275_rev、NCgl0276_rev2和Ncgl0274_fw，通过菌落PCR对转接合子克隆进行分析，之后通过毛细管电泳进行扩增产物的大小测定。这些引物也示出在序列表的SEQ ID NO：17至SEQ ID NO：19中。使用Taq Kit进行PCR(参见表5)。

表12：Taq Kit PCR期间用于菌落PCR的引物的列表与扩增产物大小

因此表征的转接合子克隆之一称为DM1933_ΔwhiB4。制备转接合子克隆的甘油原液培养物，并将其用作进行进一步研究的起始材料。

通过菌株DM1933_ΔwhiB4生产L-赖氨酸。

使用根据Wouter Duetz的培养系统，通过分批培养分析菌株DM1933(参考)和DM1933_ΔwhiB4从葡萄糖生产L-赖氨酸的能力。

使用含有20g/l葡萄糖作为碳源的培养基CGXII。将培养物孵育45小时直至完全消耗葡萄糖，如通过使用血糖仪的葡萄糖分析所确认的，并测定L-赖氨酸的浓度和光密度OD660。实验结果如

表13：菌株DM1933_kup_G344V的L-赖氨酸生产。

该实验显示，与亲本菌株相比，菌株DM1933_ΔwhiB4中L-赖氨酸的生产增加。

序列表

<110> 赢创运营有限公司

<120> 使用具有完全或部分缺失的whiB4基因的物种谷氨酸棒杆菌的L-赖氨酸分泌细菌发酵生产L-赖氨酸的方法

<130> file number: 2018E00276

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2351

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032

<220>

<221> CDS

<222> (1001)..(1348)

<223> coding sequence of NCgl0275 (whiB4)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1349)..(1351)

<223> taa stop codon

<400> 1

agccctgcaa atccacacca tcatgctcat agaacctgcg atcctcaatc gaaacgatcg 60

catccttcat cgacgtagaa atctgatcac ccccaacctc aaaccgccgc tgcgcataaa 120

tataagcaat cggctggtca gtggaatcag taatcgtcgt gacgcccggc ccgcgaccat 180

ccgtcagatc tgaaaggttg gtctgcatcg tgtcattggt acgcgcaacc gcaacgccag 240

aaagactagc gaaaggcaca agtgcgagcg caccaaggac gccagcggcg actgtagatg 300

caacgagctt tgtcagagaa ttcgtggtgg acactccaac agcctagcga taaccccggg 360

aatcgtgaac ccaagactcc aacaatgtca gccaatcttt atttattcga ctgtgcgtta 420

ctgctgacag tcggcatgct ttgggaatcc accaggcaag ctatagggga ctgtagagct 480

gacgttcgga aaacgtgcag aaaaccacga actgcagtcc ggaaagcgcc ccactggccc 540

ttcgccggca gccacagagg ggttagacca tttattcgca actgtgctta cacccaagaa 600

ttctccaaca agaaaaatcc ctctatcaac attttaagtg aatgacctta agggtttgcg 660

gaatgcgatc catgttccaa ctcgcctcaa gcggtatgtg tgaagcaggt ttgaagccag 720

tgatgacctc tgatggggtt agtttgtggc aatttcgggg ctggctgaaa tgcctaattt 780

tccaaaactg aatttaatga gttgagctgt ggtaagacta gtgaactgca gatatgttgg 840

acaattgtaa agtcctctcg ttggaggctt ggcagtgtgg ccataaaagt attgcccccg 900

ttggtgtgat gcattcgaca gcaaattggc tgtgtgacta cacttgcgag tgtattaagt 960

attaggccgt gcatatgtag cgcattttaa ggagattgtc atg acg tct gtg att 1015

Met Thr Ser Val Ile

1 5

cca gag cag cgc aac aac ccc ttt tat agg gac agc gcc aca att gct 1063

Pro Glu Gln Arg Asn Asn Pro Phe Tyr Arg Asp Ser Ala Thr Ile Ala

10 15 20

tcc tcg gac cac aca gag cgt ggt gag tgg gtc act cag gca aag tgt 1111

Ser Ser Asp His Thr Glu Arg Gly Glu Trp Val Thr Gln Ala Lys Cys

25 30 35

cga aat ggc gac cca gat gca ttg ttt gtt cgt ggt gca gcg caa cgc 1159

Arg Asn Gly Asp Pro Asp Ala Leu Phe Val Arg Gly Ala Ala Gln Arg

40 45 50

cga gca gca gca att tgc cgc cac tgc cct gta gcc atg cag tgc tgc 1207

Arg Ala Ala Ala Ile Cys Arg His Cys Pro Val Ala Met Gln Cys Cys

55 60 65

gcc gat gcc tta gat aac aag gtg gaa ttc gga gtc tgg gga ggc ctg 1255

Ala Asp Ala Leu Asp Asn Lys Val Glu Phe Gly Val Trp Gly Gly Leu

70 75 80 85

acc gag cgc cag cgc cgt gca ttg ctt cga aag aag ccg cac att act 1303

Thr Glu Arg Gln Arg Arg Ala Leu Leu Arg Lys Lys Pro His Ile Thr

90 95 100

aac tgg gct gaa tat ttg gct cag ggg ggc gag atc gcc ggg gtt 1348

Asn Trp Ala Glu Tyr Leu Ala Gln Gly Gly Glu Ile Ala Gly Val

105 110 115

taattaattt caagggctgg ccattaacgt ggtcggcttt tttgattcag ggcgcacccc 1408

aggcgcaccc caggcgcacc ccagcgcacc acaggcgcac cccagcgcac cacaggcgca 1468

ccagcccagc acaagagcca acgcaagtgt caggcacgcc agcaaagggg ctagcaagaa 1528

gcacgccccc gaagccttag aaatgcgttc cccggtagga tgattgccat gactaaatgg 1588

gaatacgcaa ctgtgccttt gattacgcat gcaactaagc agatcctcga tacttggggt 1648

gaggacggct gggagttggt ctcggtcatg cctggtatga accctgagaa cctcgttgct 1708

tacatgaagc gtgaggtggc ttagttctta tggcttctaa ttccgaacgc cttgcagagc 1768

tgggcatttc tcttccttcc gttgcagcgc ctgttgctgc gtatgttcct gcgattcaga 1828

ccggtaacca ggtgtggact tctggtcagc tgcctttcgt tgatggtcag cttccggcca 1888

ccggcaaggt tggcgctgag gtttccgctg aggatgcgga gaagttggct cgtgcggctg 1948

cgctaaacgc tcttgctgcg attgatgcgc ttgttggcat tgataaggtc actcgcgttt 2008

tgaagattgt tggtttcgtg gcgtctgctg atgatttcag tggtcagcct gctgtcgtca 2068

acggtgcttc caatttgatg ggtgaggttt tcggcgaggc tggggcgcat gcgcgttctg 2128

ctgtgggcgt ggcggagttg ccgctcaact cgcctgtcga ggtcgaggtt atcgtcgaga 2188

tcgcgcagta gcacgctttt cgacgcaaaa tgccggttcc gcacttcgtg cgaaaccggc 2248

atttttaaat tgaccctatc gtccccttag tgttcgtaag tagaaagatc gtggtctttt 2308

gattctctgg tgattgcgat ggcgatgatg gacactaggg aca 2351

<210> 2

<211> 116

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032

<400> 2

Met Thr Ser Val Ile Pro Glu Gln Arg Asn Asn Pro Phe Tyr Arg Asp

1 5 10 15

Ser Ala Thr Ile Ala Ser Ser Asp His Thr Glu Arg Gly Glu Trp Val

20 25 30

Thr Gln Ala Lys Cys Arg Asn Gly Asp Pro Asp Ala Leu Phe Val Arg

35 40 45

Gly Ala Ala Gln Arg Arg Ala Ala Ala Ile Cys Arg His Cys Pro Val

50 55 60

Ala Met Gln Cys Cys Ala Asp Ala Leu Asp Asn Lys Val Glu Phe Gly

65 70 75 80

Val Trp Gly Gly Leu Thr Glu Arg Gln Arg Arg Ala Leu Leu Arg Lys

85 90 95

Lys Pro His Ile Thr Asn Trp Ala Glu Tyr Leu Ala Gln Gly Gly Glu

100 105 110

Ile Ala Gly Val

115

<210> 3

<211> 1266

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1263)

<223> cds of aspartokinase gene

<220>

<221> misc_feature

<222> (1264)..(1266)

<223> taa stop codon

<400> 3

gtg gcc ctg gtc gta cag aaa tat ggc ggt tcc tcg ctt gag agt gcg 48

Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala

1 5 10 15

gaa cgc att aga aac gtc gct gaa cgg atc gtt gcc acc aag aag gct 96

Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala

20 25 30

gga aat gat gtc gtg gtt gtc tgc tcc gca atg gga gac acc acg gat 144

Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp

35 40 45

gaa ctt cta gaa ctt gca gcg gca gtg aat ccc gtt ccg cca gct cgt 192

Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg

50 55 60

gaa atg gat atg ctc ctg act gct ggt gag cgt att tct aac gct ctc 240

Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu

65 70 75 80

gtc gcc atg gct att gag tcc ctt ggc gca gaa gcc caa tct ttc acg 288

Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr

85 90 95

ggc tct cag gct ggt gtg ctc acc acc gag cgc cac gga aac gca cgc 336

Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg

100 105 110

att gtt gat gtc act cca ggt cgt gtg cgt gaa gca ctc gat gag ggc 384

Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly

115 120 125

aag atc tgc att gtt gct ggt ttc cag ggt gtt aat aaa gaa acc cgc 432

Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg

130 135 140

gat gtc acc acg ttg ggt cgt ggt ggt tct gac acc act gca gtt gcg 480

Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala

145 150 155 160

ttg gca gct gct ttg aac gct gat gtg tgt gag att tac tcg gac gtt 528

Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val

165 170 175

gac ggt gtg tat acc gct gac ccg cgc atc gtt cct aat gca cag aag 576

Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys

180 185 190

ctg gaa aag ctc agc ttc gaa gaa atg ctg gaa ctt gct gct gtt ggc 624

Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly

195 200 205

tcc aag att ttg gtg ctg cgc agt gtt gaa tac gct cgt gca ttc aat 672

Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn

210 215 220

gtg cca ctt cgc gta cgc tcg tct tat agt aat gat ccc ggc act ttg 720

Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu

225 230 235 240

att gcc ggc tct atg gag gat att cct gtg gaa gaa gca gtc ctt acc 768

Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr

245 250 255

ggt gtc gca acc gac aag tcc gaa gcc aaa gta acc gtt ctg ggt att 816

Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile

260 265 270

tcc gat aag cca ggc gag gct gcg aag gtt ttc cgt gcg ttg gct gat 864

Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp

275 280 285

gca gaa atc aac att gac atg gtt ctg cag aac gtc tct tct gta gaa 912

Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu

290 295 300

gac ggc acc acc gac atc acc ttc acc tgc cct cgt tcc gac ggc cgc 960

Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg

305 310 315 320

cgc gcg atg gag atc ttg aag aag ctt cag gtt cag ggc aac tgg acc 1008

Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr

325 330 335

aat gtg ctt tac gac gac cag gtc ggc aaa gtc tcc ctc gtg ggt gct 1056

Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala

340 345 350

ggc atg aag tct cac cca ggt gtt acc gca gag ttc atg gaa gct ctg 1104

Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu

355 360 365

cgc gat gtc aac gtg aac atc gaa ttg att tcc acc tct gag att cgt 1152

Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg

370 375 380

att tcc gtg ctg atc cgt gaa gat gat ctg gat gct gct gca cgt gca 1200

Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala

385 390 395 400

ttg cat gag cag ttc cag ctg ggc ggc gaa gac gaa gcc gtc gtt tat 1248

Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr

405 410 415

gca ggc acc gga cgc taa 1266

Ala Gly Thr Gly Arg

420

<210> 4

<211> 421

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032

<400> 4

Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala

1 5 10 15

Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala

20 25 30

Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp

35 40 45

Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg

50 55 60

Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu

65 70 75 80

Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr

85 90 95

Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg

100 105 110

Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly

115 120 125

Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg

130 135 140

Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala

145 150 155 160

Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val

165 170 175

Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys

180 185 190

Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly

195 200 205

Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn

210 215 220

Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu

225 230 235 240

Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr

245 250 255

Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile

260 265 270

Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp

275 280 285

Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu

290 295 300

Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg

305 310 315 320

Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr

325 330 335

Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala

340 345 350

Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu

355 360 365

Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg

370 375 380

Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala

385 390 395 400

Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr

405 410 415

Ala Gly Thr Gly Arg

420

<210> 5

<211> 1631

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> nucleotide sequence comprising a deletion of the cds of the whiB4

gene of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 and the adjoining

stop codon

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(16)

<223> sequence required for Gibson assembly

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(816)

<223> sequence upstream of the site of deletion (5'-flanking sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (811)..(822)

<223> sequence attgtcttaatt

<220>

<221> misc_feature

<222> (816)..(817)

<223> positions identifying the site of deletion of the coding sequence

and the adjoining stop codon of the whiB4 gene

<220>

<221> misc_feature

<222> (817)..(1616)

<223> sequence downstream of the site of deletion (3'-flanking

sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1617)..(1631)

<223> sequence required for Gibson assembly

<400> 5

ggtacccggg gatcctgtct gcatcgtgtc attggtacgc gcaaccgcaa cgccagaaag 60

actagcgaaa ggcacaagtg cgagcgcacc aaggacgcca gcggcgactg tagatgcaac 120

gagctttgtc agagaattcg tggtggacac tccaacagcc tagcgataac cccgggaatc 180

gtgaacccaa gactccaaca atgtcagcca atctttattt attcgactgt gcgttactgc 240

tgacagtcgg catgctttgg gaatccacca ggcaagctat aggggactgt agagctgacg 300

ttcggaaaac gtgcagaaaa ccacgaactg cagtccggaa agcgccccac tggcccttcg 360

ccggcagcca cagaggggtt agaccattta ttcgcaactg tgcttacacc caagaattct 420

ccaacaagaa aaatccctct atcaacattt taagtgaatg accttaaggg tttgcggaat 480

gcgatccatg ttccaactcg cctcaagcgg tatgtgtgaa gcaggtttga agccagtgat 540

gacctctgat ggggttagtt tgtggcaatt tcggggctgg ctgaaatgcc taattttcca 600

aaactgaatt taatgagttg agctgtggta agactagtga actgcagata tgttggacaa 660

ttgtaaagtc ctctcgttgg aggcttggca gtgtggccat aaaagtattg cccccgttgg 720

tgtgatgcat tcgacagcaa attggctgtg tgactacact tgcgagtgta ttaagtatta 780

ggccgtgcat atgtagcgca ttttaaggag attgtcttaa tttcaagggc tggccattaa 840

cgtggtcggc ttttttgatt cagggcgcac cccaggcgca ccccaggcgc accccagcgc 900

accacaggcg caccccagcg caccacaggc gcaccagccc agcacaagag ccaacgcaag 960

tgtcaggcac gccagcaaag gggctagcaa gaagcacgcc cccgaagcct tagaaatgcg 1020

ttccccggta ggatgattgc catgactaaa tgggaatacg caactgtgcc tttgattacg 1080

catgcaacta agcagatcct cgatacttgg ggtgaggacg gctgggagtt ggtctcggtc 1140

atgcctggta tgaaccctga gaacctcgtt gcttacatga agcgtgaggt ggcttagttc 1200

ttatggcttc taattccgaa cgccttgcag agctgggcat ttctcttcct tccgttgcag 1260

cgcctgttgc tgcgtatgtt cctgcgattc agaccggtaa ccaggtgtgg acttctggtc 1320

agctgccttt cgttgatggt cagcttccgg ccaccggcaa ggttggcgct gaggtttccg 1380

ctgaggatgc ggagaagttg gctcgtgcgg ctgcgctaaa cgctcttgct gcgattgatg 1440

cgcttgttgg cattgataag gtcactcgcg ttttgaagat tgttggtttc gtggcgtctg 1500

ctgatgattt cagtggtcag cctgctgtcg tcaacggtgc ttccaatttg atgggtgagg 1560

ttttcggcga ggctggggcg catgcgcgtt ctgctgtggg cgtggcggag ttgccgagtc 1620

gacctgcagg c 1631

<210> 6

<211> 1600

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> nucleotide sequence comprising a deletion of part of the cds of

the whiB4 gene of Corynebacterium glutamicum ATCC13032

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(800)

<223> sequence upstream of the site of deletion (5'-flanking sequence)

<220>

<221> CDS

<222> (774)..(800)

<223> residual 5'-coding sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (794)..(807)

<223> sequence gcagcgcgccgggg

<220>

<221> misc_feature

<222> (800)..(801)

<223> positions identfying the site of deletion within the coding

sequence of the whiB4 gene

<220>

<221> CDS

<222> (801)..(809)

<223> residual 3'-coding sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (801)..(1600)

<223> sequence downstream of the site of mutation (3'-flanking

sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (810)..(812)

<223> taa stop codon

<400> 6

accgcaacgc cagaaagact agcgaaaggc acaagtgcga gcgcaccaag gacgccagcg 60

gcgactgtag atgcaacgag ctttgtcaga gaattcgtgg tggacactcc aacagcctag 120

cgataacccc gggaatcgtg aacccaagac tccaacaatg tcagccaatc tttatttatt 180

cgactgtgcg ttactgctga cagtcggcat gctttgggaa tccaccaggc aagctatagg 240

ggactgtaga gctgacgttc ggaaaacgtg cagaaaacca cgaactgcag tccggaaagc 300

gccccactgg cccttcgccg gcagccacag aggggttaga ccatttattc gcaactgtgc 360

ttacacccaa gaattctcca acaagaaaaa tccctctatc aacattttaa gtgaatgacc 420

ttaagggttt gcggaatgcg atccatgttc caactcgcct caagcggtat gtgtgaagca 480

ggtttgaagc cagtgatgac ctctgatggg gttagtttgt ggcaatttcg gggctggctg 540

aaatgcctaa ttttccaaaa ctgaatttaa tgagttgagc tgtggtaaga ctagtgaact 600

gcagatatgt tggacaattg taaagtcctc tcgttggagg cttggcagtg tggccataaa 660

agtattgccc ccgttggtgt gatgcattcg acagcaaatt ggctgtgtga ctacacttgc 720

gagtgtatta agtattaggc cgtgcatatg tagcgcattt taaggagatt gtc atg 776

Met

acg tct gtg att cca gag cag cgc gcc ggg gtt taattaattt caagggctgg 829

Thr Ser Val Ile Pro Glu Gln Arg Ala Gly Val

5 10

ccattaacgt ggtcggcttt tttgattcag ggcgcacccc aggcgcaccc caggcgcacc 889

ccagcgcacc acaggcgcac cccagcgcac cacaggcgca ccagcccagc acaagagcca 949

acgcaagtgt caggcacgcc agcaaagggg ctagcaagaa gcacgccccc gaagccttag 1009

aaatgcgttc cccggtagga tgattgccat gactaaatgg gaatacgcaa ctgtgccttt 1069

gattacgcat gcaactaagc agatcctcga tacttggggt gaggacggct gggagttggt 1129

ctcggtcatg cctggtatga accctgagaa cctcgttgct tacatgaagc gtgaggtggc 1189

ttagttctta tggcttctaa ttccgaacgc cttgcagagc tgggcatttc tcttccttcc 1249

gttgcagcgc ctgttgctgc gtatgttcct gcgattcaga ccggtaacca ggtgtggact 1309

tctggtcagc tgcctttcgt tgatggtcag cttccggcca ccggcaaggt tggcgctgag 1369

gtttccgctg aggatgcgga gaagttggct cgtgcggctg cgctaaacgc tcttgctgcg 1429

attgatgcgc ttgttggcat tgataaggtc actcgcgttt tgaagattgt tggtttcgtg 1489

gcgtctgctg atgatttcag tggtcagcct gctgtcgtca acggtgcttc caatttgatg 1549

ggtgaggttt tcggcgaggc tggggcgcat gcgcgttctg ctgtgggcgt g 1600

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> artificial sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 7

Met Thr Ser Val Ile Pro Glu Gln Arg

1 5

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> primer

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(35)

<223> primer 1f-NCgl0275

<400> 8

ggtacccggg gatcctgtct gcatcgtgtc attgg

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> primer

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(37)

<223> primer 1r-NCgl0275

<400> 9

cccttgaaat taagacaatc tccttaaaat gcgctac

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> primer

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(35)

<223> primer 2f-NCgl0275

<400> 10

taaggagatt gtcttaattt caagggctgg ccatt

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> primer

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(33)

<223> primer 2f-NCgl0275_2

<400> 11

gcctgcaggt cgactcggca actccgccac gcc

<210> 12

<211> 829

<212> DNA

<213> artificial sequence

<220>

<223> amplificate whiB4_up

<400> 12