利用担子菌门菌丝的液相培养工序的天门冬及大豆胚芽的生物转化产物制备方法及其用途

技术领域

本申请要求于2018年10月26日提交且申请号为第10-2018-0129192号的韩国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

本发明涉及利用担子菌门菌丝的液相培养工序的天门冬及大豆胚芽的生物转化产物制备方法及其用途，更详细地，涉及如下的生物转化产物的制备方法：通过将作为具有各种功效的天然原料的天门冬和大豆胚芽作为培养基质的有效生物转化工序(微生物发酵转化)，使得天门冬和大豆胚芽的功效成分和担子菌门菌丝所生成的β-葡聚糖(glucan)的生产率最大化。

背景技术

根据罗尔夫·辛格(Singer,R.)的分类书，裂褶菌(Schizophyllum commune)为在分类学上属于担子菌门的裂褶菌科裂褶菌属的菌，为向细胞外生产β-1，6-支链-β-1，3-葡聚糖(β-1，6-branched-β-1，3-glucan)的菌株。裂褶菌可在野外采摘，可通过如下的形态特征或分类指标进行鉴定。裂褶菌的子实体没有茎，菌盖的侧面附着在基部，大小通常为1.0cm至3.0cm，呈扇形或肾形，具有纵向褶皱，末端不规则的裂开，覆盖有微细的毛。皱纹为白色，但是，若成熟，则变为浅灰色或淡紫褐色，组织在干燥的情况下收缩，若吸收水分，则恢复。孢子印为白色，孢子呈4～6μm×1.5～2μm大小的圆锥形，平滑且呈白色。裂褶菌(Schizophyllum commune Fr.)为在老树上自然生长的角质的蘑菇，在韩国蘑菇图鉴及罗尔夫·辛格的分类书中详细记载更详细的生长方式及形状。

裂褶菌因口感粗糙，仅在中国的一部分食用而周知，随着存在于该蘑菇中的β-1，6-支链-β-1，3-葡聚糖结构的称为“裂褶菌多糖(Schizophyllan)”的多糖的生理活性，即，保湿效果、抗-肿瘤活性、噬细胞刺激、抗生(anti-biotic)活性等的免疫学效果(Shimizuet al.1992；Komatsu et al.1973)等被周知，利用其来用作药品、化妆品等的有效功能成分等各种用途。源自裂褶菌的裂褶菌多糖为在β-1，3-葡聚糖主糖链具有规则的β-1，6-残基的葡聚糖。相比于利用香菇(Lentinus edodes)、平菇(Pleurotus ostreatus)、裂蹄木层孔菌(Phellinus linteus)等的其他蘑菇类生成的β-葡聚糖的分子量为数十万～200万，源自裂褶菌的裂褶菌多糖的分子量为200万～500万，相当大，相比于其他蘑菇类的β-葡聚糖具有不均匀的糖组成和结构，具有分支的均匀且特有的结构，且具有向细胞外分泌的稳定的中性多糖的特性。

随着源自裂褶菌的作为多糖的β葡聚糖的功能被周知，通过尝试各种方法来进行纯分离纯化。在用于获取源自裂褶菌的β葡聚糖的方法中，蘑菇子实体的培养时间非常长，根据培养方法，具有组成不均匀的可能性，通过固体培养基的菌丝体培养的培养时间也长且不均匀，当提取β葡聚糖时，无法排除培养基成分对于提取的影响。由此，作为短时间内获取大量的作为裂褶菌的生理活性成分的β葡聚糖的方法，对从子实体获取的菌丝体进行液体培养。在利用蘑菇菌丝体有效获取纯且高浓度的β葡聚糖的方法中，研究了很多通过液体培养增加生成量的方法，尤其，以裂蹄木层孔菌、灵芝等为对象积极进行与向细胞外生成的β葡聚糖有关的研究。

另一方面，天门冬(Asparagus cochinchinensis(Lour.)Merr.)为分布在韩国、中国、日本的百合科(Liliaceae)植物，自古以来，将干根(块根)广泛用于食用及药用，已周知其具有抗炎、利尿作用、镇咳、抗菌、神经稳定、促进唾液分泌、解热等多种药理作用。

由此，具有如镇静剂及稳定剂的附加效果，同时，用于治疗与肝炎、皮肤炎、哮喘、糖尿病、脑疾病相关的炎症疾病。不仅包含19种的氨基酸和多糖(polysaccharides)，还包含20种的多功能化合物(β-谷甾醇(β-sitosterol)、胡萝卜甙(daucosterol)、n-ethatriacontanoic acid、棕榈酸(palmitic acid)、9-heptacosylene、菝葜皂甙元(smilagenin)、薯蓣皂甙元(diosgenin)、菝葜皂苷元-3-O-β-D-葡萄糖苷喂养吡虫啉(sarsasapogenin-3-O-β-D-glucoside feeding grapes imidacloprid)、5-甲氧基甲基糠醛(5-methoxy methylfurfural)、山药皂甙元(yame sapogenin)，薯蓣皂甙元-3-O-β-D吡虫啉喂养葡萄糖甙(diosgenin-3-O-β-D imidacloprid feeding glucose glycosides)、aspacochioside D、iso-agatharesinoside及7种甾体皂苷(seven steroidalsaponins))。并且，经确认，具有抑制细胞凋亡(apoptosis)且抑制在大鼠(rat)的皮肤诱导的炎症的效果，并且，已知与骨代谢相关具有促进成骨细胞的分化且抑制破骨细胞生成的效果。

天门冬的营养成分

大豆(Soybean)富含蛋白质和脂肪，并含有许多作为必须氨基酸的赖氨酸。含20％～45％的蛋白质、18％～22％的脂肪、22％～29％的碳水化合物及4.5％～5％的灰分，含有作为必须氨基酸的赖氨酸、胱氨酸、色氨酸、谷氨酸等，其中，大豆胚芽(Soybean Embryo)中的异黄酮含量最高(2％)。并且，大豆含有大量的皂苷(saponin)，因此，防止在体内生成过氧化脂肪且参与脂质代谢，对于防止老化、肥胖有效，大豆中包含的皂苷共有5种(大豆皂苷I(Soyasaponin I)、大豆皂苷II(Soyasaponin II)、大豆皂苷III(Soyasaponin III)、大豆皂苷A

在本发明中，提供如下的生物转化产物的制备方法和其用途：通过将作为具有各种功效的天然原料的天门冬和大豆胚芽作为培养基质的有效生物转化工序(微生物发酵转化)，使得天门冬和大豆胚芽的功效成分和担子菌门菌丝所生成的β-葡聚糖的生产率最大化。

现有技术文献

韩国公开专利第10-2013-0077803号

发明内容

技术问题

本发明提供如下的生物转化产物的制备方法和其用途：通过将作为具有各种功效的天然原料的天门冬和大豆胚芽作为培养基质的有效生物转化工序(微生物发酵转化)，使得天门冬和大豆胚芽的功效成分和担子菌门菌丝所生成的β-葡聚糖的生产率最大化。

技术方案

本发明提供天门冬及大豆胚芽的生物转化产物制备方法，其包括步骤a，制备包含天门冬及大豆胚芽的培养基；以及步骤b，在上述培养基接种担子菌门菌丝并培养。

上述担子菌门菌丝可在液相培养基中培养。

上述担子菌门菌丝可在静置用液相培养基中培养5天～7天后，震荡培养1天～3天来获取。

上述培养基可包含葡萄糖、天门冬、大豆胚芽、硝酸钠、磷酸钾以及硫酸镁。

上述培养基可包含65重量份～75重量份的葡萄糖、72重量份～82重量份的天门冬、0.5重量份～5重量份的大豆胚芽、15重量份～25重量份的硝酸钠、10重量份～20重量份的磷酸钾以及1重量份～7重量份的硫酸镁。

上述培养可接种5％(v/v)～15％(v/v)的担子菌门菌丝来执行。

上述培养可通过在25℃～35℃的温度下震荡培养3天～5天的方法执行。

上述担子菌门菌丝可包括选自由裂褶菌、裂蹄木层孔菌、桦褐孔菌、香菇、灰树花、木耳以及绣球菌组成的组中的一种以上。

在上述步骤b之后，上述方法还可包括获取天门冬和大豆胚芽的生物转化产物及β-葡聚糖的步骤。

上述方法可生成β-葡聚糖、氨基酸及类黄酮。

并且，本发明提供生物转化产物，其通过下述步骤制备：制备包含天门冬及大豆胚芽的培养基的步骤；以及在上述培养基接种担子菌门菌丝并培养的步骤。上述生物转化产物可用作食品、保健功能食品、功能性化妆品、医药外品或医药品原料。

并且，本发明提供生物转化用培养基，用于制备利用担子菌门菌丝的液相培养工序的生物转化用产物。上述培养基可包含葡萄糖、天门冬、大豆胚芽、硝酸钠、磷酸钾以及硫酸镁。

更具体地，上述培养基包含65重量份～75重量份的葡萄糖、72重量份～82重量份的天门冬、0.5重量份～5重量份的大豆胚芽、15重量份～25重量份的硝酸钠、10重量份～20重量份的磷酸钾以及1重量份～7重量份的硫酸镁。

发明的效果

根据本发明，可通过担子菌门菌丝的液相培养工序高效率地生成天门冬和大豆胚芽的生物转化产物(或者功效成分)以及β-葡聚糖。根据本发明制备的生物转化产物为利用源自自然状态的有机物的具有高安全性的材料，其应用领域多种多样。具体地，可适用于食品及保健功能性食品(免疫力增强饮料、抗炎改善食品等)、医疗产品(特应性皮炎相关软膏、抗炎及保湿用皮肤贴等)、化妆品(普通产品及特应性相关产品、脱发及美白等追加功能性产品的应用)等。

附图说明

图1为示出完全析因设计(FFD)的回归分析结果的培养基成分对于β-葡聚糖生产率(通过EPS值测定)的影响和交互因子的效果的交互关系图表(A：大豆胚芽，B：天门冬，C：NaNO

图2为示出根据响应面法(RSM，Response Surface Method)试验次数(Trialnumber)的DCW、EPS、最终pH值(Final pH)、Yp/x分析结果的图表。

图3为通过三维图标图示化根据用于响应面法实验的中心合成设计的培养基因素对生产率的效果的图，为在β葡聚糖生产角度分析根据培养基的影响和交互作用的图表。

图4为示出通过单次单因子(OFAT，One Factor At a Time)方法分析根据天门冬增加的培养基之间的相互作用和β-葡聚糖生产率的结果的图表。

图5为示出通过单次单因子方法分析根据天门冬增加的总类黄酮的含量变化的结果的图表。

图6为示出在5L培养机中执行的天门冬/大豆胚芽生物(发酵)转化工序的图。

图7为示出分析天门冬热水提取物(A)、天门冬/大豆胚芽生物(发酵)转化产物(B)、未添加天门冬/大豆胚芽的发酵培养物(C)、对照组(D)的抗菌效果的圆盘检查法(Discassay)结果的图。

图8为示出将作为天然原料的天门冬和大豆胚芽作为培养基质的生物转化工序(微生物发酵转化)前后的氨基酸含量比较结果的图(从上依次为氨基酸对照组、天门冬热水提取物、天门冬/大豆胚芽生物(发酵)转化产物)。

具体实施方式

以下，通过实施例更详细地说明本发明。可通过以下实施例容易理解本发明的目的、特征、优点。本发明并不限定于在此说明的实施例，还可具体化为其他形态。在此介绍的实施例为了向本发明所属技术领域的普通技术人员充分传递本发明的思想而提供。因此，本发明并不局限于以下实施例。

本发明涉及如下的作为复合功能性材料的生物(发酵)转化产物的制备：研发作为具有各种功效的天然原料的天门冬和大豆胚芽作为培养基质的有效发酵转化工序，使得天门冬和大豆胚芽的功效成分和裂褶菌(Schizophyllum commune)所生成的β-葡聚糖的生产率最大化。

本发明与现有技术的差别在于，通过利用微生物(裂褶菌(Schizophyllumcommune))的生理功能实现物质的化学变化的生物转化系统具有如下的优点，即，缓解中草药天然产物(天门冬及大豆胚芽)中所包含的功效物质的毒性并改善功效，同时，通过生物培养工序调节代谢产物，由此，可以高产作为微生物生成的有效成分的β-葡聚糖。

在本发明中使用的裂褶菌为担子菌，完全无毒，生成作为细胞外的生物聚合物(extracellular biopolymer)的β-1，6-支链-β-1，3-葡聚糖。作为源自裂褶菌的β-葡聚糖的裂褶菌多糖为非离子水溶性多糖，平均分子量为2～5×10

裂褶菌可适用于制药业(免疫调节剂、抗癌剂、药物递送物质、皮肤炎/伤口治疗剂等)、化妆品业(保湿剂、软化剂、固化剂等)或饲料业(用于增强免疫力的动物饲料添加剂等)等。

在本发明中，通过统计学方法及各种组合实验研发了能够高效率生成天门冬和大豆胚芽的功效成分以及β-葡聚糖的生物(微生物发酵)转化培养基。

在根据本发明的一实施例最终研发的生物转化工序的情况下，相比于未添加天门冬和大豆胚芽的对照组(control)条件，示出高2倍～3倍的约20g/L的β-葡聚糖生产率，表示每个单位细胞的生产率的Yp/x也增加了5倍以上。

经确认，相比于相同浓度的天门冬热水提取物，总氨基酸含量增加约1.5倍，16种氨基酸中的酪氨酸(Tyrosine)、丙氨酸(Alanine)、苏氨酸(Threonine)增加约1.3倍～1.7倍，亮氨酸(Leucine)、苯基丙氨酸(Phenylalanine)、甘氨酸(Glycine)增加约2.6倍～3倍，尤其，在甲硫氨酸(Methionine)的情况下，增加10倍，示出比其他氨基酸高的增加率，总类黄酮含量也显著增加。

基于必须氨基酸的这种氨基酸含量的增加是证实其作为功能材料的可能性的结果，上述功能性材料不仅改善包括免疫力在内的毛发或皮肤等的健康状态，还有助于治疗如肥胖或阿尔茨海默病的特定疾病。

因此，根据本发明制备的生物(发酵)转化产物不仅可适用为食品及化妆品的功能性材料，还可适用为医药外品及医药品的功能性材料。

为了实现上述目的，在本发明的一实施例中，可提供包含69.6g/l的葡萄糖、77g/l的天门冬干燥粉末、1.5g/l的大豆胚芽干燥粉末、20g/l的硝酸钠、15g/l的磷酸钾以及2g/l的硫酸镁的生物(发酵)转化用培养基。

实施例：用于生物(发酵)转化工序的裂褶菌菌丝体液相培养法

(1)天门冬及大豆胚芽的原材料准备步骤

在可大量干燥的热风干燥机中，对每个完成清洗及切割作业的原材料进行干燥作业后，通过粗粉碎及细粉碎工序对每个天然原材料进行粉末化作业来准备。

(2)用于发酵转化的裂褶菌菌丝体种菌培养步骤

无菌收集在琼脂培养基(马铃薯淀粉4g、葡萄糖20g、琼脂15g、蒸馏水1l)中生长的菌丝体(利用Quegen Biotech Co,.Ltd研发的作为β-葡聚糖高生产菌株的Schizophyllumcommune QG143-1的菌丝体)后，在28℃的温度下，在静置用液相培养基(马铃薯淀粉4g、葡萄糖20g)对其进行6天的培养。再次无菌收集通过这种方式培养的菌体并接种在相同成分的生长培养基中，使其成为10％(v/v)，之后，在150rpm的条件下进行搅拌，并在28℃的温度下震荡培养2天，从而用作发酵转化工序的种菌。

在用于生物(发酵)转化工序的本培养中，接种10％(v/v)的种菌，并在28℃的温度、150rpm的条件下震荡培养4天。

(3)天门冬及大豆胚芽的生物(发酵)转化工序研发步骤

为了将用于生物(发酵)转化的裂褶菌培养基最优化，添加天门冬及大豆胚芽，并以统计学方法为基础确定最优化条件。为此，通过单次单因子方法和Plackett-Burman设计执行了培养基成分最优化，并且，通过完全析因设计(Full Factorial design，FFD)和响应面法(Response surface method，RSM)执行了培养基浓度最优化。

在本发明的一实施例中，通过单次单因子方法和Plackett-Burman设计(design)等并考虑经济性和生产率，选择了天门冬和大豆胚芽的生物(发酵)转化工序所需的作为剩余培养基成分的碳源(葡萄糖)、氮源(硝酸钠)以及无机盐类(磷酸钾、硫酸镁)。之后，通过作为统计学培养基最优化方法的完全析因设计和响应面法提高利用裂褶菌的天门冬/大豆胚芽发酵转化产物的有效性，同时，将可高生产药用蘑菇的有效成分的β-葡聚糖的最优培养基浓度确定得如下：葡萄糖69.6g/l、天门冬干燥粉末77g/l、大豆胚芽干燥粉末1.5g/l、硝酸钠20g/L、磷酸钾15g/l及硫酸镁2g/l。

1.用于生物(发酵)转化工序的裂褶菌培养基成分研究

为了使天门冬/大豆胚芽发酵转化产物的生产培养基最优化，通过包含4种碳源(葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖)、5种氮源(大豆胚芽、酵母提取物(Yeast extract)、大豆蛋白胨(Soytone)、天门冬、NaNO

2.通过完全析因设计的裂褶菌-天门冬生成培养基成分研究

完全析因设计为统计学培养基最优化方法中的可确认各个因素(factor)之间的相互作用的代表性实验法，系统分析了培养基组成的变化对于β-葡聚糖的生产率和总类黄酮值的影响。

完全析因设计为通过因素和水平(level)的细组合反应(response)以及假设因素的线性模型的一阶回归模型的解释找到最佳条件的方法，n为表示水平的数，k为表示因素的数，实验次数确定为(nk)。在本发明的一实施例中，具有(-1)低级别(low level)和(+1)高级别(high level)两种水平，利用大豆胚芽、天门冬、NaNO

执行方差分析(ANOVA)的结果，P值(value)为＜0.0001，为非常可信的水平的结果，这表示实验结果准确率为99.999以上(表1)。

表1

在完全析因设计回归方差分析结果中，若观察培养基成分对于β-葡聚糖生产率(通过EPS值测定)的影响和表示交互因子的效果的交互关系图表(interaction graph，图1)，则可确认到，与天门冬和大豆胚芽的添加浓度无关地，生产率随着NaNO

通过表2可确认，若观察NaNO

表2

通过这种结果确认了，NaNO

由此，在响应面法中，在NaNO

3.通过响应面法的裂褶菌-天门冬生成培养基最优化

响应面法为如下的统计学分析方法：为了查找对于根据各种实验因子，即，自变量(培养基成分)的相互作用的因变量(EPS生产率)的变化，表示最大响应值的最优条件(最优培养基浓度)而利用。可通过响应面法迅速确定最优条件，在各种条件中，可掌握相互作用。并且，具有可通过小规模实验预测未实验的部分中的最优位置的优点。

响应面法为如下的统计学分析方法：当查找对于反应的因素水平的最优条件时，为了查找对于假设非线性模型的二阶回归模型的最优条件解释，即，根据自变量(培养基成分)的相互作用的因变量(EPS生产率)的变化表示最大响应值的最优条件(最优培养基浓度)而利用。这种响应面法可通过小规模的实验预测未实验的部分中的最优位置，由此，具有可迅速确定最优条件且在各种条件下掌握相互作用的优点，根据实验设计细分为Box-Behnken设计和在因素配置法(Factorial Design)的因素实验点添加中心点和轴点的实验点的中心合成设计(central composite design)。

本研究组作为使响应面法变得容易的实验计划法，使用了在2

在通过中心合成设计获取的结果中，利用Design-Expert(设计专家)6.0program统计分析来获取回归方程，由此，检查对于各个培养基成分的相互影响并求得用于β-葡聚糖生产率(通过EPS值测定)的最优培养条件。在此情况下，通过进行方差分析时给出的P值确定对于整体模型(model)的显著性，通常，当P＜0.05时，认可其显著性。对于二次多项式的f值最大化的位置，利用三维响应表面图和等值线图(contour plot)分析了最优培养条件、生物(发酵)转化培养基的最优浓度。

结果，可获取P值为0.0001的显著结果，并可获取说明各个培养基成分的影响和交互作用的二次多项式(表3)。

表3

表4

实验结果，在以高水平添加NaNO

经确认，在β-葡聚糖生成(通过EPS值测定)的观点上，若通过二次多项式确定的图表观察根据培养基的影响和交互作用，则大豆胚芽和天门冬反比例地相互作用并影响生产率，当KH

经确认，若观察天门冬和NaNO

因此，通过最大浓度为20g/L的NaNO

以17g/L、47g/L、77g/L、107g/L、137g/L的天门冬和10g/L、15g/L、20g/L的NaNO

表5

在β-葡聚糖的生产率最高的6号、9号中，确定总类黄酮含量为较高的0.75的9号组合，对发酵机中的生产率和生物(发酵)转化工序前后的氨基酸含量变化及抗菌效果等进行比较，由此，确认了最优化的条件中的生物(发酵)转化产物的有效性与否。

本研究组可以通过这种过程研究用于天门冬/大豆胚芽生物(发酵)转化的培养机内的培养特性且对工序前后的物质进行比较、分析，由此确认了作为生物(发酵)转化产物的研发材料的优秀性。

为了执行5L培养机中的天门冬/大豆胚芽生物(发酵)转化工序，将在QuegenBiotech Co,.Ltd中研发的作为β-葡聚糖高生产菌株的Schizophyllum commune QG143-1的菌丝体在马铃薯葡萄糖培养液(PDB，Potato Dextrose Broth)培养基生长培养后，接种在包括本发明的一实施例中提供的生物(发酵)转化用培养基(69.6g/l的葡萄糖、77g/l的天门冬干燥粉末、1.5g/l的大豆胚芽干燥粉末、20g/L的硝酸钠、15g/l的磷酸钾及2g/l的硫酸镁)的生物培养机中。将作为生物培养机的70％的3.5L作为操作体积，维持150rpm的搅拌速度(agitation speed)、1vvm的气体净化速率(gas purging rate)并在28℃的温度下培养4天(图6)。

结果，可确认，相比于对照组条件，具有高出2倍～3倍的再现性的β葡聚糖生产率，表示每个单位细胞的生产收率的Yp/x值为2.04、总类黄酮含量为0.94g/L，相比于培养前，增加约36倍。天门冬/大豆胚芽的生物(发酵)转化产物的这种结果还可在各种有效性评价实验中确认。

并且，相比于以往的提取物(热水提取物)和对照组，具有突出的抗菌效果，这可通过大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的圆盘检查法实验确认(图7)。

氨基酸分析结果，以16种一级结构氨基酸为基准，相比于以往的提取物，天门冬/大豆胚芽生物(发酵)转化产物的总氨基酸含量约增加1.5倍，酪氨酸、丙氨酸、苏氨酸约增加1.3倍～1.7倍，亮氨酸、苯基丙氨酸、甘氨酸约增加2.6倍～3倍。并且，在甲硫氨酸的情况下，其增加率为10倍，比其他氨基酸优秀(表6、表7、图8)。

表6

氨基酸分析条件/用于氨基酸分析的衍生物化试剂及方法

衍生物化方法

硼酸盐缓冲剂(Borate buffer)∶AASTD∶邻苯二甲醛(OPA)的试剂比例为5∶1∶1

1.0.5mL的硼酸盐缓冲剂(有助于衍生物化顺畅的试剂)

2.0.1mL的样品(Sample)(AA STD或氨基酸分析样品)

3.很好地混合1项、2项的试剂

4.还添加0.1mL的邻苯二甲醛并很好地混合(邻苯二甲醛：初始衍生物化试剂)

5.若所要稀释试剂，则利用去离子水(DI water)稀释

表7

氨基酸标准物质及实验试样的氨基酸含量分析结果