肠道菌群标志物在自闭症诊断中的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，尤其涉及肠道菌群标志物在自闭症中的应用。

背景技术

自闭症(autism)，又称孤独症或孤独性障碍(autistic disorder)等，是广泛性发育障碍(pervasive developmental disorder，PDD)的代表性疾病。《DSM-IV-TR》将PDD分为5种：孤独性障碍、Retts综合症、童年瓦解性障碍、阿斯伯格综合征和未特定的PDD。其中，孤独性障碍与阿斯伯格综合征较为常见。孤独症的患病率报道不一，一般认为约为儿童人口的2～5/万人，男女比例约为3～4：1，男孩比女孩多3～4倍。

自闭症分为真性自闭症和假性自闭症。真性自闭症(器质性自闭症)是患者由于基因突变造成大脑思维功能缺失，失去或严重缺失思维功能。他们的面相与常人无异，但其先天缺失总结、归纳、分析、判断等逻辑思维能力，终身智力低下。假性自闭症(功能性自闭症)是指患儿大脑思维区域无器质性病变，具有正常的思维能力，但是他们智力的缺失是由于后天某项能力的发展不平衡。假性自闭症与真性自闭症存在本质的区别。真性自闭症是由基因突变所致，根据演算所得人类真性自闭症比例应该接近十五万分之一，推算出中国每年出生真性自闭症儿童应该不超过120个，美国每年出生真性自闭症患者应低于36个。真性自闭症是应该属于罕见疾病。目前没有有效的康复办法。假性自闭症是由于影响人类学习能力中的几项能力要素发展不均衡。即某项能力极弱或某项能力过强，致使患儿有可能丧失部分或全部的思维能力，造成终身智力缺陷，表现出真性自闭症的特质。国内医院诊断统计，自闭症的发病率为2‰～3‰，其中真性自闭症占比低于0.2％，假性自闭症占比超过99.8％。

20世纪80年代，关于孤独症的研究进入全新阶段。人们开始抛弃所谓“父母抚养方式不当”的病因假说，从生物学领域探索孤独症的病因，并在临床症状的识别和临床诊断方面将孤独症与精神分裂症彻底分开。Kolvin的研究表明，孤独症同成年精神病性障碍，尤其是成年精神分裂症没有关系。1980年出版的《DSM-Ⅲ》首次将童年孤独症视为一种广泛性发育障碍。之后，随着对孤独症研究的深入，逐步认识到孤独症是一种在一定遗传因素作用下，受多种环境因子刺激导致的弥漫性中枢神经系统发育障碍性疾病。在此认识的基础上，开展了从分子遗传到神经免疫、功能影像、神经解剖和神经化学等多方面的研究，人们试图从这些研究中找到孤独症的致病原因。

由于目前仍没有任何一种假说能从根本上完美地解释孤独症的病因，因此自闭症的预判、诊断、治疗都没有很好的方法。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种自闭症手段和产品。

我们对自闭症患者(非遗传因素引起的)肠道微生物菌群的丰度与正常儿童肠道微生物菌群的丰度进行了研究，发现受试者肠道微生物中存在的原核生物Cyanobacteria与自闭症的发生存在显著的相关性(p值为0.008)。这表明原核生物Cyanobacteria与自闭症的发生有密切的关系，可能是导致假性自闭症的主要原因。

针对原核生物Cyanobacteria的检测，可以对受试者患有自闭症，或具有自闭症风险，进行有效筛选。(注：原核生物Cyanobacteria在自然界是非常古老的细菌，Melainabacteria是Sara C Di Rienzi等人在2013年发现并命名，是原核生物Cyanobacteria在进化上的一个分支。)

本发明的目的在于提供检测肠道菌群丰度的试剂在制备诊断自闭症产品中的应用，所述的微生物包括原核生物Cyanobacteria。

优选的，所述的原核生物Cyanobacteria包括Melainabacteria。

优选的，所述试剂包括检测所述微生物的特异性的引物、探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体。

优选的，所述特异性的引物是能够检测所述微生物16SrRNA的引物。

本发明的目的还在于提供一种诊断自闭症的产品，所述产品包括检测原核生物Cyanobacteria丰度的试剂。

优选的，所述试剂包括检测所述原核生物16SrRNA的引物。

本发明的目的还在于一种诊断自闭症的试剂盒，所述试剂盒包括特异性检测原核生物Cyanobacteria的16SrRNA的引物对。

本发明的目的还在于一种诊断自闭症的芯片，其特征在于，所述芯片包括固相载体，以及固定在固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针特异性识别原核生物Cyanobacteria的16SrRNA。

在本发明中，术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

本发明中的示例性探针包括PCR引物以及基因特异性DNA寡核苷酸探针，例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。

所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleicacid，肽核酸)、LNA(locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerol nucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。

本文中使用的术语“样本”或“测试样本”指的是含核酸的任何液体材料或固体材料。在合适的实施方式中，测试样本从生物源获取(即，“生物样本”)，比如培养中的细胞，或者是来自动物且最优选地来自人类的组织样本。在示例性实施方式中，所述样本是粪便。

术语“丰度差异”是指，与正常或对照用靶的体内水平相比，在患有自闭症的患者体内得到更高或更低水平的微生物。

在本发明中，术语“引物”的意思是，能够形成与模板链互补的碱基对(basepair)，并且起到用于复制模板链的起始点作用的7个～50个核酸序列。引物通常合成而得，但也可以使用自然生成的核酸。引物的序列并不一定需要与模板的序列完全相同，只要充分互补而能够与模板杂交即可。可以混入不改变引物的基本性质的追加特征。作为可以混入的追加特征的例子，有甲基化、带帽、一个以上的核酸被同系物取代和核酸间的修饰，但不限于此。在本申请中，术语“16s rRNA”指构成原核生物核糖体的30S小亚单位的rRNA，其一方面碱基序列的大部分被高度保留，另一方面部分区域显示出高的碱基序列多样性。特别是在同种之间几乎不存在多样性而异种间显示出多样性，因此通过比较16SrRNA的序列，能够有效鉴定原核生物。

作为一个实施方式，在本发明中，上述引物可以用于扩增相应微生物中保留的16SrRNA的序列，扩增序列后，通过期望的产物的生成与否，能够检测出微生物的存在或测定微生物水平。利用引物的序列扩增方法可以使用本领域已知的多种多样的方法。例如，可以使用聚合酶链式反应(PCR)、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、多重PCR、降落(touchdown)PCR、热启动(hot start)PCR、巢式(nested)PCR、增效(booster)PCR、实时(real-time)PCR、差示PCR(differential display PCR：DD-PCR)、cDNA末端快速扩增(rapid amplificationof cDNA ends：RACE)、反向(inverse)聚合酶链式反应、载体介导(vectorette)PCR、热不对称交错PCR(TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR))、连接酶链式反应、修复链式反应、转录-介导的扩增、自主序列复制(self-sustainedsequence replication)、目标碱基序列的选择性扩增反应，但本发明的范围不限于此。

此外，在本发明中，检测出微生物或测定微生物水平的制剂可以是抗体，通过使用将抗原-抗体反应作为基础的免疫学方法，可以检测出相应微生物或测定微生物水平。作为用于此的分析方法，有蛋白质印迹、酶联免疫吸附分析(ELISA，enzyme linkedimmunosorbent asay)、放射免疫分析(RIA：Radioimmunoassay)、放射免疫扩散法(radioimmunodiffusion)、欧氏(Ouchterlony)免疫扩散法、火箭(rocket)免疫电泳、组织免疫染色、免疫沉淀分析法(Immunoprecipitationassay)、补体结合分析法(ComplementFixation Assay)、荧光活化细胞分选器(FACS，Fluorescence activated cell sorter)、蛋白芯片(protein chip)等，上述方法只是对抗体-抗原免疫反应的说明，本发明不限于上述方法。

除此之外，可以将本领域广泛使用的分子免疫学方法用于本发明的检测微生物或测定微生物水平。

本发明的优点和有益效果：本发明首次发现了原核生物Cyanobacteria与自闭症相关，其丰度在自闭症患者人群中呈现明显增高，ROC曲线分析其作为检测变量具有较高的特异性和敏感性，因此，可以将原核生物Cyanobacteria作为检测标志物应用于自闭症患者的诊断。以原核生物Cyanobacteria作为检测标志物，完全无创，准确性高。

附图说明

图1是本发明实施例1中自闭症组和对照组原核生物Cyanobacteria菌群丰度对比图；

图2是本发明实施例1中以原核生物Cyanobacteria菌群丰度作为检测变量的ROC曲线图。

具体实施方式

为了评估肠道共生菌群组成能否作为自闭症的预测因子，本发明通过收集自闭症患者和健康人的样本，进行16SrRNA测序以及使用生物信息学进行测序数据的统计，发现与疾病相关的肠道菌群，将肠道菌群与疾病信息整合，最大程度预测自闭症患者。本发明通过16SrRNA测序，首次发现了原核生物Cyanobacteria与自闭症患者的相关性，自闭症组原核生物Cyanobacteria菌群丰度明显高于对照组，说明原核生物Cyanobacteria可作为自闭症的预测因子。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

筛选与自闭症相关的肠道菌群、检测、鉴定、验证。

1、研究对象和样本收集

收集10例自闭症以及7例健康人的粪便样本。样本来源及入选标准如下：

自闭症组：来自10组家庭，年龄分布3～5岁。诊断为自闭症的患者，共10例。排除标准：①患有其他精神疾病(如精神分裂症)和其他神经发育障碍疾病；②患有遗传代谢性疾病；③患有严重神经疾病以及颅脑损伤史等重大躯体疾病史；④近1个月内有胃肠道感染病史或抗生素使用史。

对照组：来自6组家庭，共7例(其中有两例来自同一家庭，为双胞胎)。纳入标准：①身体健康，无神经发育障碍疾病；②与患者组年龄匹配。排除标准同自闭症组。

2、16S rRNA测序

2.1.DNA提取

使用基因组DNA提取试剂盒自样本中提取基因组DNA，操作步骤按说明书进行。

2.2.DNA样本纯度及浓度测定

利用1％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA。

2.3.PCR扩增

以细菌16S rRNA基因的V3～V4可变区序列为靶标，以带有barcode序列的338F-806R为引物，(或其它引物)进行PCR扩增，获取PCR产物；

2.4.16S rRNA基因测序

PCR产物经过定量及文库构建后，利用Illumina MiSeq PE300平台或者novaseqPE250进行高通量测序，获取细菌16S rRNA基因的V3～V4可变区碱基序列信息(或其它引物所对应区域碱基序列信息)；

3、数据分析

3.1.获取菌群丰度信息

利用QIIME2.0软件包，对测序片段进行OTU(分类学操作单元)聚类，OUT代表序列与silva数据库(或GREENGENES数据库)进行比对分析，获取OUT对应的分类单元(包括门纲目科属种)及其相应的丰度信息。

3.2.肠道菌群物种差异分析

使用SPSS统计软件进行菌群丰度与自闭症的Spearman相关分析，找出与自闭症具有显著相关性的菌群；同时使用SPSS统计软件的ROC曲线图工具绘制ROC曲线并计算其AUC面积。

4、结果

自闭症组原核生物Cyanobacteria菌群丰度明显增加，自闭症组的原核生物Cyanobacteria菌群丰度均值为对照组的10.2倍，菌群丰度对比情况如图1所示。

菌群丰度与自闭症相关性分析结果显示自闭症组与原核生物Cyanobacteria菌群丰度水平显著相关(P＝0.008)。分析结果见表1。

表1自闭症组与原核生物Cyanobacter ia菌群丰度相关性分析结果相关系数

**.在置信度(双测)为0.01时，相关性是显著的。

如图2所示受试者工作特性曲线(ROC曲线)分析显示，AUC为0.857，P值为0.015，具有统计学意义。最佳临界值为0.00006851，对应特异性为0.714，敏感性为1，提示将原核生物Cyanobacteria应用于自闭症的诊断具有较高的敏感性。

本领域的技术人员通过对上述实施例及本领域的公知技术能够制备检测所述微生物的特异性的探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体也可以用于自闭症的检测，在此不再一一赘述。

同时也能制备获得检测肠道菌群丰度的试剂及诊断自闭症的产品。

实施例2自闭症诊断试剂盒的制备

根据原核生物Cyanobacteria与自闭症的相关性，可以通过检测样本中原核生物Cyanobacteria的丰度来诊断自闭症，据此本发明提供了一种基于检测原核生物Cyanobacteria丰度的诊断自闭症的试剂盒。试剂盒组分如下：DNA提取试剂、特异性检测原核生物Cyanobacteria的16SrRNA的引物对，反应缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs)、Taq-聚合酶逆转录酶、DNase、RNAse抑制剂、DEPC-水、无菌水、SYBR Green荧光染料。

实施例3诊断自闭症的芯片的制备

本实施例提供诊断自闭症的芯片，所述芯片包括固相载体，以及固定在固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针特异性识别原核生物Cyanobacteria的16SrRNA。具体的操作方法为现有技术，在此不再一一赘述。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。