肠炎沙门菌外膜囊泡和制备方法及其作为禽肠炎沙门菌病亚单位疫苗的应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种肠炎沙门菌外膜囊泡和制备方法及其作为禽肠炎沙门菌病亚单位疫苗的应用。

背景技术

沙门菌是一种常见的人兽共患病病原菌，血清型众多且分布广泛，可导致人和动物的多种疾病。肠炎沙门菌属于非伤寒沙门菌血清型，宿主谱广，且是禽类中分离率最高的血清型。感染家禽后会导致严重的肠道炎症，部分免疫力低下的个体甚至会出现死亡。而成年鸡感染后会造成生殖系统损伤。人类食用了被肠炎沙门菌污染的禽制品后会引起自限性肠胃炎。

对沙门菌的预防和控制，我国的家禽养殖业主要是采用抗生素防控。随之而来的是沙门菌耐药性的增强以及多重耐药菌株的涌现。近年来，疫苗已经成为对抗沙门菌的重要手段之一。目前商品化的沙门菌疫苗主要是有减毒活疫苗和灭活疫苗，而亚单位疫苗由于其安全性好且无毒副作成为较为理想的疫苗。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种肠炎沙门菌外膜囊泡和制备方法及其作为禽肠炎沙门菌病亚单位疫苗的应用，外膜囊泡能够有效的刺激鸡体内细胞免疫应答并且对于肠炎沙门菌能提供非常好的免疫保护效果，展现出其作为亚单位疫苗的潜力，并且为肠炎沙门菌外膜囊泡的应用提供了基础。

本发明提供的技术方案如下：

一种肠炎沙门菌外膜囊泡，以体外培养肠炎沙门菌为原料制备得到肠炎沙门菌外膜囊泡。

一种肠炎沙门菌外膜囊泡的制备方法，其中包括如下步骤：

S1、体外培养肠炎沙门菌至细菌的对数生长期，然后离心、过滤、浓缩无细胞的培养上清浓缩液；

S2、对培养上清进行超速离心，得到肠炎沙门菌外膜囊泡。

如上述的制备方法，优选的，在步骤S1中，所述培养肠炎沙门菌，所用的培养基为LB液体培养基。

如上述的的制备方法，优选的，在步骤S1中，离心的具体步骤为：4℃，1000×g离心10min，弃去沉淀，所述过滤采用0.22μm的一次性滤器过滤，所述浓缩采用截留分子质量为100KDa的超滤管进行浓缩。

如上述的的制备方法，优选的，在步骤S1中，所述超滤管浓缩的步骤为：4℃，3000×g离心5min，浓缩至原体积的六分之一。

如上述的的制备方法，优选的，在步骤S2中，所述超速离心为将无细胞培养上清在4℃，39000×g超速离心1h，弃去上清，沉淀PBS缓冲液重悬；同上再次4℃，39000×g超速离心1h，弃去上清，沉淀重悬于PBS缓冲液，即为制备肠炎沙门菌外膜囊泡。

如上所述制备方法获得肠炎沙门菌外膜囊泡在制备禽肠炎沙门菌病亚单位疫苗上的应用。

一种用上述制备方法获得肠炎沙门菌外膜囊泡作为禽沙门菌病亚单位疫苗。

本发明进一步公开了本发明的肠炎沙门菌外膜囊泡研制成为禽肠炎沙门菌病亚单位疫苗的材料。

本发明还提供了一种鸡肠炎沙门菌病亚单位疫苗检测方法，采用qRT-PCR检测细胞因子的相对表达量，与未免疫的PBS组相比较。

进一步的，qRT-PCR引物如下：

有益效果：

肠炎沙门菌是一种重要的人兽共患病原菌，不仅能引发动物疾病，也能通过污染的食品传递给人类，引起人急性胃肠炎等疾病。疫苗接种是目前防控沙门菌感染的有效措施之一，外膜囊泡中包含的外膜组分可以刺激机体产生适应性免疫记忆，含有的LPS可作为自身佐剂，而且作为非复制性疫苗具一定安全性。所以这些因素导致外膜囊泡有着开发为亚单位疫苗的潜力。我们通过LB培养基培养肠炎沙门菌，经过离心、过滤、超滤以及超速离心后的到肠炎沙门菌的外膜囊泡，并以其作为亚单位疫苗接种于海兰白蛋鸡，结果发现，外膜囊泡能够有效的刺激鸡体内细胞免疫应答并且对于肠炎沙门菌能提供非常好的免疫保护效果，展现出其作为亚单位疫苗的潜力，并且为肠炎沙门菌外膜囊泡的应用提供了基础。本发明的技术方案提供了一种操作简便易行的提取沙门菌外膜囊泡的方法；本发明采用超滤管浓缩技术，超滤管浓缩比现有密度梯度离心法更方便操作，且获得较纯净的外膜囊泡提取物。

附图说明

图1为肠炎沙门菌C50041 OMV的SDS-PAGE结果；

图2为肠炎沙门菌OMV的扫描投射电镜观察结果；

图3为OMV免疫后脾脏中细胞因子表达量分析；

图4为攻毒后鸡群的存活曲线；

图5为免疫后鸡群的体重变化；

图6为攻毒后鸡群的体重变化；

图7为攻毒后细菌在鸡肝脏、脾脏、回肠和盲肠内的分布与定殖。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1肠炎沙门菌外膜囊泡的制备

1.菌株复苏：将保存于-70℃的肠炎沙门菌C50041菌株划线接种于不含抗生素的LB平板，37℃下培养12h，挑取LB平板上的单菌落接种至含有4mL的LB液体培养基中，37℃，180rpm震荡培养8h；

其中LB液体培养基为：称取酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g溶解于1000mL蒸馏水中，高压灭菌121℃，15min；LB固体培养基为在1000mlLB液体培养基中加入15g琼脂粉，高压灭菌121℃，15min，待温度降低时倒入平皿中；

2.扩大培养：将培养8h后的肠炎沙门菌菌液按1:100比例接种到400mL的LB液体中，37℃，180rpm震荡培养至OD

3.过滤浓缩：将肠炎沙门菌培养液按4℃，1000×g离心10min，利用0.22μm滤器过滤上清，然后将得到的无细胞上清用截留分子质量为100KDa的超滤管进行浓缩，4℃，4000rpm离心4min，直到体积浓缩为原体积的六分之一；

4.OMV的收集：将浓缩后的液体进行超速离心，在4℃，39000×g超速离心1h，弃去上清，沉淀用PBS缓冲液重悬；同上再次4℃，39000×g超速离心1h，弃去上清，沉淀重悬于PBS缓冲液，即为制备肠炎沙门菌外膜囊泡。

将收集的肠炎沙门菌外膜囊泡，进行乙酸双氧铀负染后，用透射电镜观察外膜囊泡形态。然后将收集到的外膜囊泡进行SDS-PAGE验证并采用BCA法计算肠炎沙门菌外膜囊泡的浓度。

如图1和图2所说OMV的主要条带在60KDa左右，在透射电子显微镜下可以观察到OMV的结构，其大小在20-200nm之间。

实施例2：肠炎沙门菌外膜囊泡的免疫学效应分析

2.1鸡细胞因子引物的合成

合成检测鸡细胞因子表达水平的探针法qRT-PCR引物。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

表1鸡细胞因子qRT-PCR引物

2.2鸡脾脏总RNA提取与cDNA合成

将100只海兰白蛋鸡随机分为2组，每组50只。设立未免疫的空白对照组。将疫苗以及PBS以肌肉注射的方式接种7日龄的海南白蛋鸡，14日龄进行加强免疫，免疫剂量为60μg/羽，分别在免疫后的7、14天采集脾脏，将组织样品浸泡在RNA保护剂中，放置于-70℃冰箱中保存。

取出-70℃冰箱中保存的组织样品，按照QIAGEN总RNA小量提取试剂盒说明书的要求提取脾脏的总RNA。每个时间点检测3份样品，利用One-drop检测总RNA的浓度。

将提取的RNA按照PrimeScript

表2：gDNA的去除体系

反应条件为：42℃，2min

表3.cDNA的合成体系

反应条件为37℃15min，85℃5s。反转录后的cDNA置于-20℃保存备用。

2.3qRT-PCR检测细胞因子

将cDNA稀释成适当浓度，以cDNA为模板，进行荧光定量PCR检测鸡脾脏中各个细胞因子的表达量。PCR反应体系如下(20μL)：

表4qRT-PCR反应体系

荧光定量PCR反应体系如下：95℃30s；95℃5s，60℃34s，共40个循环。

免疫组与未免疫组的鸡群，在免疫后的7、14天取出脾脏组织，qRT-PCR检测细胞因子的相对表达量，并与未免疫的PBS组相比较。图3显示了在免疫后的两周内，IL-4表达量上调，14天后免疫组的表达量显著高于对照组(P＜0.01)表明体液免疫应答增强。IL-6在免疫初期差异不大(P＞0.05)，而在免疫14天后，表达量显著上升(P＜0.001)。IL-6发挥持续抗感染的作用能够有效促进抗体分泌。免疫组的IFN-γ表达量显著高于对照组(P＜0.001)，表明细胞免疫应答增加，有利于清除沙门菌这类胞内寄生菌。而IL-1β在免疫初期表达量高，14天后表达量下降明显。

实施例3：肠炎沙门菌外膜囊泡的免疫保护力评价

挑取CZ14-1单菌落接种到含有4mL的LB液体培养基中，37℃，180rpm震荡培养12h，然后将按1:100比例接种到400mL的LB液中，37℃，180rpm培养8h，将细菌用无菌PBS洗3遍，调整菌浓度为2×10

将100只海兰白蛋鸡随机分为2组，每组55只。设立未免疫的空白对照组。将每组进一步划分为观察组20只和剖检组35只，将疫苗以及PBS以肌肉注射的方式接种7日龄的海南白蛋鸡，14日龄进行加强免疫，免疫剂量为60μg/羽。免疫后连续3周内对每组鸡群的体重变化进行测定。加强免疫后1周对鸡群进行攻毒实验，以肌肉注射的方式接种野生株CZ14-1，剂量为2×10

攻毒后鸡的存活曲线如图4所示，PBS对照组从攻毒第2天出现死亡并且持续出现死亡，而免疫组仅在第6天出现一只死亡，且存活率达95％，PBS组攻毒后死亡率达70％，表明OMV作为亚单位疫苗对肠炎沙门菌的攻击能提供良好的免疫保护率(表5)。

表5.OMV的免疫保护效力

通过测定两组的体重变化，评价OMV免疫对鸡生长能力的影响。如图5和图6所示，对比未免疫的鸡群体重，免疫组鸡的生长没有显著变化，且攻毒后免疫组鸡群体重在7、10、13天明显高于未免疫组。

攻毒后细菌在体内定殖的实验结果如图7所示，攻毒后第一天PBS组肝脏中载菌量明显大于OMV组，且与3天后达到最大值，但是OMV免疫组在第三天就仅有一只能分到菌，7天后细菌在肝脏中完全清除。OMV免疫组在攻毒第3天和第7天，脾脏中细菌数显著低于PBS组。在回肠中第三天PBS组中细菌数量达到最大值，而OMV免疫组的载菌量在第3、7天显著低于PBS组，且在第14天细菌完全从回肠中清除。在盲肠中OMV免疫组在第7天与PBS组相比，细菌数量少，且有显著差异。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 肠炎沙门菌外膜囊泡和制备方法及其作为禽肠炎沙门菌病亚单位疫苗的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtgaagaagg tgaaagatat catgga 26

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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