双重竞争检测方法及产品

技术领域

本发明涉及免疫检测领域，具体而言，涉及检测方法及产品。

背景技术

受体配体结合是实现信号传导的通道之一，受体能够识别和特异性结合配体。以病原体入侵宿主细胞为例，病原体表面的配体能够与宿主细胞上的受体结合，打开侵染宿主细胞的大门。

2019年，新冠病毒在全球肆虐。截止北京时间2021年1月9日，全球累计感染新冠(COVID-19)病例超过8000万，死亡病例超过190万，目前仍然处于大流行阶段。国内散点突发事件频发，疫苗快速批准上市显得格外迫切。目前已有部分疫苗在全球范围内获得紧急使用授权或附加条件上市。

但是面对全新的病毒，相关的基础研究较多机制研究不透彻的背景下，大量的疫苗设计快速进入临床，在疫苗的有效性、保护周期、质量控制、可及性上仍在有较多的内容需要进一步研究。

国内第一批疫苗主要为灭活疫苗，然而灭活疫苗采用的BPL灭活，Spike蛋白存在较高比例的融合后构象以及RBD“down”构象，在初步的免疫人群分析中，发现总抗体水平应答相对较低且中和抗体滴度不高的迹象。

另外，从现有的新冠基础研究来看，并非所有个体感染新冠之后会产生足够滴度的中和抗体，存在二次感染风险。中和抗体滴度在1个月达到峰值后会逐步下降，少部分低滴度康复者会降至检测限以下。参考其他冠状病毒，新冠抗体存在的时间可能在1-2年左右，并不能形成长效保护。

SARS-CoV-2的中和抗体可以通过阻断或抑制SARS-CoV-2与宿主细胞之间的相互作用来有效的控制感染。其中研究最为透彻的机制为SARS-CoV-2刺突Spike蛋白S1亚基上的受体结合区(Receptor Binding Domain,RBD)和宿主细胞受体ACE2的相互作用及后续的构象转变及膜融合。ACE2又称ACEH，名为血管紧张素转化酶2，是一种金属蛋白酶，全长805个氨基酸，是具有单一胞外催化结构域的I型跨膜糖蛋白。

目前研究也分离到很多新的中和抗体，例如结合SARS-CoV-2刺突Spike蛋白RBD但不竞争ACE2的中和抗体，以及结合S1亚基NTD区域的中和抗体。

目前部分疫苗显示出免疫后中和抗体阳转率和滴度偏低的迹象。此外，SARS-CoV-2作为RNA病毒，变异频率非常高，恢复期血清和疫苗的中和效果对部分突变显示出更低的中和能力，这部分突变的积累可能导致免疫逃逸的发生。因此对中和抗体检测的灵敏度和敏感性提出了更高的要求。

现有的产品主要通过RBD-ACE2竞争法检测阻断RBD-ACE2相互作用的中和抗体，对非竞争ACE2的RBD中和抗体以及NTD中和抗体等无法检测。

为此，提出本发明。

发明内容

本发明提供了以下至少一种实施方式：

在一些实施方式中，本发明涉及检测方法，包括步骤：

(1)样品与含配体的片段、试剂1、试剂2接触；

试剂1：包括所述配体的受体和/或结合所述配体的第一抗体；其中，所述第一抗体与所述受体发生竞争；

试剂2：包括结合所述配体的第二抗体，其中，所述第二抗体不与所述受体发生竞争；

其中，所述试剂1或试剂2中的一种连接有标记物，另一种固定于固相载体；

(2)检测信号。

在一些实施方式中，所述接触方式包括以下任意一种：

(a)样品同时与含配体的片段、试剂1、试剂2接触；

(b)样品先与含配体的片段、试剂1接触，再与试剂2接触；

(c)样品先与含配体的片段、试剂2接触，再与试剂1接触；

(d)样品先与含配体的片段接触，再与试剂1、试剂2接触；

(e)样品先与含配体的片段接触，再与试剂1接触，再与试剂2接触；

(f)样品先与含配体的片段接触，再与试剂2接触，再与试剂1接触。

在一些实施方式中，检测方法，包括步骤：

(1)样品与含第一配体和第二配体的片段、试剂A、试剂B接触；

试剂A：包括A1试剂和/或A2试剂；其中A1试剂包括所述第一配体的受体和/或结合所述第一配体的第三抗体；其中，所述第三抗体与所述第一配体的受体发生竞争；A2试剂包括结合所述第一配体的第四抗体，其中，所述第四抗体不与所述第一配体的受体发生竞争；

试剂B：包括B1试剂和/或B2试剂；其中B1试剂包括所述第二配体的受体和/或结合所述第二配体的第五抗体；其中，所述第五抗体与所述第二配体的受体发生竞争；B2试剂包括结合所述第二配体的第六抗体，其中，所述第六抗体不与所述第二配体的受体发生竞争；

其中，所述试剂A或试剂B中的一种连接有标记物，另一种固定于固相载体；试剂A与试剂B不同；

(2)检测信号。

在一些实施方式中，所述接触方式包括以下任意一种：

(a)样品同时与含第一配体和第二配体的片段、试剂A、试剂B接触；

(b)样品先与含第一配体和第二配体的片段、试剂A接触，再与试剂B接触；

(c)样品先与含第一配体和第二配体的片段、试剂B接触，再与试剂A接触；

(d)样品先与含第一配体和第二配体的片段接触，再与试剂A、试剂B接触；

(e)样品先与含第一配体和第二配体的片段接触，再与试剂A接触，再与试剂B接触；

(f)样品先与含第一配体和第二配体的片段接触，再与试剂B接触，再与试剂A接触。

在一些实施方式中，所述抗体为中和抗体。

在一些实施方式中，所述配体为病原体入侵宿主细胞的配体。

在一些实施方式中，所述病原体为冠状病毒。

在一些实施方式中，所述冠状病毒为SARS-CoV-2。

在一些实施方式中，所述配体选自RBD、NTD。

在一些实施方式中，所述配体选自SARS-CoV-2S蛋白的RBD、SARS-CoV-2S蛋白的NTD。

在一些实施方式中，所述受体为ACE2。

在一些实施方式中，所述检测方法用于检测样品中是否存在中和抗体。

在一些实施方式中，本发明还涉及检测组件，包括：

(a)以上任一实施方式所述的含配体的片段；

(b)以上任一实施方式所述的试剂1；

(c)以上任一实施方式所述的试剂2。

在一些实施方式中，检测组件，包括：

(a)以上任一实施方式所述的含第一配体和第二配体的片段；

(b)以上任一实施方式所述的试剂A；

(c)以上任一实施方式所述的试剂B。

在一些实施方式中，本发明还涉及以上任一实施方式所述的检测方法，或以上任一实施方式所述的检测组件在抗体检测或制备抗体检测试剂中的应用。

附图说明

图1：本发明原理图，以实施例2为例陈述，图中M表示固相载体，NTD-NAb表示NTD中和抗体，RBD-NAb表示RBD中和抗体。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

本文中，“配体”可理解为能够与受体结合的任何蛋白或多肽。“受体”可理解为能够识别并特异性结合配体的分子，配体受体结合能够实现信号传导，受体可以包括辅助性受体。常见的细胞表面受体包括但不限于G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、鸟苷酸环化酶偶联受体、离子通道、黏附受体等。配体与受体结合的难易度与结合后的强度叫做亲和力。两者越容易结合，结合后结合的强度越大，则亲和力越强，反之亦然。

本文中，“抗体”不同于“受体”，抗体可理解为免疫细胞分泌免疫物质，被用于鉴别和/或中和抗原类物质。“中和抗体”是一种用于防止细胞被某种抗原或感染源侵害的抗体。

本文中，“样品”可理解为可能含有抗体的任何样品，在一些实施方式中，样品来自于感染或主动免疫后的样品；在一些实施方式中，样品选自体液、排泄物、细胞；例如血清、血浆、全血、淋巴液、脑脊液、组织液、唾液、尿液、淋巴细胞等，但不限于此。

本文中，“标记物”可理解为能够直接产生信号；或直接或间接促发特定物质产生信号，标记物可直接或间接连接至被标记物上。例如通常用于免疫检测的标记物，包括金属粒子、荧光标记物、发色团标记物、电子致密标记物、化学发光标记物、电化学发光标记物、放射性标记物、核酸标记物、多肽标记物或酶，但不限于此。在一些实施方式中，标记物可以是胶体金、荧光素、荧光微球、吖啶酯、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、胶乳微球、三联钌、鲁米诺类、Eu螯合物。

本文中，“固相载体”可理解为能够与被固定物(如蛋白、多肽)直接或间接固定，例如通常用于免疫检测的固相载体，包括塑料、微粒或膜载体。塑料例如可以是聚苯乙烯；微粒例如可以是磁微粒、微球；膜载体例如可以是硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜或尼龙膜。

本文中，“检测信号”可理解为采取能够识别标记物的方式，获取或识别检测信号强弱或水平。

本文中，“含配体的片段”、“含第一配体和第二配体的片段”可理解为包含相应配体序列的蛋白或多肽。

本文中，“接触”可理解为允许其发生结合。接触时间不作具体限定，不同的实施方式和检测平台，接触时间有所差异，但属于本领域技术人员可以理解的范畴。

本文中，“试剂”可以理解为物质或产品等，不限其形式或状态，可以是液态也可以是固态。

本发明在抗体检测，尤其是中和抗体检测上，具有更高的灵敏度和/或检出率，检测结果覆盖更全的中和抗体。本发明具有通用性，不限于特定的免疫检测平台，不限于特定物种。

在一些实施方式中，本发明涉及检测方法，包括步骤：

(1)样品与含配体的片段、试剂1、试剂2接触；

试剂1：包括所述配体的受体和/或结合所述配体的第一抗体；其中，所述第一抗体与所述受体发生竞争；试剂2：包括结合所述配体的第二抗体，其中，所述第二抗体不与所述受体发生竞争；其中，所述试剂1或试剂2中的一种连接有标记物，另一种固定于固相载体；

(2)检测信号。

在一些实施方式中，所述接触方式包括：样品同时与含配体的片段、试剂1、试剂2接触；在一些实施方式中，所述接触方式包括：样品先与含配体的片段、试剂1接触，再与试剂2接触；在一些实施方式中，所述接触方式包括：样品先与含配体的片段、试剂2接触，再与试剂1接触；在一些实施方式中，所述接触方式包括：样品先与含配体的片段接触，再与试剂1、试剂2接触；在一些实施方式中，所述接触方式包括：样品先与含配体的片段接触，再与试剂1接触，再与试剂2接触；在一些实施方式中，所述接触方式包括：样品先与含配体的片段接触，再与试剂2接触，再与试剂1接触。

在一些实施方式中，试剂1包括所述配体的受体，试剂2包括结合所述配体的第二抗体；其中，试剂1中的受体连接有标记物，试剂2中的第二抗体固定于固相载体，或，试剂1中的受体固定于固相载体，试剂2中的第二抗体连接有标记物。在一些实施方式中，试剂1包括结合所述配体的第一抗体，试剂2包括结合所述配体的第二抗体；其中，试剂1中的第一抗体连接有标记物，试剂2中的第二抗体固定于固相载体，或，试剂1中的第一抗体固定于固相载体，试剂2中的第二抗体连接有标记物。在一些实施方式中，试剂1包括所述配体的受体和结合所述配体的第一抗体，试剂2包括结合所述配体的第二抗体；其中，试剂1中的受体和第一抗体均连接有标记物，试剂2中的第二抗体固定于固相载体，或，试剂1中的受体和第一抗体均固定于固相载体，试剂2中的第二抗体连接有标记物。

在一些实施方式中，检测方法，包括步骤：

(1)样品与含第一配体和第二配体的片段、试剂A、试剂B接触；

试剂A：包括A1试剂和/或A2试剂；其中A1试剂包括所述第一配体的受体和/或结合所述第一配体的第三抗体；其中，所述第三抗体与所述第一配体的受体发生竞争；A2试剂包括结合所述第一配体的第四抗体，其中，所述第四抗体不与所述第一配体的受体发生竞争；

试剂B：包括B1试剂和/或B2试剂；其中B1试剂包括所述第二配体的受体和/或结合所述第二配体的第五抗体；其中，所述第五抗体与所述第二配体的受体发生竞争；B2试剂包括结合所述第二配体的第六抗体，其中，所述第六抗体不与所述第二配体的受体发生竞争；

其中，所述试剂A或试剂B中的一种连接有标记物，另一种固定于固相载体；试剂A与试剂B不同；

(2)检测信号。

在一些实施方式中，所述接触方式包括：样品同时与含第一配体和第二配体的片段、试剂A、试剂B接触；在一些实施方式中，所述接触方式包括：样品先与含第一配体和第二配体的片段、试剂A接触，再与试剂B接触；在一些实施方式中，所述接触方式包括：样品先与含第一配体和第二配体的片段、试剂B接触，再与试剂A接触；在一些实施方式中，所述接触方式包括：样品先与含第一配体和第二配体的片段接触，再与试剂A、试剂B接触；在一些实施方式中，所述接触方式包括：样品先与含第一配体和第二配体的片段接触，再与试剂A接触，再与试剂B接触；在一些实施方式中，所述接触方式包括：样品先与含第一配体和第二配体的片段接触，再与试剂B接触，再与试剂A接触。在一些实施方式中，以此类推，当引入更多配体，例如引入第三配体时，本领域技术人员应当理解其方法或试剂中依然包括以上步骤或试剂。例如针对第三配体的试剂可以引入A试剂或B试剂中。

在一些实施方式中，含第一配体和第二配体的片段，可以采用重组或聚合的方式获得，例如采用重组的方式将第一配体和第二配体串联表达。在一些实施方式中，也可以采用含第一配体的片段与含第二配体的片段聚合，可以通过物理或化学的方式进行聚合，使其一个分子包含多个配体结构。

在一些实施方式中，所述抗体为中和抗体。

在一些实施方式中，所述配体为病原体入侵宿主细胞的配体。在一些实施方式中，所述病原体为冠状病毒。其中，常见的感染人的冠状病毒包括HCoV-229E、HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、MERS-CoV或SARS-CoV-2。在一些实施方式中，所述冠状病毒为SARS-CoV-2。所述SARS-CoV-2包括SARS-CoV-2野生株及其变异株。本文中“病原体”可理解为可造成人或动植物感染疾病的微生物(包括细菌、病毒、立克次氏体、真菌等)、寄生虫或其他媒介(例如微生物重组体包括杂交体或突变体)。

在一些实施方式中，所述配体选自RBD、NTD。其中，RBD为受体结合区(ReceptorBinding Domain)，其包括RBD及其核心区域，只要能实现其结合受体的功能，仍然应当理解为本发明所述的RBD。NTD为N末端结构域(Nterminal domain)。在一些实施方式中，所述配体选自SARS-CoV-2S蛋白的RBD、SARS-CoV-2S蛋白的NTD。在一些实施方式中，含SARS-CoV-2S蛋白RBD的片段可以是S蛋白及其涵盖RBD的片段，例如S蛋白参考Gene ID:43740568。在一些实施方式中，SARS-CoV-2S蛋白的RBD的序列可参考文献Wrapp Daniel,WangNianshuang,Corbett Kizzmekia S,et al.Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spikein the prefusion conformation、以及与其序列一致性至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列，且这些氨基酸序列仍具有配体结合受体和/或抗体的功能。在一些实施方式中，含配体的片段可以是SARS-CoV-2S蛋白的RBD、S1蛋白或S蛋白。在一些实施方式中，SARS-CoV-2S蛋白的NTD的序列可参考文献A neutralizing human antibody binds to the N-terminal domain of the spikeprotein of SARS-CoV-2，以及与其序列一致性至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列，且这些氨基酸序列仍具有配体结合受体和/或抗体的功能。在一些实施方式中，含SARS-CoV-2S蛋白NTD和RBD的片段可以是S1蛋白或S蛋白。

在一些实施方式中，所述受体选自ACE2(Angiotensin I Converting Enzyme 2)、HDL(高密度脂蛋白)、HS(Heparan Sulphate)、SR-B1(Scavenger Receptor Class BMember 1)、APN(Aminopeptidase N)、DPP4(Dipeptidyl Peptidase 4)、AGO4(Argonaute4)、IFITM3(Interferon Induced Transmembrane Protein 3)、EGFR(Epidermal GrowthFactor Receptor)、ICAM1(Intercellular Adhesion Molecule 1)、HSPA1B(Heat ShockProtein Family A(Hsp70)Member 1B)、ITGB6(Integrin Subunit Beta 6)、WWTR1(WWDomain Containing Transcription Regulator 1)、ALDH1A1(Aldehyde Dehydrogenase1Family Member A1)、RUNX3(RUNX Family Transcription Factor 3)、NRP1(Neuropilin1)。在一些实施方式中，所述受体为ACE2。在一些实施方式中，人ACE2的序列可参考GeneID:59272，以及与其序列一致性至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列，且这些氨基酸序列仍具有受体结合配体的功能。

在一些实施方式中，所述检测方法用于检测样品中是否存在中和抗体。在一些实施方式中，检测中和抗体的方法，包括步骤：(1)样品与含RBD的片段、ACE2、不与ACE2发生竞争的RBD中和抗体接触，其中ACE2连接有标记物，不与ACE2发生竞争的RBD中和抗体固定于固相载体，(2)检测信号。在一些实施方式中，检测中和抗体的方法，包括步骤：(1)样品与含RBD的片段、与ACE2发生竞争的RBD中和抗体、不与ACE2发生竞争的RBD中和抗体接触，其中与ACE2发生竞争的RBD抗体固定于固相载体，不与ACE2发生竞争的RBD抗体连接有标记物，(2)检测信号。在一些实施方式中，检测中和抗体的方法，包括步骤：(1)样品与含RBD和NTD的片段(例如S1片段或S片段)、ACE2、与NTD的受体发生竞争的NTD中和抗体接触，其中ACE2连接有标记物，与NTD的受体发生竞争的NTD抗体固定于固相载体，(2)检测信号。在一些实施方式中，检测中和抗体的方法，包括步骤：(1)样品与含RBD和NTD的片段(例如S1片段或S片段)、ACE2、与NTD的受体发生竞争的NTD中和抗体、不与ACE2发生竞争的RBD中和抗体接触，其中ACE2连接有标记物，与NTD的受体发生竞争的NTD抗体和不与ACE2发生竞争的RBD中和抗体分别固定于固相载体，(2)检测信号。

在一些实施方式中，本发明还涉及检测组件，包括：

(a)以上任一实施方式所述的含配体的片段；

(b)以上任一实施方式所述的试剂1；

(c)以上任一实施方式所述的试剂2。

在一些实施方式中，检测组件，包括：

(a)以上任一实施方式所述的含第一配体和第二配体的片段；

(b)以上任一实施方式所述的试剂A；

(c)以上任一实施方式所述的试剂B。

本文中“组件”可理解为任何免疫产品形式，例如试剂盒、层析试纸、试剂卡、芯片等免疫产品常规形式。

本发明还涉及以上任一实施方式所述的检测方法，或以上任一实施方式所述的检测组件在抗体检测或制备抗体检测试剂中的应用。

以本发明实施例2为例，陈述本发明方案的原理(可参见图1)。本领域技术人员应当理解，其扩展的方案仍在原理范围内，属于本发明的构思。将S1蛋白与阳性样品接触，S1蛋白与样品中的多种抗体反应，例如包括NTD的总抗体和中和抗体，RBD的总抗体和中和抗体，以及其他总抗体和中和抗体，进一步与试剂中的NTD中和抗体接触，与样品中NTD的中和抗体水平产生等效竞争关系，进一步与试剂中的ACE2接触，与样品中的RBD中和抗体水平产生等效竞争关系，最终产生信号，从而实现双中和表位的加成竞争，识别样品中的NTD中和抗体水平和RBD中和抗体水平的总和，相比传统方法，本发明方案可以实现中和抗体更全面地检出。

以本发明实施例1为例，陈述本发明方案的原理。将RBD蛋白与阳性样品接触，RBD蛋白与样品中的多种抗体反应，例如包括RBD的总抗体、竞争ACE2的RBD中和抗体，非竞争ACE2的RBD中和抗体，进一步与试剂中的非竞争ACE2的RBD中和抗体接触，与样品中的非竞争ACE2的RBD中和抗体产生等效竞争关系，进一步与ACE2接触，与样品中的竞争ACE2的RBD中和抗体水平产生等效竞争关系，最终产生信号，从而实现双重竞争，检全RBD中和抗体，相比传统方法，本发明方案可以实现中和抗体更全面地检出。

本发明的第一、第二、……、试剂1、试剂2等数字描述并无顺序限定的意思，只是为了便于描述所设置。

本申请的各方面和实施方式将参照附图和以下实施例进行讨论。其他方面和实施方式对于本领域技术人员是清楚的。尽管本申请已经结合示例性实施方式进行了描述，很多等同修改和变化在给出本申请时对于本领域技术人员是清楚的。因而，本申请的示例性实施方式是示例性的，非限制性的。可以对所述实施方式做出多种变化，而不脱离本申请的宗旨和范围。

实施例1

1、磁微粒固定

将1μm磁微粒和pH 5.0的0.1M MES缓冲液混合，混匀，放置于磁分离器上，直至上清无浑浊，弃上清，留取磁颗粒；接着在磁颗粒中加入MES缓冲液将磁珠充分悬起，按上述方法再进行分离并重悬；取洗涤好的磁颗粒，加入10mg/ml碳二亚胺(EDAC)在25℃反应30min，置于血液混匀仪上，中速混匀；加入不与ACE2发生竞争的RBD中和抗体(编号S452，可采用单细胞PCR技术从SARS-CoV-2感染者恢复后的外周血中筛选获得，可购自广东菲鹏生物有限公司)，在25℃避光反应3h，得到包被产物；加入淬灭缓冲液(10mM PBS、1g/100ml BSA、40mM甘氨酸，pH为7.4)在25℃避光反应1h以终止封闭反应，收集固定于磁微粒的S452。

2、连接吖啶标记物

取人ACE2(购自广东菲鹏生物有限公司，编号Ag2)，超滤离心，置换为pH 5.0的0.1M MES缓冲液，离心，然后加入吖啶酯，混匀后进行标记，37℃标记4h；标记反应结束后，加入封闭缓冲液(pH 8.0的10％BSA缓冲液为封闭缓冲液)，封闭1h；封闭后超滤离心，除去未偶联的吖啶酯，收集ACE2吖啶标记物。

3、检测

取50μL样本与50μL SARS-COV-2S蛋白RBD(40ng/ml，购自广东菲鹏生物有限公司，编号Ag27)37℃反应30min，再加入固定于磁微粒的S4520.25mg/mL和ACE2吖啶标记物1μg/mL，37℃反应15min，最后对反应体系进行清洗，测量发光信号。结果计算：抑制率＝1-样本检测信号/阴性质控品检测信号。

实施例2

1、磁微粒固定

将1μm磁微粒和pH 5.0的0.1M MES缓冲液混合，混匀，放置于磁分离器上，直至上清无浑浊，弃上清，留取磁颗粒；接着在磁颗粒中加入MES缓冲液将磁珠充分悬起，按上述方法再进行分离并重悬；取洗涤好的磁颗粒，加入10mg/ml碳二亚胺(EDAC)在25℃反应30min，置于血液混匀仪上，中速混匀；加入NTD中和抗体(编号3F6)，在25℃避光反应3h，得到包被产物；加入淬灭缓冲液(10mM PBS、1g/100ml BSA、40mM甘氨酸，pH为7.4)在25℃避光反应1h以终止封闭反应，收集固定于磁微粒的3F6。其中，NTD中和抗体可采用单细胞PCR技术从SARS-CoV-2感染者恢复后的外周血中筛选获得，可购自广东菲鹏生物有限公司，也可参考GenBank:MT712309.1(L链)和GenBank:MT712296.1(H链)的序列制备。

2、连接吖啶标记物

取人ACE2(编号Ag2)，超滤离心，置换为pH 5.0的0.1M MES缓冲液，离心，然后加入吖啶酯，混匀后进行标记，37℃标记4h；标记反应结束后，加入封闭缓冲液(pH 8.0的10％BSA缓冲液为封闭缓冲液)，封闭1h；封闭后超滤离心，除去未偶联的吖啶酯，收集ACE2吖啶标记物。

3、检测

取50μL样本与50μL SARS-COV-2S1蛋白(40ng/ml，购自广东菲鹏生物有限公司，Ag40)37℃反应30min，再加入固定于磁微粒的3F6 0.25mg/mL和ACE2吖啶标记物1μg/mL，37℃反应15min，最后对反应体系进行清洗，测量发光信号。结果计算：抑制率＝1-样本检测信号/阴性质控品检测信号。

实施例3

1、磁微粒固定

将1μm磁微粒和pH 5.0的0.1M MES缓冲液混合，混匀，放置于磁分离器上，直至上清无浑浊，弃上清，留取磁颗粒；接着在磁颗粒中加入MES缓冲液将磁珠充分悬起，按上述方法再进行分离并重悬；取洗涤好的磁颗粒，加入10mg/ml碳二亚胺(EDAC)在25℃反应30min，置于血液混匀仪上，中速混匀；加入等摩尔比的NTD中和抗体(编号3F6)和不与ACE2发生竞争的RBD中和抗体(编号S452)，在25℃避光反应3h，得到包被产物；加入淬灭缓冲液(10mMPBS、1g/100ml BSA、40mM甘氨酸，pH为7.4)在25℃避光反应1h以终止封闭反应，收集固定于磁微粒的S452和3F6。

2、连接吖啶标记物

取人ACE2(购自广东菲鹏生物有限公司，编号Ag2)，超滤离心，置换为pH 5.0的0.1M MES缓冲液，离心，然后加入吖啶酯，混匀后进行标记，37℃标记4h；标记反应结束后，加入封闭缓冲液(pH 8.0的10％BSA缓冲液为封闭缓冲液)，封闭1h；封闭后超滤离心，除去未偶联的吖啶酯，收集ACE2吖啶标记物。

3、检测

取50μL样本与50μL SARS-COV-2S1蛋白(40ng/ml，Ag40)37℃反应30min，再加入固定于磁微粒的S452和3F6 0.25mg/mL和ACE2吖啶标记物1μg/mL，37℃反应15min，最后对反应体系进行清洗，测量发光信号。结果计算：抑制率＝1-样本检测信号/阴性质控品检测信号。

实施例4

1、磁微粒固定

将磁微粒洗涤，重悬于MES缓冲液中，加入碳二亚胺(EDAC)反应，置于血液混匀仪上中速混匀；加入人ACE2(购自广东菲鹏生物有限公司)，室温避光反应，得到包被产物；加入淬灭缓冲液在室温避光反应以终止封闭反应，收集固定于磁微粒的ACE2。

2、连接吖啶标记物

取NTD中和抗体3F6重悬于MES缓冲液中，然后加入吖啶酯，混匀后进行标记，标记反应结束后，加入10％BSA封闭；离心，除去未偶联的吖啶酯，收集3F6吖啶标记物。

3、检测

取样本与SARS-COV-2S1蛋白Ag40在37℃下反应，再与3F6吖啶标记物在37℃反应，再与固定于磁微粒的ACE2在37℃下反应，最后对反应体系进行清洗，测量发光信号。结果计算：抑制率＝1-样本检测信号/阴性质控品检测信号。

经检测评估，实施例4与实施例2检测抑制率基本相当，同样可以检出NTD中和抗体和RBD中和抗体，并且具有提高灵敏度的效果。

实施例5

本实施例与实施例1的区别在于检测：取50μL样本与50μL SARS-COV-2S蛋白RBD(40ng/ml，购自广东菲鹏生物有限公司，编号Ag27)和固定于磁微粒的S452 0.25mg/mL 37℃反应30min，再加入ACE2吖啶标记物1μg/mL，37℃反应15min，最后对反应体系进行清洗，测量发光信号。结果计算：抑制率＝1-样本检测信号/阴性质控品检测信号。

经检测评估，实施例5与实施例1检测抑制率基本相当，同样可以检出非竞争ACE2的RBD中和抗体，并且具有提高灵敏度的效果。

实施例6

1.胶体金的制备

胶体金溶液通过如下方法制备：向煮沸的纯化水中添加终浓度为万分之四的1％氯金酸溶液，继续煮沸3min，加0.1M的柠檬酸钠(按每100ml氯金酸溶液中添加580μl的量)，继续搅拌加热10min，冷却至室温，即制备出胶体金溶液，2-8℃保存备用。

2.胶体金标记

采用人ACE2蛋白Ag2，其连接胶体金的步骤如下：向胶体金溶液中添加K

3.结合垫的制备

将连接了胶体金的Ag2溶液按照10％稀释比例稀释，并铺匀在玻璃纤维上，放置于37℃干燥房干燥过夜，得结合垫。

4.反应膜制备

T线包被：NTD中和抗体3F6稀释至1.0mg/ml，使用喷金滑膜仪包被于硝酸纤维素膜上，放置于37℃烘箱干燥2h以上，得反应膜。

5.样品垫处理

用1XPBST将SARS-COV-2S蛋白(购自广东菲鹏生物有限公司)稀释到1ug/ml，铺在样品垫上，37度烘干1h待用。

6.组装

将上述样品垫、结合垫、反应膜、吸水垫依次搭接组装于底板上，裁切成2.7mm，制成相应的层析组件。

7.检测

将待测样本加载到样品垫上。

实施例7

1.胶体金的制备

胶体金溶液通过如下方法制备：向煮沸的纯化水中添加终浓度为万分之四的1％氯金酸溶液，继续煮沸3min，加0.1M的柠檬酸钠(按每100ml氯金酸溶液中添加580μl的量)，继续搅拌加热10min，冷却至室温，即制备出胶体金溶液，2-8℃保存备用。

2.胶体金标记

采用RBD中和抗体S452，其连接胶体金的步骤如下：向胶体金溶液中添加K2CO3，向调好pH的溶液中添加S452，偶联5min，向其中添加10％的BSA终止偶联反应；离心之后弃上清，沉淀复溶后2-8℃保存备用。

3.结合垫的制备

将连接了胶体金的S452溶液按照10％稀释比例稀释，并铺匀在玻璃纤维上，放置于37℃干燥房干燥过夜，得结合垫。

4.反应膜制备

T线包被：人ACE2蛋白Ag2稀释至1.0mg/ml，使用喷金滑膜仪包被于硝酸纤维素膜上，放置于37℃烘箱干燥2h以上，得反应膜。

5.组装

将上述样品垫、结合垫、反应膜、吸水垫依次搭接组装于底板上，裁切成2.7mm，制成相应的层析组件。

6.检测

将待测样本与SARS-COV-2S蛋白(购自广东菲鹏生物有限公司)预混合，加载到样品垫上。

经检测评估，实施例6和实施例7均优于对比例2，能够检出更全面地检出中和抗体，而对比例2无法检出非竞争ACE2的RBD中和抗体和NTD中和抗体，并且实施例方案具有更高的灵敏度。

实施例8

本实施例与实施例1的区别在于检测：取50μL样本同时与RBD蛋白Ag27、固定于磁微粒的S452、ACE2吖啶标记物在37℃反应，最后对反应体系进行清洗，测量发光信号。结果计算：抑制率＝1-样本检测信号/阴性质控品检测信号。

经检测评估，实施例8与实施例1检测抑制率基本相当，也同样可以检出非竞争ACE2的RBD中和抗体，并且具有提高灵敏度的效果。

对比例1

1、磁微粒固定

将1μm磁微粒和pH 5.0的0.1M MES缓冲液混合，混匀，放置于磁分离器上，直至上清无浑浊，弃上清，留取磁颗粒；接着在磁颗粒中加入MES缓冲液将磁珠充分悬起，按上述方法再进行分离并重悬；取洗涤好的磁颗粒，加入10mg/ml碳二亚胺(EDAC)在25℃反应30min，置于血液混匀仪上，中速混匀；加入人ACE2(编号Ag2)，在25℃避光反应3h，得到包被产物；加入淬灭缓冲液(10mM PBS、1g/100ml BSA、40mM甘氨酸，pH为7.4)在25℃避光反应1h以终止封闭反应，收集固定于磁微粒的ACE2。

2、连接吖啶标记物

取SARS-COV-2S蛋白RBD(编号Ag27)，超滤离心，置换为pH 5.0的0.1M MES缓冲液，离心，然后加入吖啶酯，混匀后进行标记，37℃标记4h；标记反应结束后，加入封闭缓冲液(pH 8.0的10％BSA缓冲液为封闭缓冲液)，封闭1h；封闭后超滤离心，除去未偶联的吖啶酯，收集RBD吖啶标记物。

3、检测

取50μL样本和50μL RBD吖啶标记物(40ng/ml)37℃反应15min，再加入固定于磁微粒的ACE2 0.25mg/mL，37℃反应15min，最后对反应体系进行清洗，测量发光信号。结果计算：抑制率＝1-样本检测信号/阴性质控品检测信号。

对比例2

1.胶体金标记

胶体金制备同实施例1。对RBD抗原(编号Ag26，来自广东菲鹏生物有限公司)标金，向胶体金溶液中添加K

2.结合垫的制备

将连接了胶体金的Ag26溶液按照10％稀释比例稀释，并铺匀在玻璃纤维上，放置于37℃干燥房干燥过夜，得结合垫。

3.反应膜制备

T线包被：人ACE2蛋白Ag2稀释至0.8mg/mL，使用喷金滑膜仪包被于硝酸纤维素膜上，放置于37℃烘箱干燥2h以上，得反应膜。

4.组装

将上述样品垫、结合垫、反应膜、吸水垫依次搭接组装于底板上，裁切成2.7mm，制成相应的层析组件。

5.检测

将待测样本加载到样品垫上。

为了便于理解本发明，展示部分实验结果如下：

实验例1

采用质控品(作为阴性样品)、S452模拟样品中非竞争ACE2的中和抗体，RBD中和抗体(广东菲鹏生物有限公司，编号G3)模拟样品中竞争ACE2的中和抗体，以上质控及模拟抗体通过假病毒中和试验进行定标。假病毒中和试验方法参考文献Protocol and Reagentsfor Pseudotyping Lentiviral Particles with SARS-CoV-2 Spike Protein forNeutralization Assays。

采用实施例1和对比例1的方法和试剂分别进行检测，结果如下表所示：

试验数据显示，对比例1仅能够检出阻断ACE2结合的中和抗体G3，而本发明方案能够和假病毒类似，能同时检出RBD上非竞争ACE2结合的中和抗体S452，提示能够检测更多的中和抗体。此外，相较于对比例1，本发明方案对与阻断型的中和抗体G3的检测抑制率由25.9％提升到47.6％，对G3和S452的混合样本检测抑制率由26.8％提升到68.4％，提示了更高的检测灵敏度。

实验例2

采用质控品(作为阴性样品)、3F6模拟样品中NTD中和抗体，G3模拟样品中竞争ACE2的中和抗体，以上质控及模拟抗体通过假病毒中和试验进行定标。

采用实施例2和对比例1的方法和试剂分别进行检测，结果如下表所示：

试验数据显示，对比例1仅能够检出阻断ACE2结合的中和抗体G3，而本试验方案能够和假病毒类似，能同时检出NTD区域的中和抗体3F6，提示能够检测更多的中和抗体。此外，相较于现有技术方案，本试验方案对与阻断型的中和抗体G3的检测抑制率由25.9％提升到46.9％，对G3和3F6的混合样本检测抑制率由27％提升到69.9％，提示了更高的检测灵敏度。

实验例3

采用质控品(作为阴性样品)、3F6模拟样品中NTD中和抗体，S452模拟样品中非竞争ACE2的中和抗体，G3(广东菲鹏生物有限公司，货号ncov-PS-GonAbG3)模拟样品中竞争ACE2的中和抗体，以上质控及模拟抗体通过假病毒中和试验进行定标。

采用实施例3和对比例1的方法和试剂分别进行检测，结果如下表所示：

试验数据显示，对比例1仅能够检出阻断ACE2结合的中和抗体G3，而本发明方案能够和假病毒类似，能同时检出RBD上非竞争ACE2结合的中和抗体S452及NTD区域的中和抗体3F6，提示能够检测更多的中和抗体。此外，相较于对比例1，本发明方案对与阻断型的中和抗体G3的检测抑制率由25.9％提升到47.4％，对G3、S452和3F6的混合样本检测抑制率由26.9％提升到86.2％，提示了更高的检测灵敏度。

采用本发明所述的其他接触方式处理样品，其余步骤分别同实施例1或2或3，其取得的灵敏度及检出率与相应的实施例基本相当。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。