一种自身免疫性甲状腺疾病预测及预后判断试剂盒及应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种以TRBV15和TRBV29-1作为生物标志物的自身免疫性甲状腺疾病(AITD)预测及预后判断的试剂盒及应用。

背景技术

自身免疫性甲状腺疾病(AITD)是一种慢性的甲状腺自身免疫性疾病，主要包括Graves病(GD)和桥本甲状腺炎(HT)，可能分别会给患者带来甲状腺毒症和甲减的风险。AITD在人群中的发病率可最高达5％，然而触发甲状腺自身免疫的因素还不十分明了。流行病学资料结果显示，基因易感性、环境因子和免疫因素的共同相互作用导致机体免疫耐受受损，进而促进了疾病的发生。而在其中，自身抗体对甲状腺的免疫攻击是AITD发病的基础。另外，甲状腺组织中T细胞的浸润和聚集，引起甲状腺滤泡上皮细胞的破坏，从而导致了疾病的发生发展。实际上，T细胞的功能异常或者数目异常在AITD中表现极为复杂，T细胞受体谱的异常被认为在AITD疾病促进甲状腺细胞破坏的过程中扮演着非常重要的角色。而T细胞受体相关基因的表达异常在AITD中研究较少，我们前期的研究发现在AITD的患者中明显存在着T细胞受体相关基因TRBV15和TRBV29-1的异常表达，这也为我们研究和监测AITD的发病进展提供了理论学依据。

AITD影响患者的生活质量，严重者可能引起患者甲状腺眼病、甲亢性心脏病、低钾性周期性麻痹等，危害患者的生命健康，故AITD的诊断、鉴别和预后的判断显得尤为重要。而AITD诊断和治疗方案的制定有赖于临床和实验室检查结果。分子诊断技术可为AITD的诊断、鉴别诊断和预后提供依据。由于AITD的发病机制仍未完全明了，现有的AITD相关标志物临床判断AITD的预后效果欠佳，急需一种便捷、准确的诊断和预后判断的生物标志物或者实验室诊断依据。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明的目的在于提供TRBV15和TRBV29-1联合作为AITD生物标志物在制备或筛选AITD检测试剂中的用途。

本发明的另一目的在于提供一种以TRBV15和TRBV29-1联合作为生物标志物的AITD检测试剂盒。

本发明的另一目的在于提供一种检测AITD的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的第一方面，提供了TRBV15和TRBV29-1联合作为生物标志物在制备或筛选AITD检测试剂中的用途。

较优的，所述TRBV15和TRBV29-1联合作为AITD外周血生物标志物。

较优的，所述AITD检测试剂用于AITD的判断、治疗方案的选择、和/或预后评估。

将TRBV15和TRBV29-1联合作为AITD生物标志物用于制备AITD检测试剂，是指将TRBV15和TRBV29-1联合作为基于检测TRBV15和TRBV29-1含量的AITD检测试剂的标准品或阳性对照，用于样本中的TRBV15和TRBV29-1的检测。

将TRBV15和TRBV29-1联合作为AITD生物标志物用于筛选AITD检测试剂，是指将TRBV15与TRBV29-1作为靶标应用于AITD检测试剂的筛选。在一优选例中，基于所述的TRBV15与TRBV29-1，筛选特异性识别TRBV15的试剂和特异性识别TRBV29-1的试剂，从而作为检测AITD的试剂，来检测样本中的TRBV15与TRBV29-1水平。

在一优选例中，基于所述的TRBV15与TRBV29-1，筛选特异性识别TRBV15的引物和特异性识别TRBV29-1的引物，从而作为从而作为检测AITD的引物。

在一优选例中，基于所述的TRBV15与TRBV29-1，筛选特异性识别TRBV15的抗体和特异性识别TRBV29-1的抗体，从而作为从而作为检测AITD的试剂。

本发明的第二方面，提供了特异性识别TRBV15的试剂和特异性识别TRBV29-1的试剂在制备AITD检测试剂盒中的用途。

在一优选例中，特异性识别TRBV15的试剂选自特异性识别TRBV15的抗体。特异性识别TRBV29-1的试剂选自特异性识别TRBV29-1的抗体。

所述抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。

本发明的第三方面，提供一种AITD检测试剂盒，包括特异性识别TRBV15的试剂和特异性针对TRBV29-1的试剂。

优选地，所述AITD检测试剂盒以TRBV15和TRBV29-1作为AITD生物标志物。

在一优选例中，特异性识别TRBV15的试剂选自特异性识别TRBV15的引物。特异性识别TRBV29-1的试剂选自特异性识别TRBV29-1的引物。

在一优选例中，特异性识别TRBV15的试剂选自特异性识别TRBV15的抗体。特异性识别TRBV29-1的试剂选自特异性识别TRBV29-1的抗体。

所述抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。

在一优选例中，特异性识别TRBV15的抗体包括用于检测TRBV15的一抗和二抗。特异性识别TRBV29-1的抗体包括用于检测TRBV29-1的一抗和二抗。

进一步地，所述二抗为荧光分子标记的二抗。

在一优选例中，所述的试剂盒中还包括所述的试剂盒中还包括实时荧光定量PCR技术常用的试剂。

在一优选例中，所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照。所述阳性对照包括TRBV15和TRBV29-1。所述阴性对照包括ddH

优选地，所述AITD检测试剂盒用于AITD的判断、治疗方案的选择、和/或预后评估。

在本发明的第四方面，提供了一种检测AITD的方法，包括检测样本中TRBV15和TRBV29-1的水平。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明基于发明人研究成果，通过检测两个新发现且彼此关联的AITD标志物，更准确的判断AITD的病情严重程度及预后。TRBV15和TRBV29-1同时作为新的AITD标志物，可为AITD的分子病理诊断提供依据。采用本发明的检测试剂盒对样本中的TRBV15和TRBV29-1进行联合检测，从而诊断和检测AITD，检测结果灵敏度好，特异性高。可有效用于AITD的早期筛查和/或预后评估，具有良好的临床应用前景。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其它优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECμLAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECμLARBIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODSIN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE ANDFUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，SanDiego，1999；和METHODS IN MOLECμLAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

术语、缩略语

qRT-PCR：quantitative real-time polymerase chain reaction，实时荧光定量PCR

灵敏度：即真阳性率，真阳性与真阳性+假阴性的比例。

特异性：即真阴性率，真阴性与真阴性+假阳性的比例。

AITD：自身免疫性甲状腺疾病的简称，主要包括Graves病(GD)和桥本甲状腺炎(HT)。

实施例1.通过qRT-PCR方法对AITD外周血中TRBV15和TRBV29-1的表达水平进行检测

一、本实施例通过qRT-PCR方法对AITD外周血中TRBV15和TRBV29-1的表达水平进行检测，步骤如下：

(1)取患者及正常对照组的外周血，分离外周血单个核细胞(PBMC)；

(2)通过流式细胞术分选CD4+T细胞；

(3)加入Trizol，提取总RNA；

(4)通过引物扩增后qRT-PCR，得到患者及正常对照组的TRBV15和TRBV29-1的表达水平，从而协助诊断AITD和判断患者预后。其中，用于扩增TRBV15的引物包括上游引物和下游引物，上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：GTCCTCAGTCTGCACCTTTCATTCA。下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：GGGTAACCTGGTATCTTGG。用于扩增TRBV29-1的引物包括上游引物和下游引物，上游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：CTCCTTCTCCTGGGACTAGGTATGA。下游引物的序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：TAGGTTTGGGCGGCTGATG。

二、实施例首次发现：在AITD外周血中，TRBV15和TRBV29-1的表达水平与AITD的发生发展密切相关，见表1。且TRBV15和TRBV29-1表达水平与AITD的顽固程度和预后正相关，见表2。

表1 TRBV15和TRBV29-1在AITD和正常对照组中的表达差异

表2 TRBV15和TRBV29-1在顽固性和缓解性AITD中的表达差异

综上所述，采用本发明的检测试剂盒对外周血中的TRBV15和TRBV29-1进行联合检测，从而诊断和检测AITD，检测结果灵敏度好，特异性高。可有效用于AITD的预测和/或预后评估，具有良好的临床应用前景。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。