公开/公告号CN113215091A
专利类型发明专利
公开/公告日2021-08-06
原文格式PDF
申请/专利权人 武汉普诺赛生命科技有限公司;
申请/专利号CN202110041250.X
申请日2021-01-13
分类号C12N5/077(20100101);
代理机构42242 武汉蓝宝石专利代理事务所(特殊普通合伙);
代理人刘璐
地址 430000 湖北省武汉市东湖新技术开发区高新大道858号生物医药园C4栋第五层(自贸区武汉片区)
入库时间 2023-06-19 12:08:44
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，更具体地，涉及一种大鼠或小鼠心肌细胞的分离培养方法。
背景技术
体外培养的心肌细胞可保持结构及功能上的某些特点，并具有自发性节律搏动，且心肌细胞的培养具有简便、定量、重复性好和不受神经体液因素的影响等特点；利用体外培养的心肌细胞在探索非血液动力学因素所致的心肌肥厚的调节，研究心肌细胞的生物力学、凋亡、受体下调、缺血预处理、信号通路、对作用于心脏的新药进行筛选并对其安全性进行评价以及从培养的心肌细胞中提取有价值的生物因子等方面具有广阔的应用前景，对于研究其生理功能、药物作用以及各种致病因素作用下的病理生理改变具重要意义。
现有技术中，心肌细胞的分离方法大多数直接固定乳鼠后，采集心脏尖部，利用胰蛋白酶37℃进行消化，或者用胶原酶37℃短时间多次进行消化，通过机械吹打后获得细胞后，再经过多次差速去除成纤维细胞后获得心肌细胞。
其中，胰蛋白酶虽然能高效解离组织间蛋白，同时也能消化细胞表面的蛋白，直接长时间消化，对心肌细胞损伤大，所得细胞活性差，搏动效果不明显；在体外培养需要3-5天才见多数细胞搏动，培养2-3周基本不见细胞搏动。
短时间多次消化的操作虽然可以减小消化损伤，但因操作步骤多，时间紧促，容错率低，可重复性，稳定性差；操作繁琐易导致污染。而心肌细胞本身比较脆弱，消化后所得的细胞总量少，多数裂解成为碎片，活性差、贴壁性差。
鉴于此，有必要研究开发一种全新的大鼠或小鼠心肌细胞的分离培养方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种大鼠或小鼠心肌细胞的分离培养方法，简化分离的操作步骤，提高细胞的分离产量、分离活性和细胞纯度。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种大鼠或小鼠心肌细胞的分离培养方法，包括：
将获取得到的心尖组织碎块置于消化液中静置消化；
依次经过筛和离心后，取细胞沉淀；
将细胞沉淀用筛选培养基重悬接种至含筛选培养基的培养皿中，静置培养后吸取未贴壁心肌细胞，接种于新鲜的筛选培养基中，继续培养后用纯化培养基更新筛选培养基，并定期更换纯化培养基；
其中：所述消化液由0.01-0.25w/v胰蛋白酶、0.01-0.25w/v胶原酶Ⅱ、40-200U/mlDNase和AQIX组成。
在上述技术方案中，所述静置消化的温度为3-5℃。
在上述技术方案中，所述静置消化的时间为2-6h。
具体地，在上述技术方案中，所述消化液的体积为所述心尖组织碎块的4-6倍。
进一步地，在上述技术方案中，所述大鼠或小鼠心肌细胞的分离培养方法还包括，
在静置消化后，转移至37℃的培养箱中，复温5min。
具体地，在上述技术方案中，所述大鼠或小鼠心肌细胞的分离培养方法还包括，
加入体积为消化液体积的0.8-1.5倍的DMEM完全培养基并混匀，用移液枪反复吹打复温后的消化液20-30次，直至无明显组织块。
具体地，在上述技术方案中，所述过筛为过200目筛。
具体地，在上述技术方案中，所述离心为在1000rpm条件下离心4-6min。
再进一步地，在上述技术方案中，所述筛选培养基的成分为：DMEM+4-5ug/ml阿糖胞苷+15％FBS+1％ITS+1-2mM谷氨酰胺。
再进一步地，在上述技术方案中，所述纯化培养基的成分为：DMEM+1ug/ml阿糖胞苷+15％FBS+5％马血清+1％ITS+1-2mM谷氨酰胺。
在本发明的一个优选实施方式中，所述消化液由0.05-0.20w/v胰蛋白酶、0.05-0.20w/v胶原酶Ⅱ、40-200U/ml DNase和AQIX组成。
在本发明的一个具体实施方式中，所述大鼠或小鼠心肌细胞的分离培养方法，具体包括以下步骤：
S1、无菌获取出生1-30天的大鼠或小鼠的完整心脏，剪下心脏1/2靠近心尖部分组织，用组织清洗液漂洗2次，剪至1-3mm
S2、往无菌培养皿中加入4-6倍心尖组织碎块体积的消化液，置于3-5℃的培养箱中，静置消化2-6h，随后将无菌培养皿转移至37℃的培养箱中，复温5min，并加入0.8-1.5倍消化液体积的DMEM完全培养基并混匀，用移液枪反复吹打复温后的消化液20-30次，直至无明显组织块；
S3、将经步骤S2消化完成的心肌细胞过200目筛后，在1000rpm条件下离心4-6min，留取沉淀；
S4、用筛选培养基重悬步骤S3中的沉淀，接种于6cm培养皿内，置于37℃、5％CO
S5、在筛选培养基中培养48h后，用纯化培养基更新培养皿内的筛选培养基并继续培养，随后每72h更新一次纯化培养基，持续培养。
本发明另一方面还提供了上述分离培养方法培养得到的大鼠或小鼠心肌细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明所提供的分离培养方法与传统多步操作消化相比，只需一步消化，静置放置，操作简单，节约时间，同时可以避免多步操作带入污染，避免机械操作破坏细胞活性；
(2)本发明所提供的分离培养方法在3-5℃下消化，低温可以延缓消化液作用，采用缓慢渗透消化方式，可以达到全面消化组织，消化更彻底，获得更多细胞，而现有技术的37℃直接消化作用在组织表面，消化不均一，先出来的细胞会过度消化死亡；
(3)本发明所提供的分离培养方法采用AQIX组织保护液，相较普通PBS等可以使组织、细胞在体外长时间维持更高活性；
(4)本发明所提供的分离培养方法使用1步差速，1步筛选纯化，相较传统多次差速，最后再筛选，可避免差速中细胞损失，获得更多细胞，同时特制筛选培养基可以提高细胞纯度、活性；
(5)本发明所提供的分离培养方法获得的心肌细胞，纯度高，活性好，培养第48h，显微镜下观察，90％以上细胞均在跳动。
附图说明
图1为本发明实施例1中分离培养5d后的心肌细胞的显微镜照片；
图2为本发明实施例2中分离培养5d后的心肌细胞的显微镜照片；
图3为本发明对比例1中分离培养5d后的心肌细胞的显微镜照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下实施例，仅用于说明本发明的内容，但不用来限制本发明的范围。
若未特别指明，本发明实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都应属于本发明的保护范围。
实施例1
本发明实施例提供了大鼠心肌细胞的分离培养方法，具体包括以下步骤：
S1、取出生1天的大鼠乳鼠，75％酒精浸泡5min消毒，转移至超净工作台内，用无菌剪刀剪开胸部皮肤，打开胸腔，用镊子夹出心脏，置于无菌培养皿内，加入适量组织清洗液，剪刀剪下心脏1/2靠近心尖部分组织，用组织清洗液漂洗2次，将心脏心尖组织用眼科剪剪至1-3mm
S2、往无菌培养皿中加入5倍心尖组织碎块体积的消化液，其中，消化液由0.01w/v胰蛋白酶、0.015w/v胶原酶Ⅱ、80U/ml DNase和AQIX组成，置于4℃的培养箱中，静置消化5h，随后将无菌培养皿转移至37℃的培养箱中，复温5min，并加入1.2倍消化液体积的DMEM完全培养基并混匀，用移液枪反复吹打复温后的消化液20-30次，直至无明显组织块；
S3、将经步骤S2消化完成的心肌细胞过200目筛后，在1000rpm条件下离心5min，留取沉淀；
S4、用筛选培养基重悬步骤S3中的沉淀，接种于6cm培养皿内，置于37℃、5％CO
S5、在筛选培养基中培养48h后，用纯化培养基更新培养皿内的筛选培养基并继续培养，随后每72h更新一次纯化培养基，持续培养，其中，纯化培养基的成分为：DMEM+1ug/ml阿糖胞苷+15％FBS+5％马血清+1％ITS+1.5mM谷氨酰胺。
实施例2
本发明实施例提供了小鼠心肌细胞的分离培养方法，具体包括以下步骤：
S1、取出生12天的小鼠乳鼠，75％酒精浸泡5min消毒，转移至超净工作台内，用无菌剪刀剪开胸部皮肤，打开胸腔，用镊子夹出心脏，置于无菌培养皿内，加入适量组织清洗液，剪刀剪下心脏1/2靠近心尖部分组织，用组织清洗液漂洗2次，将心脏心尖组织用眼科剪剪至1-3mm
S2、往无菌培养皿中加入5倍心尖组织碎块体积的消化液，其中，消化液由0.05w/v胰蛋白酶、0.020w/v胶原酶Ⅱ、80U/ml DNase和AQIX组成，置于4℃的培养箱中，静置消化5h，随后将无菌培养皿转移至37℃的培养箱中，复温5min，并加入1.2倍消化液体积的DMEM完全培养基并混匀，用移液枪反复吹打复温后的消化液20-30次，直至无明显组织块；
S3、将经步骤S2消化完成的心肌细胞过200目筛后，在1000rpm条件下离心5min，留取沉淀；
S4、用筛选培养基重悬步骤S3中的沉淀，接种于6cm培养皿内，置于37℃、5％CO
S5、在筛选培养基中培养48h后，用纯化培养基更新培养皿内的筛选培养基并继续培养，随后每72h更新一次纯化培养基，持续培养，其中，纯化培养基的成分为：DMEM+1ug/ml阿糖胞苷+15％FBS+5％马血清+1％ITS+2mM谷氨酰胺。
对比例1
本发明对比例提供了小鼠心肌细胞的分离培养方法，采用传统分离培养方法，具体包括以下步骤：
S1、取出生1天的大鼠乳鼠，75％酒精浸泡5min消毒，转移至超净工作台内，用无菌剪刀剪开胸部皮肤，打开胸腔，用镊子夹出心脏，置于无菌培养皿内，加入适量组织清洗液，剪刀剪下心脏1/2靠近心尖部分组织，用组织清洗液漂洗2次，将心脏心尖组织用眼科剪剪至1-3mm
S2、将组织转移至15ml离心管内，加入5倍心尖组织碎块体积的消化液，其中，消化液由0.25w/v胰蛋白酶、0.2w/v胶原酶Ⅱ和PBS组成，置于37℃的培养箱中，消化8min，取出离心管，用移液枪吹打组织10次左右，静置沉降组织，吸取消化液上清收集于50ml离心管内(管内有10ml血清)；
S3、重复步骤S2消化步骤3-5次，中间不停顿，否则影响细胞活性，直至离心管内组织完全消失，最后收集所有消化上清液，置于50ml离心管内；
S4、将含有消化上清液的50ml离心管，在1200rpm条件下离心5min，获得细胞沉淀；
S5、用DMEM完全培养基重悬沉淀，接种于培养皿中，于37℃静置培养，30min后吸取未贴壁的上清液，接种在新的培养皿中，重复操作，差速分离3次，静置培养48h，以后每3天换液。
图1-3分别为本发明实施例1-2和对比例1中分离培养5d后的心肌细胞的显微镜照片。
经统计后可以得到，采用同样的一只小鼠乳鼠，采用实施例2的方法可以获得约2×10
此外，从图1-3中可以看出，实施例1-2在48h后80％细胞贴壁展开，心肌细胞在高活性下，贴速度快，贴壁后细胞会逐渐向四周展开形态，逐渐开始跳动，且活性好时，细胞会均匀分散，并在一段时间后呈现同步跳动，同时，细胞高纯度是形态比较均一；而对比例1在48h后50％细胞贴壁展开呈现短梭形，细胞未向周围展开，活性不佳，贴壁不牢，后续培养还会有部分细胞漂浮死亡，且有50％细胞呈现圆形，未展开，后续培养难存活、跳动，同时，细胞形态多样，体现纯度不高，有杂细胞混在其中，零散分布细胞只有部分跳动，夹杂部分细胞完全不跳的。
最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
机译： 人心肌细胞分离试剂，培养介质，分离方法和培养方法
机译： 从成熟大鼠的心脏中获取分离的心肌细胞的方法
机译： 小鼠/大鼠微量分离物上笼
