生物矿化凝血酶及其制备方法和应用、基于生物矿化凝血酶的快速止血纱布及其制备方法

技术领域

本发明涉及外科医疗用品技术领域，尤其涉及生物矿化凝血酶及其制备方法和应用、基于生物矿化凝血酶的快速止血纱布及其制备方法。

背景技术

急救及突发事故中防止过量失血可以延长救援时间，提高患者的生还机率。目前常规用于急救的止血器材主要是止血带和绷带，但止血带和绷带无论从急救方式和急救效果上都无法满足创伤急救发展的需求。现有技术公开了用于急性大出血的止血产品—“血盾”速效止血粉，但“血盾”速效止血粉存在的最大问题是：治疗过程中，可能会有部分止血粉末进入血管，有形成血栓，造成严重止血后遗症的风险；此外，这类止血粉的主要成分是一些无机颗粒，这些颗粒在体内无法被吸收代谢，会在体内累积，其长期安全性不可保证。

现有技术还公开了将高岭土用于制备止血纱布。高岭土是一种不含任何动、植物蛋白的惰性矿物质，与伤口接触时不易发生过敏，安全性高。目前上市的高岭土止血材料主要来自美国Z-Medica公司，该公司利用高岭土接触活化FXII，激活内部凝血通路的特性，并针对出血量与出血部位不同，研发了系列高岭土止血材料，包括高岭土战伤纱布、高岭土介入止血绷带、高岭土扁桃体止血海绵和高岭土止血垫等。但是上述高岭土止血纱布仍存在一定不足，这是由于高岭土是通过激活内源性凝血机制，进而激活凝血酶原生成凝血酶，凝血酶催化纤维蛋白原形成网络状的纤维蛋白达到止血的目的，止血机制单一。现有高岭土止血纱布的止血成分主要为高岭土，止血成分单一，止血机制单一，因而止血速度有待进一步提高。高岭土止血纱布中添加凝血酶能够弥补上述高止血速度有待进一步提高的缺陷，但是凝血酶直接负载于于纱布上后必须在4℃以下的冰箱里储存，室温下凝血酶短期内便会失活，无法满足常规急救的需求。

发明内容

本发明的目的在于提供生物矿化凝血酶及其制备方法和应用、基于生物矿化凝血酶的快速止血纱布及其制备方法，本发明的生物矿化凝血酶结构稳定，能在室温下长期存储。基于所述生物矿化凝血酶和粘土材料制备得到的快速止血纱布的止血时间明显缩短。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种生物矿化凝血酶的制备方法，包括以下步骤：

凝血酶经金属离子和磷酸盐生物矿化，得到生物矿化凝血酶；或者，凝血酶经金属有机框架材料的制备原料生物矿化，得到生物矿化凝血酶。

优选的，所述金属离子选自Cu

优选的，所述金属离子来源于金属盐；所述金属盐优选的选自CuSO

优选的，所述金属有机框架材料选自ZIF-8和/或MAF-7。

本发明还提供了上述方案所述制备方法制备得到的生物矿化凝血酶，所述生物矿化凝血酶的粒径为5nm～50μm。

本发明还提供了上述方案所述的生物矿化凝血酶在制备止血产品中的应用。

本发明还提供了一种基于上述方案所述生物矿化凝血酶制备得到的快速止血纱布，包括：

纱布衬底；

分布于所述纱布衬底上的粘土材料和生物矿化凝血酶。

优选的，所述粘土材料选自高岭土、活性白土、膨润土、生物活性玻璃和硅藻土中的一种或几种。

优选的，所述粘土材料由粘合剂粘附于所述纱布衬底上，所述粘合剂选自多巴胺、单宁酸、没食子酸、5,6,7-三羟基黄酮、鞣酸、杨梅酮、儿茶素、表儿茶素和茶黄素中的一种或几种。

本发明还提供了上述方案所述快速止血纱布的制备方法，包括以下步骤：

将分布有粘土材料的纱布衬底于预处理液中进行第一浸泡后，再置于矿化液中进行第二浸泡，干燥，得到快速止血纱布；

所述预处理液中的溶质包括金属离子磷酸盐或金属有机框架材料的金属元素供体原料；

所述矿化液中包括凝血酶和矿化剂，所述矿化剂包括第一矿化剂和/或第二矿化剂，所述第一矿化剂包括金属离子和磷酸盐，所述第二矿化剂包括制备金属有机框架材料的原料。

本发明提供了一种生物矿化凝血酶的制备方法，包括以下步骤：凝血酶经金属离子和磷酸盐生物矿化，得到生物矿化凝血酶；或者，凝血酶经金属有机框架材料的制备原料生物矿化，得到生物矿化凝血酶。凝血酶经生物矿化能够稳定凝血酶的结构，使其能在室温下长期存储，能够直接负载于止血产品载体上。当负载有生物矿化凝血酶的止血产品与血液接触时，可迅速催化纤维蛋白原形成网络状的纤维蛋白达到止血的目的。

本发明还提供了一种快速止血纱布，包括：纱布衬底；分布于所述纱布衬底上的粘土材料；和分布于所述纱布衬底上的生物矿化凝血酶；所述生物矿化凝血酶是凝血酶经金属离子磷酸盐或金属有机框架材料生物矿化得到。本发明中，粘土材料能够通过激活内源性凝血机制，激活凝血酶原生成凝血酶，凝血酶催化纤维蛋白原形成网络状的纤维蛋白达到止血的目的。生物矿化凝血酶与血液接触时，可迅速催化纤维蛋白原形成网络状的纤维蛋白达到止血的目的。因此，本发明同时具有粘土材料激活内源性止血机制和凝血酶的快速止血机制，相较于以往单一高岭土的止血纱布，本发明可实现快速止血的目的。

附图说明

图1为实施例1中不同金属离子磷酸盐生物矿化凝血酶微纳米颗粒的电镜图；

图2为实施例3中不同高岭土基止血纱布对应的SEM结果；

图3为实施例3中Cu

图4为QuikClot Combat Gauze纱布实物图；

图5为QuikClot Combat Gauze-X Ray纱布实物图；

图6为QuikClot EMS Rolled Gauze纱布；

图7不同组的纱布的止血性能测试结果。

具体实施方式

本发明提供了一种生物矿化凝血酶的制备方法，包括以下步骤：

凝血酶经金属离子和磷酸盐生物矿化，得到生物矿化凝血酶；或者，凝血酶经金属有机框架材料的制备原料生物矿化，得到生物矿化凝血酶。

在本发明中，所述金属离子优选的选自Cu

在本发明中，所述金属离子优选的来源于金属盐；所述金属盐优选的选自CuSO

在本发明中，所述磷酸盐优选的来源于磷酸盐缓冲溶液；所述磷酸盐缓冲溶液的pH值优选为7.4；所述磷酸盐缓冲溶液的摩尔浓度优选为0.1M。

在本发明中，所述金属有机框架材料优选的选自ZIF-8和/或MAF-7。在本发明中，所述ZIF-8的制备原料优选的包括Zn(OAc)

在本发明中，所述制备方法具体包括以下步骤：

将金属盐、磷酸盐缓冲溶液和凝血酶混合，进行静置矿化，得到生物矿化凝血酶；或者，

将金属有机框架材料的制备原料和凝血酶混合，进行静置矿化，得到生物矿化凝血酶。

在本发明中，所述静置矿化的温度优选为0～40℃，进一步优选为20℃；所述静置矿化的时间为1～72h。

本发明还提供了上述方案所述制备方法制备得到的生物矿化凝血酶。

在本发明中，所述生物矿化凝血酶的粒径优选为1nm～50μm，进一步优选为1nm～10μm，更进一步优选为5nm～3μm。

本发明还提供了上述方案所述生物矿化凝血酶在制备止血产品中的应用。

本发明还提供了一种基于上述方案所述生物矿化凝血酶制备得到的快速止血纱布，包括：

纱布衬底；

分布于所述纱布衬底上的粘土材料和生物矿化凝血酶。

在本发明中，所述纱布衬底包括编织的或无纺布的纤维材料，其包括但不限于棉花、丝绸、羊毛、塑料、纤维素、人造丝、聚脂或上述材料的结合等。

在本发明中，所述粘土材料选自高岭土、活性白土、膨润土、生物活性玻璃和硅藻土中的一种或几种。

在本发明中，所述粘土材料优选的由粘合剂粘附于所述纱布衬底上，所述粘合剂优选的选自多巴胺、单宁酸、没食子酸、5,6,7-三羟基黄酮、鞣酸、杨梅酮、儿茶素、表儿茶素和茶黄素中的一种或几种，更优选为多巴胺。

本发明以多巴胺为粘合剂，多巴胺分子中的酚羟基与粘土材料中的硅羟基以及纱布中纤维素的羟基有强的相互作用，多巴胺分子之间也会发生化学反应形成共价键。因此，本发明中多巴胺以强的作用力将高岭土负载于纱布纤维表面，相较于常规高岭土基止血纱布，对于高岭土的负载更加牢固，使其与血液接触时极大地减少高岭土的脱落。

本发明以多巴胺分子作为粘合剂具有如下优势：粘附粘土材料时在纱布纤维表面所形成的聚多巴胺对金属离子也同样有强的吸附性能，这也促进了生物矿化凝血酶在纱布表面的组装；粘附粘土材料时在纱布纤维表面所形成的聚多巴胺，由于其酚羟基的存在，也会吸附富集部分的凝血因子，促进凝血；多巴胺生物相容性好、以此为粘结剂制备的止血纱布比较柔软，便于使用。

在本发明中，所述快速止血纱布优选的还包括：分布于所述纱布衬底上的结合所述粘土材料的止血材料；所述止血材料选自硫酸镁、偏磷酸钠、氯化钙、糊精、水合硫酸镁、偏磷酸钠水合物、氯化钙水合物、糊精水合物、抗坏血酸、氨甲环酸、芦丁和凝血酶中的一种或几种。

在本发明中，所述快速止血纱布优选的还包括：分布于所述纱布衬底上的结合所述粘土材料的以下材料中的至少一种：抗生素、抗真菌剂、抗微生物剂、抗炎剂、止痛剂和抗组胺剂。

本发明还提供了上述方案所述快速止血纱布的制备方法，包括以下步骤：

将分布有粘土材料的纱布衬底于预处理液中进行第一浸泡后，再置于矿化液中进行第二浸泡，干燥，得到快速止血纱布；

所述预处理液中的溶质包括金属离子或金属有机框架材料的金属元素供体原料；

所述矿化液中包括凝血酶和矿化剂，所述矿化剂包括第一矿化剂和/或第二矿化剂，所述第一矿化剂包括金属离子和磷酸盐，所述第二矿化剂包括制备金属有机框架材料的原料。

在本发明中，所述分布有粘土材料的纱布衬底优选的采用以下方法制备得到：将纱布衬底于粘土材料分散液中浸泡后干燥，得到分布有粘土材料的纱布衬底。

在本发明中，所述粘土材料分散液优选的以Tris-HCl缓冲溶液为溶剂，包括以下浓度的组分：粘合剂1～1250mg/mL和粘土材料1～100mg/mL；所述粘土材料的浓度优选为30mg/mL；所述粘合剂的浓度优选为250～500mg/mL。

在本发明中，所述Tris-HCl缓冲溶液的摩尔浓度优选为0.05mol/L；所述Tris-HCl缓冲溶液的pH值为8.5；本发明具体实施过程中，所述Tris-HCl缓冲溶液的配置方法包括：在0.2mol/L的Tris缓冲溶液中加入0.2mol/L的HCl水溶液，再加入去离子水稀释；所述Tris缓冲溶液、HCl水溶液和去离子水的体积比为5：3：8。

在本发明中，所述浸泡的过程中优选的伴随震荡处理；所述震荡的频率优选为250～300rpm；所述浸泡的温度优选为20～25℃；所述浸泡的时间优选为5～6h。在本发明中，所述干燥的方式优选为烘干；所述干燥的温度优选为45～50℃；所述干燥的时间优选为8～10h。

得到分布有粘土材料的纱布衬底后，本发明优选的将得到的干燥分布有粘土材料的纱布衬底重新浸泡于粘合剂Tris-HCl缓冲溶液中，以使粘合剂更有效地将粘土材料粘附于纱布上；所述粘合剂Tris-HCl缓冲溶液中粘合剂的浓度优选为125～1250mg/mL，更优选为250～500mg/mL。

得到分布有粘土材料的纱布衬底后，本发明将分布有粘土材料的纱布衬底于预处理液中进行第一浸泡后，再置于矿化液中进行第二浸泡，干燥，得到快速止血纱布；

所述预处理液的溶质包括金属离子或金属有机框架材料的金属元素供体原料；

所述矿化液中包括凝血酶；还包括以下组分中的一种：

1)金属离子；

2)制备金属有机框架材料的原料。

在本发明中，当所述预处理液的溶质包括金属离子时，所述矿化液优选的还包括金属离子；当所述预处理液的溶质包括金属有机框架材料的金属元素供体原料时，所述矿化液还包括制备金属有机框架材料的原料。

在本发明中，所述预处理液中的金属元素的种类优选的和矿化液中的金属离子种类相同；或者，所述预处理液中的金属有机框架材料的金属元素供体原料的种类优选的和矿化液中的金属有机框架材料的金属元素供体原料相同。

在本发明中，所述预处理液中所述金属离子的摩尔浓度优选为100～120mM；所述金属有机框架材料的金属元素供体原料的摩尔浓度优选为0.04～0.05mM。

在本发明中，所述第一浸泡的过程优选的进行震荡；所述震荡的频率优选为250～300rpm；所述第一浸泡的温度优选为20～30℃，进一步优选为25℃；所述第一浸泡的时间优选为5～6h。在本发明中，所述第一浸泡的作用是为了让纱布衬底吸附相应金属离子或者金属有机框架材料的金属元素供体原料直到吸附饱和。

在本发明中，所述矿化液优选的以磷酸盐缓冲溶液为溶剂；所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.4；所述磷酸盐缓冲溶液的浓度优选为0.1M。

在本发明中，所述矿化液中凝血酶的浓度优选为0.1～2.5KU/mL。

在本发明中，当所述矿化液中包括金属离子时，所述矿化液中金属离子的摩尔浓度为0.01～5mM，优选为0.8～1.5mM。

在本发明中，当所述矿化液中包括制备金属有机框架材料的原料时；所述制备金属有机框架材料的原料中金属元素供体原料的摩尔浓度为0.001～2mM，优选为0.02～0.05mM。

在本发明中，所述矿化液优选的包括以下组分：磷酸盐缓冲溶液和凝血酶；还包括金属盐或制备金属有机框架材料的原料；所述磷酸盐缓冲溶液、金属盐溶液和凝血酶溶液的体积比为98：(1～2)：(2～3)；所述金属盐溶液的摩尔浓度为0.8～1.5mM；所述凝血酶溶液的浓度为0.1～2.5KU/mL。

在本发明中，所述第二浸泡的温度优选为0～35℃，进一步优选为20℃；所述第二浸泡的时间为20～24h。在本发明中，所述第二浸泡的作用是让金属离子或者金属有机框架材料供体原料与凝血酶进行生物矿化。

在本发明中，所述干燥的方式优选为冷冻干燥；所述冷冻干燥的温度优选为-20～-50℃；所述冷冻干燥的时间优选为24h。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

分别将1mL 120mM的CuSO

ZIF-8生物矿化凝血酶的制备：在室温下，将2mL凝血酶溶液(1KU/mL)加入28mL含有Zn(OAc)

MAF-7生物矿化凝血酶的制备：在室温下，将2mL凝血酶溶液(1KU/mL)加入28mL含有Zn(NO

不同金属离子生物矿化凝血酶微纳米颗粒的电镜图参见图1。由图1可以看出，不同金属离子经生物矿化所得到的纳米颗粒的形态是不同的，其粒径为1～3000nm。

不同金属离子矿化的生物矿化凝血酶微纳米颗粒的热稳定性

将得到的不同金属离子矿化的生物矿化凝血酶热稳定性的测定：将装有一定量金属离子生物矿化凝血酶的样品管置于50℃/70℃烘箱中2h，取出冷至室温后加入1ml经37℃预热的PBS缓冲液，使样品均匀分散于溶液中。然后，向上述溶液中加入2ml经37℃预热凝血酶显色底物S2238溶液(8×10

表1不同金属离子生物矿化凝血酶微纳米颗粒的热稳定性

实施例2不同生物矿化凝血酶止血纱布制备

首先，边长约为20cm的正方形多巴胺修饰的纱布分别浸泡在30mL 120mM CuSO

ZIF-8生物矿化凝血酶快速止血纱布的制备：在室温下，边长约为20cm多巴胺修饰的正方形纱布分别浸泡在30mL 0.04mM Zn(OAc)

MAF-7生物矿化凝血酶快速止血纱布的制备：边长约为20cm的正方形多巴胺修饰的纱布分别浸泡在30mL 0.04mM Zn(NO

实施例3

(1)高岭土基止血纱布的制备：按照表2的配比，配置100ml不同浓度的多巴胺Tris-HCl缓冲溶液，加入高岭土，超声至高岭土在多巴胺溶液中均匀分散，约30min，以瓶底不再有高岭土为准，加入边长约为20cm的正方形纱布，摇床中250rpm，25℃摇6h，烘箱中50℃干燥10h，得到高岭土基止血纱布。把所得到的干燥高岭土基止血纱布重新浸泡于多巴胺Tris-HCl缓冲溶液中，重复以上步骤，但不新加高岭土。

Tris-HCl缓冲溶液(0.05mol/LpH＝8.5)的配置：10mL 0.2mol/L Tris缓冲溶液中加入6mL 0.2mol/L HCl溶液，再加入24mL去离子水稀释。

表2高岭土基止血纱布

不同组别的高岭土基止血纱布对应的SEM结果如图2所示，未粘附高岭土的纱布纤维表面光滑，粘附高岭土后纤维表面粗糙有高岭土颗粒，结果表明所有的制备方法中，高岭土均可粘附于纱布纤维的表面。

(2)快速止血纱布的制备：

步骤(1)得到的3号高岭土基止血纱布分别浸泡在30mL 120mM CuSO

(3)设置对照组1、对照组2、对照组3以及实验组1；对照组1、对照组2和对照组3采用的均为高岭土止血纱布，分别为QuikClot Combat Gauze纱布(参见图4)、QuikClotCombat Gauze-X Ray纱布(参见图5)和QuikClot EMS Rolled Gauze纱布(参见图6)。实验组采用步骤(2)制备得到的Cu

对上述不同组的纱布进行止血性能测试：大鼠品系及肝脏切除模型：①品系：SD大鼠，其被广泛用于药理、毒理、药效及GLP实验；②鼠龄：7周；③体重：250g左右；④麻醉：水合氯醛腹腔注射；⑤创伤：切除约2cm的肝脏。止血方式：①将纱布垫于肝脏下，切除2cm的肝脏，自由出血30s；②首先将纱布在伤口出血部位按压1min；③每隔30s打开纱布，观察出血情况，直至完全止血。

实验结果参见图7。由图7可以看出，实验组1的铜离子生物矿化凝血酶/高岭土快速止血纱布相对于对照组1、对照组2和对照组3的止血时间更短，出血量更低，止血性能更好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。