一种刺梨根茎中提取的具有抗炎活性的提取物及其应用

技术领域

本发明属于天然药物领域，具体涉及一种刺梨根茎中提取的具有抗炎活性的提取物及其应用。

背景技术

刺梨(Rosa roxbunghii Tratt)是蔷薇科蔷薇属植物缫丝花的果实，别名刺菠萝、文先果等(南莹等，2015)，在我国主要分布在西南地区，其中以贵州分布最多。刺梨具有较高的药用价值，其根、茎、叶、花和果实等均可入药(宋德万，刘庆红，2012)，性味酸涩，具有健脾消食，收敛止泻的功效，主要用于治疗食积腹胀、腹泻、痢疾等疾病(贵州省药品监督管理局,2003)。其中刺梨根茎煎液具有治疗急性细菌性痢疾、慢性胃溃疡等作用(陈云志，刘安英，2007；陈建华等，2001)。贵州荔波地区瑶族人民常用刺梨根茎煎汤服用治疗消化系统疾病和带下病症，同时对多种动物如猪、牛、羊等痢疾泄泻有很好治疗作用(安晓好等，2015；余跃生等，2016；罗茂川，白贤彩，2008；冯洪钱，1984)，刺梨根茎对上述病症具有很好治疗效果，且在上述疾病产生和发展过程中，都会引发炎症的产生，为进一步阐明刺梨根茎抗炎活性物质基础，对分离得到的化合物进行了抗炎活性筛选。

发明内容

本发明的目的是提供一种刺梨根茎中提取的具有抗炎活性的提取物及其制备方法，以及该提取物用于制备抗炎病症药物中的应用。

本发明的目的及解决其主要技术问题是采用以下技术方案来实现的：一种刺梨根茎中提取的具有抗炎活性的提取物，所述的提取包含：刺梨苷(1)，野蔷薇苷(2)，蔷薇酸(3)，β-D-glucopyranosyl-(2a→1b)-2a-O-β-l-arabinopyranosyl-(2b→1c)-2b-O-β-l–arabinopyranosyl-(2c→1d)-2c-O-β-l–arabinopy–rano syl-(2d→1e)-2d-O-β-l-arabinopy-ranosyl-(2e→1f)-2e-O-β-l-arabinopyranoside(4)，儿茶素(5)，3-O-methylellagic acid 3′-O-β-D-xylopyranoside(6)，3-O-methylellagic acid-4-O-α-L-rham-nopyranoside(7)七种化合物，其结构式分别为(1)、(2)、(3)、4、5、6和7式，其制备方法是将新鲜刺梨根茎洗净、切碎后，先用80％乙醇浸泡后用80％的乙醇回流提取3次，过滤合并提取液，减压浓缩至无醇味，60℃下浓缩为浸膏，采用硅胶柱层析对样品进行分离，选用氯仿：甲醇＝10:1，5:1,1:1,0:1作洗脱剂，得到四个部分，其中A部分，B部分，C部分，D部分；然后将C部分用氯仿：甲醇＝30:1,20:1,10:1洗脱，得到化合物1和化合物2；B部分用氯仿：甲醇＝20:1,10:1梯度洗脱，减压浓缩重结晶得到化合物3；将D部分用氯仿：甲醇＝8:1洗脱，得到化合物5；其他的流分，再经Sephdex-LH-20凝胶色谱柱层析纯化，得化合物化合物4，化合物6和化合物7。

所述的刺梨根茎为贵农5号刺梨。

以上步骤得到的化合物1、2、3、4、5、6和7对LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7释放的NO有明显抑制作用，在抗炎药物中的应用。

所述的化合物1、2、3、4、5、6和7用作药物时，可以直接使用或者以药物组合物的形式使用，该药物组合物含有0.1–99％的所述化合物，其余为药用载体或赋形剂。

所述的药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。

所述的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。

所述的药物组合物的剂型有：注射剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂，冲剂、喷剂、气雾剂。

本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果。由以上技术方案可知，本发明从刺梨根茎中获得的提取物对LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7释放的NO有明显抑制作用，对由于炎症引起的各种病症具有治疗作用，将该提取物开发成抗炎活性的药物，具有重要的应用前景。

附图说明

图1是化合物1、2、3、4、5、6和7的结构式。

图2是化合物1、2、3、4、5、6和7对小鼠巨噬细胞增殖影响。

图3是对RAW264.7细胞产生NO表达影响。

具体实施方式

以下结合附图和较佳实施例，对依据本发明提出的一种刺梨根茎中提取的具有抗炎活性的提取物及其应用具体实施方式、特征及其功效，详细说明如后。

一种刺梨根茎中提取的具有抗炎活性的提取物，所述的提取包含：刺梨苷(1)，野蔷薇苷(2)，蔷薇酸(3)，β-D-glucopyranosyl-(2a→1b)-2a-O-β-l-arabinopyranosyl-(2b→1c)-2b-O-β-l–arabinopyranosyl-(2c→1d)-2c-O-β-l–arabinopy–rano syl-(2d→1e)-2d-O-β-l–arabinopy-ranosyl-(2e→1f)-2e-O-β-l-arabinopyranoside(4)，儿茶素(5)，3-O-methylellagic acid 3′-O-β-D-xylopyranoside(6)，3-O-methylellagic acid-4-O-α-L-rham-nopyranoside(7)七种化合物，其结构式分别为(1)、(2)、(3)、4、5、6和7式，其制备方法是将新鲜刺梨根茎洗净、切碎后，用80％的乙醇回流提取3次，过滤合并提取液，减压浓缩至无醇味，60℃下浓缩为浸膏，采用硅胶柱层析对样品进行分离，选用氯仿：甲醇＝10；1,5:1,1:1,0:1作洗脱剂，得到四个部分，其中A部分，B部分，C部分，D部分；然后将C部分用氯仿：甲醇＝30:1,20:1,10:1洗脱，得到化合物1和化合物2；B部分用氯仿：甲醇＝20:1,10:1梯度洗脱，减压浓缩重结晶得到化合物3；将D部分用氯仿：甲醇＝8:1洗脱，得到化合物5；其他的流分，再经Sephdex-LH-20凝胶色谱柱层析纯化，得化合物化合物4，化合物6和化合物7。

所述的刺梨根茎为贵农5号刺梨。

以上步骤得到的化合物1、2、3、4、5、6和7对LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7释放的NO有明显抑制作用，在抗炎药物中的应用。

所述的化合物1、2、3、4、5、6和7用作药物时，可以直接使用或者以药物组合物的形式使用，该药物组合物含有0.1–99％的所述化合物，其余为药用载体或赋形剂。

所述的药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。

所述的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。

所述的药物组合物的剂型有：注射剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂，冲剂、喷剂、气雾剂。

实施例1

新鲜刺梨根茎(40kg)洗净、切碎后，用80％的乙醇回流提取3次，每次2小时，过滤，合并提取液，减压浓缩至无醇味，转移到水浴锅(60℃)浓缩为浸膏，得到浸膏1.15kg，将浸膏采用硅胶柱层析对样品进行初步分离，选用氯仿：甲醇＝10:1，5:1,1:1,0:1作洗脱剂，得到四个部分，其中A部分11g，B部分97g，C部分69g，D部分263g。然后将C部分用氯仿：甲醇＝630:1,20:1,10:1:1洗脱，得到化合物1(65mg)和化合物2(42mg)；B部分用氯仿：甲醇＝20:1,10:1梯度洗脱，减压浓缩重结晶得到化合物3(35mg)；将D部分用氯仿：甲醇＝8:1洗脱，得到化合物5(40mg)；其他得到的流分，采用减压浓缩后，再经Sephdex-LH-20凝胶色谱柱层析纯化，得化合物化合物4(200mg)，化合物6(25mg)和化合物7(18mg)。。

其图谱数据如下：

化合物1：白色粉末(甲醇)；ESI-MS m/z 673[M+Na]

化合物2：白色粉末(甲醇)；ESI-MS m/z 673[M+Na]

化合物3：白色粉末(甲醇)；ESI-MS m/z 511[M+Na]

化合物4：黄色半固体(甲醇)；ESI-MS m/z 840[M-H]-；

化合物5：黄色粉末(甲醇)；ESI-MS m/z 289[M-H]

化合物6：黄色针晶(二甲基亚砜)；ESI-MS m/z 919[2M+Na]

化合物7：黄色针晶(二甲基亚砜)；ESI-MS m/z 461[M-H]

片剂：用10mg化合物2，乳糖160mg，淀粉60mg，硬脂酸镁20mg；

制备方法：将提取物、乳糖和淀粉混合，用水均匀湿润，把湿润的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250mg，化合物含量为10mg。

实施例2

安瓿剂：实施例1所得2mg化合物1，氯化钠10mg；

制备方法：将化合物和氯化钠溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入安瓿瓶中。

实施例3

胶囊剂：实施例1所得10mg的化合物3，乳糖187mg，硬脂酸镁3mg；

制备方法：将化合物3与助剂混合，过筛，均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊中，每个胶囊重200mg，活性成分为10mg。

为了进一步分析化合物1、2、3、4、5、6和7对LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7释放的NO有明显抑制作用，将得到的化合物1、2、3、4、5、6和7做以下活性验证实验：

1.实验方法：

(1)MTT法检测细胞增殖活力

采用MTT法检测各个单体化合物对小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖活力的影响，筛选安全有效的摩尔浓度。在倒置显微镜下观察，取对数生长期细胞，调整细胞浓度为2×104/ml接种于96孔板中，每孔100μl，在37℃、5％CO2培养箱中培养24h至细胞贴壁，加入不同摩尔浓度药液作为给药组，设置浓度为3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400、800μmol.L-1,另设空白对照(只加培养液)和阴性对照(含有细胞和培养液)，每孔加入20μL的MTT(5mg/mlPBS溶液)，继续培养4h，培养结束后，吸去上清液，每孔加入150μL的DMSO，避光振荡10min，在570nm下检测其吸光度值。

(2)Griess法检测小鼠单核巨噬细胞NO释放量

采用LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症模型评价各单体化合物抗炎活性。取对数生长期细胞，用PBS清洗两遍，加入适量培养基，吹打均匀，于细胞板计数后，加入完全培养基稀释细胞浓度为1×105/ml，接种于96孔板中，培养24h后细胞贴壁，每孔加入经培养基稀释后的待测样品，分为地塞米松(阳性对照组)、LPS(阴性对照组)、空白组、LPS+药物组，LPS的终浓度1μg/ml,每个浓度设置3个复孔，继续培养24h，取新的96孔板每孔加入50μl培养液上清后，按炎症因子试剂盒说明书操作，测定NO的释放量。用酶标仪在540nm下测定吸光度值，实验数据由GraphPad Prism 7生物统计学软件计算药物对小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症因子NO释放抑制率IC

2.试验结果

由图2可知，与空白对照相比，化合物1、2、3、4、5、6、7在50μmol/L时，细胞增殖活力均大于90％，说明当单体浓度≤50μmol/L时，对小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖几乎没有影响，可以认定为安全浓度范围。

由图3可知，LPS刺激后NO释放显著高于对照组(P<0.001)，表明造模成功。在测试中以地塞米松为阳性对照(半数抑制浓度IC

表1各个化合物IC

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。