一种微生物对土壤有机质形成作用的评价方法

技术领域

本发明涉及土壤有机质分析技术领域，特别是一种微生物对土壤有机质形成作用的评价方法。

背景技术

到目前为止，土壤有机质的形成过程，尤其是微生物在其中所起的作用仍是难以破解“黑箱”理论。以往关于微生物对土壤有机质形成作用的研究大多只关注到活体微生物的变化，也只能捕捉到其中某些时间点的变化，这极大地阻碍了对微生物参与土壤有机质形成过程的认知。

发明内容

本发明的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种微生物对土壤有机质形成作用的评价方法。

为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：

一种微生物对土壤有机质形成作用的评价方法，包括以下步骤：

步骤一、采用室内恒温恒湿培养法培养土壤：首先称取以烘干重计的200g土壤样品置于500mL玻璃瓶中，调节土壤样品含水量至田间持水量的40％，用封口膜封口并用针扎孔；而后将其置于培养箱，在25℃条件下避光预培养7天，7天后取出立即与磨碎的

步骤二、取部分待分析土壤样品，提取其中的磷脂脂肪酸并测定磷脂脂肪酸中

步骤三、取部分待分析土壤样品，提取中的氨基糖并测定氨基糖中

步骤四、计算提取的磷脂脂肪酸和氨基糖中来源于植物残体碳的比例；磷脂脂肪酸和氨基糖中来源于植物残体碳的比例的计算公式为：

式中，F

步骤五、计算土壤中真菌残体源碳和细菌残体源碳的含量；所述土壤中真菌残体源碳和细菌残体源碳的含量的计算公式为：

F

B

式中，F

步骤六、计算土壤真菌残体源碳和细菌残体源碳中来源于植物残体碳的含量；所述土壤真菌残体源碳和细菌残体源碳中来源于植物残体碳的含量的计算公式为：

F

B

式中，F

步骤七、计算土壤活体微生物量转化为微生物死亡残体的相对效率，其计算公式为：

E＝PLFA/AS；

式中，E为土壤活体微生物量转化为微生物死亡残体的相对效率，PLFA和AS分别为某一时期土壤中磷脂脂肪酸和氨基糖的含量，单位为mg kg

步骤八、计算植物残体碳由活体微生物转移到微生物死亡残体的相对效率，其计算公式为：

Ep＝PLFAp/ASp；

式中，Ep为植物残体碳由活体微生物转移到微生物死亡残体的相对效率；PLFAp和ASp分别某一时期土壤中磷脂脂肪酸和氨基糖中来自植物残体碳的含量，单位为mg kg

步骤九、计算植物残体输入后新形成的微生物残体占土壤有机碳的比例，其计算公式为：

C＝(F

式中C为新形成的微生物残体占土壤有机碳的比例，单位为％，SOC为土壤有机碳含量，单位为mg kg

进一步地，所述步骤二具体包括：

1)将4g冷冻干燥的待分析土壤样品加入氯仿-甲醇-磷酸盐缓冲液避光振荡，离心，收集上清液；然后再向土壤沉淀中加入缓冲液再次避光振荡，离心，收集上清液；将两次提取的上清液合并，加入柠檬酸缓冲液和氯仿，涡旋后于黑暗处静置过夜，使两相分离；次日用吸管取出上层清液，保留下层的氯仿相，用N

2)将提取物用氯仿分次转移到已经预处理的硅胶柱SPE柱中，分别用氯仿和丙酮洗脱中性脂类和糖脂类物质，最后用甲醇将磷脂脂肪酸洗脱并收集；用N

3)在上述纯化的脂类样品中加入1mL甲醇与甲苯的混合液和1ml浓度为0.2mol L

进一步地，所述步骤三具体包括：

1)按照含0.4mg全氮称取待分析土壤样品，即待分析土壤样品需求量(g)＝0.4/全氮含量；然后将待分析土壤样品置于水解瓶中，加入10mL 6mol L

2)上清液用冷冻干燥仪冻干，残留的固体物质用3mL的无水甲醇溶解，再次以3000r min

优选地，所述氯仿-甲醇-磷酸盐缓冲液中氯仿、甲醇、磷酸盐的体积比为1:2:0.8。

优选地，所述甲醇、甲苯的体积比为1:1。

与现有技术相比，本发明在碳同位素示踪技术的基础上，将指示活体微生物对外源有机质利用情况的标识物(磷脂脂肪酸)和指示微生物残体对外源有机质容纳能力的标识物(氨基糖)相结合，由“点”及“线”，能够深入了解碳元素由外源有机质向土壤微生物的流动情况，并识别该过程中关键微生物群落的功能，从而更全面的评价微生物对土壤有机质形成的作用，解开有机质形成的“黑箱”理论。

附图说明

图1为本发明的流程图。

图2为磷脂脂肪酸中来自植物残体碳的比例。

图3为氨基糖中来自植物残体碳的比例。

图4为土壤中真菌残体源碳的含量。

图5为土壤中细菌残体源碳的含量。

图6为真菌残体源碳中来自植物残体碳的含量。

图7为细菌残体源碳中来自植物残体碳的含量。

图8为活体微生物量转化为微生物死亡残体的相对效率。

图9为植物残体碳由活体微生物转移到微生物死亡残体的相对效率。

图10为新形成的微生物残体占土壤有机碳的比例。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。

如图1所示，本实施例的一种微生物对土壤有机质形成作用的评价方法，包括以下步骤：

步骤一、采用室内恒温恒湿培养法培养土壤：首先称取以烘干重计的200g土壤样品置于500mL玻璃瓶中，调节土壤样品含水量至田间持水量的40％，用封口膜封口并用针扎孔；而后将其置于培养箱，在25℃条件下避光预培养7天，7天后取出立即与磨碎的

步骤二、取部分待分析土壤样品，提取中的磷脂脂肪酸并测定磷脂脂肪酸中

1)将4g冷冻干燥的待分析土壤样品加入氯仿-甲醇-磷酸盐缓冲液(体积比为1:2:0.8)避光振荡，离心，收集上清液；然后再向土壤沉淀中加入缓冲液再次避光振荡，离心，收集上清液；将两次提取的上清液合并，加入柠檬酸缓冲液和氯仿，涡旋后于黑暗处静置过夜，使两相分离；次日用吸管取出上层清液，保留下层的氯仿相，用N

2)将提取物用氯仿分次转移到已经预处理的硅胶柱SPE柱中，分别用氯仿和丙酮洗脱中性脂类和糖脂类物质，最后用甲醇将磷脂脂肪酸洗脱并收集；用N

3)在上述纯化的脂类样品中加入1mL体积比为1:1的甲醇与甲苯的混合液和1ml浓度为0.2mol L

步骤三、取部分待分析土壤样品，提取中的氨基糖并测定氨基糖中

1)按照含0.4mg全氮称取待分析土壤样品，即待分析土壤样品需求量(g)＝0.4/全氮含量；然后将待分析土壤样品置于水解瓶中，加入10mL 6mol L-1HCl，在105℃下水解8小时；冷却至室温后，加入100μg的肌醇作为内标1振荡摇匀后过滤，用旋转蒸发仪将滤液蒸干，残余物溶解于约20ml的蒸馏水中并用0.4mol L

2)上清液用冷冻干燥仪冻干，残留的固体物质用3mL的无水甲醇溶解，再次以3000r min

步骤四、计算提取的磷脂脂肪酸和氨基糖中来源于植物残体碳的比例；磷脂脂肪酸和氨基糖中来源于植物残体碳的比例的计算公式为：

式中，F

步骤五、计算土壤中真菌残体源碳和细菌残体源碳的含量；所述土壤中真菌残体源碳和细菌残体源碳的含量的计算公式为：

F

B

式中，F

步骤六、计算土壤真菌残体源碳和细菌残体源碳中来源于植物残体碳的含量；所述土壤真菌残体源碳和细菌残体源碳中来源于植物残体碳的含量的计算公式为：

F

B

式中，F

步骤六、计算土壤活体微生物量转化为微生物死亡残体的相对效率，其计算公式为：

E＝PLFA/AS；

式中，E为土壤活体微生物量转化为微生物死亡残体的相对效率，PLFA和AS分别某一时期土壤中磷脂脂肪酸和氨基糖的含量，单位为mg kg

步骤七、计算植物残体碳由活体微生物转移到微生物死亡残体的相对效率，其计算公式为：

Ep＝PLFAp/ASp；

式中，Ep为植物残体碳由活体微生物转移到微生物死亡残体的相对效率；PLFAp和ASp分别某一时期土壤中磷脂脂肪酸和氨基糖中来自植物残体碳的含量，单位为mg kg

步骤九、计算植物残体输入后新形成的微生物残体占土壤有机碳的比例，其计算公式为：

C＝(F

式中C为新形成的微生物残体占土壤有机碳的比例，单位为％，SOC为土壤有机碳含量，单位为mg kg

为了进一步验证本发明的可行性，以下以具体实例进行分析。

图2为磷脂脂肪酸中来自植物残体碳的比例。从图2中可以发现植物残体类型是影响活体微生物同化外源碳的重要因素。在大部分时间内，植物地下部分残体碳对微生物磷脂脂肪酸的贡献高于植物地上部分残体碳。此外，植物地下和地上残体碳对微生物磷脂脂肪酸的贡献随时间呈现出不同的动态：其中地下部分残体碳所占比例在90天前下降，随后迅速迅速上升并在150天达到峰值，之后再次下降；而地上部分残体碳所占比例随时间持续下降。

图3为氨基糖中来自植物残体碳的比例。由图3可知，植物残体碳对土壤氨基糖的贡献随时间显著上升，说明外源有机碳会不断的以微生物残体的形式在土壤中累积。并且150天前以地上部分残体碳对氨基糖的贡献更大，而150天后以地下部分残体碳对氨基糖的贡献更大。

图4和图5分别为土壤中真菌残体源碳和细菌残体源碳含量。从图中可以看出，真菌源残体碳的含量明显高于细菌源残体碳。此外，在植物残体输入后，微生物残体碳含量随时间波动明显；试验结束时，微生物残体碳均以添加地下部分植物残体的处理更高。

图6和图7分别为真菌残体源碳和细菌残体源碳中来自植物残体碳的含量。从图中可以看出，在试验的前期，真菌残体源碳和细菌残体源碳中来自植物残体碳的含量差异不大；而在试验后期，真菌残体源碳中来自植物残体碳的含量明显高于细菌残体源碳，证明真菌是将植物残体碳转化为土壤有机质的主要贡献者。

图8为活体微生物量转化为微生物死亡残体的相对效率。由图8可知，添加植物残体后，活体微生物量转化为微生物死亡残体的相对效率在90天前持续下降，之后随时间明显上升。而不同类型植物残体之间并未出现明显的差异。

图9为植物残体碳由活体微生物转移到微生物死亡残体的相对效率。由图9可知，添加地上部分植物残体的处理中，外源有机碳由活体微生物转移到微生物死亡残体的相对效率明显高于添加地下部分植物残体的处理。且所有处理中的转化效率随时间均明显增加。

图10为新形成的微生物残体占土壤有机碳的比例。从图10可以看出，所有处理中新形成微生物残体占土壤有机碳的比例随时间均明显增加，证明微生物残体的形成是土壤有机质形成的重要途径。此外，在150天前，添加地上部分植物残体处理中新形成的微生物残体占土壤有机碳的比例高于添加地下部分植物残体处理，而在150天后则呈现出相反的规律。

本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。