马来西亚链霉菌F913的应用

技术领域

本发明涉及病害防治领域，特别是涉及马来西亚链霉菌F913的应用。

背景技术

目前动植物的病原真菌，例如粉棒束孢(Isariafarinosa)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、黄瓜炭疽菌(Colletotrichum lagenarium)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和腐皮镰刀菌(Fusarium solani)等的防控手段以化学防治为主，另辅以物理防治、农艺防治以及抗性育种等多种防控手段。尽管化学农药在短期内能够有效防控这些病原真菌的发生，但长期使用这些化学药品极易引发环境污染、果体农药残留、病原菌产生耐药性等一系列弊端；物理和农艺防治手段存在耗时耗力且防效有限等问题；而很多动植物病原真菌抗性品种的改良在短时间内亦很难获得突破性进展。近几年来，随着人们环保意识的加强和对绿色食品需求的日益重视，利用微生物进行动植物病害的生物防治法越来越受人关注。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了马来西亚链霉菌F913的应用。采用本发明提供的菌株能够避免出现环境污染、果体农药残留、诱导病原菌产生耐药性的情况，并且防效极佳且省时省力。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了马来西亚链霉菌F913在防治动植物病原真菌中的应用。

优选的，所述动植物病原真菌中的动物病原真菌包括粉棒束孢。

优选的，所述动植物病原真菌中的植物病原真菌包括大丽轮枝菌、黄瓜炭疽菌、立枯丝核菌、绿色木霉、腐皮镰刀菌和烟草疫霉菌。

本发明提供了一种防治动植物病原真菌的菌剂，所述菌剂的有效成分包括马来西亚链霉菌F913。

优选的，所述动植物病原真菌中的动物病原真菌包括粉棒束孢；所述动植物病原真菌中的植物病原真菌包括大丽轮枝菌、黄瓜炭疽菌、立枯丝核菌、绿色木霉、腐皮镰刀菌和烟草疫霉菌。

有益效果：本发明提供了马来西亚链霉菌F913在防治动植物病原真菌中的应用。采用本发明提供的菌株能够避免出现环境污染、果体农药残留、诱导病原菌产生耐药性的情况，并且防效极佳、省时省力。本发明所述马来西亚链霉菌F913菌株能够有效防治动植物病原真菌。

生物保藏说明

本发明所述马来西亚链霉菌(Streptomyces malaysiensis)F913，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年10月22日，保藏编号为CGMCC No.20941。

附图说明

图1为实施例1中马来西亚链霉菌F913的形态特征图片；

图2为实施例3马来西亚链霉菌F913的系统发育树；

图3为实施例4不同培养基对马来西亚链霉菌F913发酵液的抑菌效果的影响图；其中A为高氏合成一号培养基对马来西亚链霉菌F913发酵液的抑菌效果的影响图，B为SP培养基对马来西亚链霉菌F913发酵液的抑菌效果的影响图，C为ISP培养基1号对马来西亚链霉菌F913发酵液的抑菌效果的影响图，D为ISP培养基2号对马来西亚链霉菌F913发酵液的抑菌效果的影响图，E为黄豆粉培养基对马来西亚链霉菌F913发酵液的抑菌效果的影响图，F为不同培养基对马来西亚链霉菌F913发酵液的抑菌效果的柱形图，G为不同培养基中菌体生长情况，且G中的Ⅰ为高氏合成一号培养基，Ⅱ为SP培养基，Ⅲ为ISP培养基1号，Ⅳ为ISP培养基2号，Ⅴ为黄豆粉培养基；

图4为实施例5不同发酵时间、发酵温度和培养基初始pH值对马来西亚链霉菌F913发酵液的抑菌效果的影响图；其中a为不同发酵时间对马来西亚链霉菌F913发酵液的抑菌效果的影响图，b为不同发酵温度对马来西亚链霉菌F913发酵液的抑菌效果的影响图，c为培养基不同初始pH值对马来西亚链霉菌F913发酵液的抑菌效果的影响图；

图5为实施例6马来西亚链霉菌F913对植物病原菌抑制直径；

图6为实施例7马来西亚链霉菌F913对动物病原菌拮抗效果检测图。

具体实施方式

本发明提供了马来西亚链霉菌F913在防治动植物病原真菌中的应用。在本发明中，所述动植物病原真菌中的动物病原真菌优选包括粉棒束孢；所述动植物病原真菌中的植物病原真菌优选包括大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、黄瓜炭疽菌(Colletotrichum lagenarium)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、绿色木霉(Trichoderma viride)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)和烟草疫霉菌(Phytophthoranicotianae)。

采用本发明提供的马来西亚链霉菌F913能够避免出现环境污染、果体农药残留、诱导病原菌产生耐药性的情况，并且防效极佳、省时省力。

本发明提供了一种防治动植物病原真菌的菌剂，所述菌剂的有效成分包括马来西亚链霉菌F913。在本发明中，所述动植物病原真菌中的动物病原真菌优选包括粉棒束孢；动植物病原真菌中的植物病原真菌优选包括大丽轮枝菌、黄瓜炭疽菌、立枯丝核菌、绿色木霉、腐皮镰刀菌和烟草疫霉菌。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的马来西亚链霉菌F913在防治动植物病原真菌中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

称取采集的西南大学景观池塘土壤样品10g，放入含有90mL无菌水(带有少量玻璃珠)的三角瓶中，充分振荡30min。用移液枪吸取1mL土壤悬浮液混入9mL无菌生理盐水中，充分摇匀。再用移液枪从此试管中吸取1mL土壤悬浮液混入另一支含有9mL无菌生理盐水中，以相同的方式制成浓度为10

对马来西亚链霉菌F913进行形态特征测定。

形态特征：菌落初期为白色，随着孢子的形成，菌落逐渐转变为灰白色，菌落最终颜色为灰色，不产生水溶性色素，马来西亚链霉菌F913的气生菌丝较发达，孢子丝呈螺旋形，如图1所示。

实施例2

对马来西亚链霉菌F913进行生理生化检测，检测结果见表1。

表1马来西亚链霉菌F913生理生化指标

注：“+”表示试验反应为阳性；“-”表示试验反应为阴性。

结果如表1所示，马来西亚链霉菌F913 L-阿拉伯糖为阳性，D-木糖为阳性，D-果糖为阳性，L-鼠李糖为阳性，D-甘露醇为阳性，L-肌醇为阳性，蔗糖为阳性，棉子糖为阳性，明胶液化为阴性，牛奶凝固与胨化为阳性，淀粉水解为阳性，纤维素水解为阴性，H

实施例3

通过对马来西亚链霉菌F913的16SrDNA序列的扩增、测序，获得该基因1391bp的序列，提交该序列至GenBank数据库，其登录号为KP338102。将该序列与GenBank中的序列进行在线比对，结果表明其与多株Streptomyces malaysiensis的16SrDNA基因序列同源性高达100％，基于16S rDNA的系统发育结果表明马来西亚链霉菌F913与登录号为NR041410的Streptomyces malaysiensis NBRC 16446菌株在系统发育树中处于同一最小分支，结果见图2。

实施例4

不同培养基对马来西亚链霉菌F913发酵液的抑菌效果的影响。

马来西亚链霉菌F913发酵种子液制备：

马来西亚链霉菌F913接种于MS固体培养基，30℃培养7d，用0.05％Tween-20收集孢子制成孢子悬液；再将孢子悬液转接至含100mL高氏合成一号液体培养基的1L锥形瓶中，30℃，200rpm，培养3d。

发酵培养基对马来西亚链霉菌F913发酵液抑菌效果的影响：

按照1％的接种量将制备的种子液分别接种于高氏合成一号培养基(可溶性淀粉20g、KNO

每组3个重复；采用抑菌圈法测定发酵上清液的拮抗昆虫病原真菌粉棒束孢的效果。结果如图3和表2所示。

表2不同发酵培养基对马来西亚链霉菌F913的抑菌圈直径

由图3和表2记载的可知，产生的发酵液均具有拮抗作用，但不同培养基发酵所得的发酵液拮抗效果不同。发酵培养基为SP培养基、ISP培养基1号、ISP培养基2号三种培养基时，发酵液的拮抗效果最好，高氏合成一号培养基次之，黄豆粉培养基最差；但以SP培养基进行发酵时，沉淀物质较多，不利于后期发酵液处理，因此，最终确定ISP培养基2号为最优培养基。

实施例5

不同发酵时间、发酵温度和培养基初始pH值对马来西亚链霉菌F913发酵液的抑菌效果的影响。

发酵时间对马来西亚链霉菌F913发酵液抑菌效果的影响

按照1％的接种量将实施例4制备的种子液接种于ISP培养基2号中，装液量均为200mL(1L锥形瓶)，30℃，200rpm，分别发酵3d、5d、7d、9d；每组3个重复；采用抑菌圈法测定发酵上清液的抑菌效果。结果如图4a和表3所示。

表3不同发酵时间对马来西亚链霉菌F913的抑菌圈直径

发酵温度对马来西亚链霉菌F913发酵液抑菌效果的影响

按照1％的接种量将制备的种子液分别接种于ISP培养基2号，装液量为200mL(1L锥形瓶)，分别置于20℃、25℃、30℃、35℃，200rpm，发酵7d；每组3个重复；采用抑菌圈法测定发酵上清液的抑菌效果。结果如图4b和表4所示。

表4不同发酵温度对马来西亚链霉菌F913的抑菌圈直径

培养基初始pH值对马来西亚链霉菌F913发酵液抑菌效果的影响

用0.4mol/LNaOH溶液或0.4mol/L HCl溶液，将ISP培养基2号初始pH值分别调节为5、6、7、8、9；再按照1％的接种量接种，装液量为200mL(1L锥形瓶)，30℃，200rpm，发酵7d；每组3个重复；采用抑菌圈法测定发酵上清液的抑菌效果。结果如图4c和表5所示。

表5发酵培养基不同初始pH对马来西亚链霉菌F913的抑菌圈直径

由图4和表3～5可知：当发酵培养基为ISP培养基2号，发酵7d、9d时，发酵液的拮抗效果最好，发酵3d、5d次之，因此确定最优发酵时间为7d(图4中a)。马来西亚链霉菌F913在20℃、25℃、30℃、35℃下发酵培养，产生的发酵液均有拮抗活性，但不同温度下抑菌效果不同(图4中b)。20℃和25℃培养后的抑菌效果较差；30℃和35℃培养后的抑菌效果较好且无明显差异，因此选择培养温度为30～35℃。将培养基的初始pH值分别调节为5、6、7、8、9，用抑菌圈法测定发酵液的拮抗活性；结果表明，当初始pH值为5时，菌株F913几乎不产生抑菌活性物质，当培养基初始pH值为6～9时，马来西亚链霉菌F913能够产生抑菌活性物质，且当培养基初始pH值为7时，产生抑菌活性物质能力最强，发酵液拮抗效果最好(图4中c)。

实施例6

实验方法：采用菌丝生长速率法检测菌株F913发酵上清液的抗菌效价。

将无菌发酵上清液以1:10的比例，与冷却至55℃的灭菌PDA培养基混匀，即本实施例采用2ml上清液混合20ml培养基，以未加发酵上清液的PDA平板作为空白对照，接入直径为5mm的病原菌菌饼，每个处理3个重复，于22℃恒温培养，逐日观察与比对实验组与对照组的病原菌生长直径，其中病原真菌包括：植物病原菌大丽轮枝孢(Verticillium dahliae，V.dahliae)、黄瓜炭疽菌(Colletotrichum lagenarium，C.lagenarium)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani，R.solani)、绿色木霉(Trichoderma viride，T.viridae)、腐皮镰刀菌(Fusariumsolani，F.solania)和烟草疫霉菌(Phytophthora nicotianae，P.nicotianae)。

具体方法是利用打孔器在生长5d的真菌菌苔上打5mm菌饼放到抑制平板上，采用抑制指数来表示效果。检测结果见表6和图5。

其中，抑制指数的公式为：抑制指数＝1-Da/Db(Da:抑制平板上菌落直径.Db:对照平板上的菌落直径)，式Ⅰ。

表6第6d马来西亚链霉菌F913株的真菌抑制指数

由表6和图5可知，本发明提供的马来西亚链霉菌F913对大丽轮枝菌、黄瓜炭疽菌、立枯丝核菌、绿色木霉、腐皮镰刀菌和烟草疫霉菌均有较好的抑制率。

实施例7

本实施例为检测马来西亚链霉菌F913在土壤中对粉棒束孢的拮抗效果，设计了两组实验：

采集的土样除去大颗粒石块，过筛，65℃烘箱处理过夜。土壤冷却后，添加马来西亚链霉菌F913以及粉棒束孢孢悬液，添加浓度为10

一组：先加入马来西亚链霉菌F913悬液，一周后再加入粉棒束孢If悬液(F913--If)，以ddH

二组：先加入粉棒束孢If悬液，一周后加入马来西亚链霉菌F913悬液(If--F913)，以ddH

方法为：

运用涂布计数的方式统计F913--If、ddH

表7不同培养方式和培养时间粉棒束孢的cfu数据

由表7和图6记载的实验结果表明，在土壤环境中，先加入马来西亚链霉菌F913，再加入粉棒束孢(F913--If)的情况下，粉棒束孢数量整体呈持续下降趋势，且明显低于对照组(ddH

由上述实施例记载的可知，采用本发明提供的马来西亚链霉菌F913能够显著抑制大丽轮枝菌、黄瓜炭疽菌、立枯丝核菌、绿色木霉、腐皮镰刀菌、烟草疫霉菌和粉棒束孢，并且能够避免出现环境污染、果体农药残留和诱导病原菌产生耐药性的情况，省时省力。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。