人端粒长度检测试剂盒及非诊断目的的检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学检测技术领域，特别涉及一种人端粒相对长度检测试用试剂盒，及利用该试剂盒检测人端粒长度的非诊断目的的检测方法。

背景技术

目前，测定端粒长度的实验方法多种多样。其中，Southern Blot技术虽然是端粒长度测定领域的“金标准”，但由于该方法样本量需求大、操作复杂、实验繁琐、对实验员的技术要求较高；PCR定量法因操作便捷、测定时间短，可广泛应用于人群研究，但是大部分研究采用的是分别定量单拷贝基因和端粒基因，然后根据2

为了降低不同反应孔多次移液加样带来的系统误差，已有学者提出了改进的荧光定量PCR检测方法，在一组反应、同一反应孔中同时收集端粒(T)信号和单拷贝基因(S)信号。

即便如此，利用现有的荧光定量PCR检测端粒长度时，检测结果准确性仍然有待提高。因此有必要从多个方面优化用于检测端粒长度的荧光定量PCR方案，以显著提升其检测准确性。

发明内容

鉴于上述背景，本发明一方面的目的在于：提供一种优化的用于人端粒长度检测的荧光定量PCR检测方法。

本发明另一方面的目的在于：提供一种可以用于本发明上述人端粒长度检测方法的试剂盒。

本发明的上述目的通过以下技术方案实现：

首先，提供一种非诊断目的的人端粒相对长度检测方法，包括：提取待测样本基因组DNA，以来自不少于3000个人的全血DNA混合样品作为标准品，待测样本基因组DNA和标准品分别利用单色多重荧光定量PCR(MMQPCR)方法进行检测，并通过PCR反应收集端粒荧光信号(T)和单拷贝基因荧光信号(S)；其中，标准品以涵盖所述待测样本基因组DNA浓度的标准系列浓度进行检测，得到T/S比值标准曲线，基于所述标准曲线和待测样本基因组DNA检测得到的T/S比值计算得到待测样本的人端粒相对长度；

其中，MMQPCR方法检测的单拷贝基因为白蛋白(ALB)基因，作为内参基因；所述的PCR反应使用的引物序列如下：

本发明所述的检测方法中，所述标准品的标准系列浓度来自一个可涵盖所述待测样本基因组DNA浓度的浓度值范围，例如，该浓度值范围可以是从待测样本基因组DNA浓度的0.0625倍到10倍。检测时可以将所述标准品配制成该范围中相对均匀分布的一系列具体浓度，这一系列具体浓度中可以包含或不包含所述待测样本基因组DNA浓度；优选的方案中，为了提高标准曲线的参考性，所述的标准品的标准系列浓度取值由不少于5个数的等比数列构成，且大于和小于所述待测样本基因组DNA浓度的数值均不少于2个。

本发明优选的所述检测方法中，在所述的PCR反应中，将待测样本基因组DNA和不同浓度的标准品分别与扩增反应试剂混合形成反应体系进行扩增反应；其中，按体积百分比计，待测样本基因组DNA和标准品加入量占所述反应体系的5％～10％；所述的扩增反应试剂包括实时定量PCR扩增的预混合溶液、参比染料、端粒基因引物(telg、telc)、内参基因引物(albu、albd)及无菌无酶水；并控制每10μL的所述反应体系中含有10μM的telg引物0.36μL、10μM的telc引物0.36μL、10μM的albu引物0.06μL、10μM的albd引物0.06μL、1μL的待测样本DNA或标准品DNA。

本发明优选的检测方法中，所述的PCR反应程序设置如下：

Stage 1(hold stage)：1cycle：94℃15min；

Stage 2(PCR stage1)：2cycle：94℃15s；49℃15s；

Stage 3(PCR stage2)：40cycle:94℃15s；62℃10s；74℃30s-收集荧光(tel)；84℃10s；88℃30s-收集荧光(alb)。

本发明优选的检测方法中，所述的标准品来源的人群年龄跨度为20～50岁。

此外，本发明还提供一种用于检测人端粒长度的试剂盒，其中的试剂由标准品、引物、实时定量PCR扩增的预混合溶液、参比染料和无菌无酶水组成；所述的标准品是来自不少于3000个人的全血DNA混合样品；所述的引物由第一引物、第二引物、第三引物和第四引物组成；所述的第一引物为10μM的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的端粒基因的上游引物，所述的第二引物为10μM的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的端粒基因的下游引物，所述的第三引物为10μM的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的单拷贝基因(白蛋白)的上游引物，所述的第四引物为10μM的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的单拷贝基因(白蛋白)的下游引物；所述的第一引物和第二引物的体积相同，均为所述第三引物或第四引物体积的至少6倍。

本发明优选的试剂盒中，所述的实时定量PCR扩增的预混合溶液是内含反应缓冲液、

本发明优选的试剂盒中，所述的参比染料是50×ROX reference dye。

本发明优选的试剂盒中，所述的实时定量PCR扩增的预混合溶液体积是所述的参比染料体积的至少500倍，优选900倍。

本发明所述的试剂盒用于人端粒长度检测时，可先根据待测样本DNA的浓度将所述标准品稀释配置成一系列浓度的标准品试剂，形成标准系列浓度梯度，使待测样本DNA的浓度包含于标准系列浓度梯度涵盖的范围内，然后根据既定的加样量将四种引物、实时定量PCR扩增的预混合溶液、参比染料及无菌无酶水与各浓度的标准品和待测样本分别混合形成扩增反应体系，进行PCR反应。

与现有技术相比，本发明的人端粒长度检测方法具有以下几方面有益效果：

1.标准品出峰稳定

标准品端粒和单拷贝基因(白蛋白)的标准系列出峰稳定，熔解曲线光滑，凝胶电泳条带图中无明显非特异性扩增产物。

2.选择了更稳定的单拷贝基因并设计了合适的引物，显著改善了MMQPCR的荧光收集效果。

与现有技术中其他利用荧光定量PCR的端粒长度检测方法相比，本发明中选择的内参基因ALB是稳定性更高的单拷贝基因。在此基础上，本发明使用的单拷贝基因ALB的引物序列比常规引物增加了富含GC-clamp的序列，能够显著提高单色多重荧光定量PCR单拷贝基因的Tm值，使得样本进行单色多重荧光定量PCR时，端粒和单拷贝基因不存在荧光收集重叠情况。

3.通过优化引物的配比，显著缩小了PCR熔解曲线中端粒基因和单拷贝基因两个峰的峰值差异。

本发明检测方法提出过程中，发明人经过大量实验筛选得到了优化的引物浓度和引物PCR上样量，使得引物在反应体系中最终达到了特定的配比，实验结果表明，一方面，在本发明特定的引物配比条件下，PCR反应能够使扩增效率保持在90.00％～110.00％的同时获得更加理想的(>0.990的)标准曲线线性R

4.本发明PCR反应程序的设置有利于有效收集两个基因的信号，减少互相干扰。

本发明PCR反应程序在较早的循环中，PCR温度处于74℃时，端粒基因的Ct值已经被收集完成，而此时单拷贝基因的信号仍处于基线，在88℃时，此时采集了单拷贝基因的Ct值，而端粒PCR产物由于已经全部熔解，已经收集不到信号了，减少了信号干扰。

总之，本发明的人端粒长度检测方法和试剂盒在上述几方面改进的共同作用下，得到了良好的综合效果，不仅使人端粒长度的检测获得了更高的准确性，而且检测过程操作简单、系统误差小，需要的待测样本加样量和试剂量均显著下降(每10～20μL的反应体系仅需1μL的10ng/μL的待测样本DNA)，因此适用于大样本数量、大年龄跨度人群的快速检测。

附图说明

图1是实施例2检测方法中标准品的标准系列中单拷贝基因(白蛋白)的扩增曲线图。

图2是实施例2检测方法中标准品的标准系列中端粒基因的扩增曲线图。

图3是实施例2检测方法所得熔解曲线图，图中左峰为端粒信号，右峰为内参基因信号。

图4是实施例2检测方法的凝胶电泳效果图。

具体实施方式

以下通过列举实施例的方式进一步详细说明本发明，但本发明的方案不限于以下实施例。

实施例1

一种用于人端粒长度检测的试剂盒

本试剂盒内共有8支产品，具体包括：

1、标准品1支

DNA浓度为50ng/μL，样本来自于3000人份的全血DNA混样(年龄20～50岁)。

2、引物4支

分别包括端粒和单拷贝基因(白蛋白)的上、下游引物(按管身提示加入相应体积的ddH

3、SYBR qPCR mix 1支

内含反应缓冲液、

4、50×ROX reference dye 1支

5、ddH

实施例2.

一种非诊断目的的人端粒相对长度检测方法，使用实施例1所述的试剂盒，包括以下步骤：

1.提取待测基因组DNA，配制浓度为10ng/μL的待测样品；

2.取试剂盒中的标准品，根据待测DNA样品的浓度配制标准系列梯度，使样本DNA浓度包含于标准系列浓度中(例如配制40，20，10，5，2.5，1.25ng/ul组成的标准系列梯度)。

3.将待测基因组DNA和标准品分别利用单色多重荧光定量PCR(MMQPCR)方法进行检测，MMQPCR以白蛋白(ALB)基因作为内参基因，使用所述试剂盒中的引物；加样方法具体是根据下表1或表2的加样量将待测样品/标准品和试剂盒中的各试剂加入同一反应孔内进行反应。

表1

表2

上述PCR反应程序的设置如下：

Stage 1(hold stage)：1cycle：94℃15min；

Stage 2(PCR stage1)：2cycle：94℃15s；49℃15s；

Stage 3(PCR stage2)：40cycle:94℃15s；62℃10s；74℃30s-收集荧光(tel)；84℃10s；88℃30s-收集荧光(alb)；

通过上述PCR反应收集得到待测样品DNA及各浓度标准品的端粒荧光信号(T)和单拷贝基因荧光信号(S)；

4.基于所得的标准品端粒荧光信号(T)和单拷贝基因荧光信号(S)得到T/S比值标准曲线，基于所述标准曲线和待测样本基因组DNA检测得到的T/S比值计算得到待测样本的人端粒相对长度。

检测效果

本实施例检测结果显示，使用实施例1的试剂盒、采用本实施例的检测方法，得到的标准品端粒和单拷贝基因(白蛋白)的标准系列出峰稳定(参见图1、图2)，熔解曲线光滑且双峰差异不大(参见图3)，凝胶电泳条带图中无明显非特异性扩增产物(参见图4)。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所

<120> 人端粒长度检测试剂盒及非诊断目的的检测方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acactaaggt ttgggtttgg gtttgggttt gggttagtgt 40

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cggcggcggg cggcgcgggc tgggcggaaa tgctgcacag aatccttg 48

<210> 4

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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