快速分型检测HPV16型和HPV18型病毒的引物组、试剂盒及分析方法

技术领域

本发明涉及免疫学领域，尤其涉及一种快速分型检测HPV16型和HPV18型病毒的引物组、试剂盒及分析方法。

背景技术

开展宫颈癌筛查可以有效降低宫颈癌的发病率和死亡率。在北美、澳大利亚及欧洲等已有完善筛查制度的国家或地区，宫颈癌的发病率和死亡率均明显下降。而在发展中国家，子宫颈癌的发病率和死亡率却没有明显改善。

我国是世界上最大的发展中国家，开展大规模宫颈癌筛查对提高人类质量具有重要的推动作用。大多数的宫颈癌是由人乳头瘤病毒(HPV)引起。根据致病性大小HPV可以分为高危型和低危型。约99.7％的宫颈癌是由高危型人乳头瘤病毒持续或反复感染所致。因此HPV核酸的检测在宫颈癌的早期筛查中扮演着重要的角色，很大程度上提升了宫颈癌和癌前病变的检出率。其中HPV感染率最高的为HPV16、18型，约占宫颈癌的70％，另外一项持续10年的统计不同高危型别HPV感染后≥CIN2病变累积发病率的研究，证实基线筛查时HPV16或18阳性，10年后高度病变的累积发病率明显高于其它型别感染或HPV阴性者，因此HPV16/18分型包含在HPV初筛中对风险分层的管理意义重大。

常见的HPV检测方法有DNA杂交捕获法-HC-II，采用分子杂交和化学发光信号放大的原理，无需基因扩增，属于线性级数放大，可检测13种HPV高危型别但不分型，但操作繁琐，耗时长，易产生交叉污染，成本费用较高；PCR荧光技术，采用升降温方式，收集荧光，可单管检测多种型别。虽然操作相对简单，但整个扩增也需要1-2小时完成，时间长，且信号的收集需要依靠昂贵的PCR仪，对仪器的操作也需要经过培训的专业人员，无法实现即时检测及床旁诊断。随着DNA扩增技术发展，也出现了恒温扩增方式，虽然在扩增时间上有所突破，但大部分仍需要荧光分析仪对结果进行收集分析，且不能对HPV进行准确分型，灵敏度和特异性也均不能满足临床需求。如基于恒温扩增技术的有专利CN110387436A，利用恒温(60℃)扩增技术扩增模板，通过机器收集荧光信号检测HPV 15种高危型别，但耗时长，需要1.5小时；专利CN110396557A，基于CRISPR_Cas12a及RPA技术富集模板，也是靠收集荧光信号判断阴阳性；专利CN111073997A，常温扩增后，通过免疫层析试纸条对结果进行判断，但不能将HPV16和18进行分型。

因此亟待一种能够即时、简便、准确的核酸检测方法对HPV病毒进行检测和分型。

发明内容

为了解决现有技术的问题，一方面，本发明提供了一种快速分型检测HPV16型和HPV18型病毒的引物组，为选择HPV16型和HPV18型的L1区设计特异的RPA引物组，所述RPA引物组的核酸序列包括：

通用上游引物F:5’-GAATATGATTTACAGTTTATTTTTCAGCTGTG-3’；

通用下游引物R:5’-FAM-ATTTAAAGGAAAAGTTTTCTGTAGACCTAGATCA-3’；

使用特异性的探针对通用引物进行区分，并对其进行不同标记，其中通用下游引物R的序列5端用FAM标记，HPV16型探针序列5端标记生物素，3端用C3 spacer进行封闭，中间距离3端15个碱基处使用四氢呋喃进行处理；HPV18型探针序列5端标记地高辛，3端用C3spacer进行封闭，中间距离3端15个碱基处使用四氢呋喃进行处理，具体的引物组序列及其标记如下：

16P:Biotin-AACATCCCAGGCAATTGCTTGTCAAAAACA/THF/ACACCTCCAGCACCT-C3Spacer；

18P:Dig-ACAATCTGTTGCTATTACCTGTCAAAAGGA/THF/GCTGCACCGGCTGAA-C3 Spacer。

作为本发明实施方式的进一步改进，所述HPV16型和HPV18型的L1区的具体区域分别为ID为MN961217.1的HPV16型基因组的6746bp-6949bp位和ID为LC509006.1的HPV18型基因组的6720bp-6923bp位。

另一方面，本发明还公开了一种快速分型检测HPV16型和HPV18型病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组。

作为本发明实施方式的进一步改进，所述快速分型检测HPV16型和HPV18型病毒的试剂盒包括核酸提取试剂、RPA扩增总反应体系和双标记的胶体金免疫层析试纸条；所述双标记的胶体金免疫层析试纸条包括PVC背衬板及在所述PVC背衬板上依次按预设顺序装配的样品垫、纳米金颗粒结合垫、硝酸纤维素膜层和吸水垫；所述硝酸纤维素膜层上设有喷涂链霉亲和素的第一检测线、喷涂抗地高辛抗体的第二检测线和喷涂第二抗体的质控线；所述纳米金颗粒结合垫上具有胶体金标记抗FAM抗体。

作为本发明实施方式的进一步改进，所述的快速分型检测HPV16型和HPV18型病毒的试剂盒，所述RPA扩增总反应体系体积为50μL，包括280mM醋酸镁2.5μL，模板4μL，溶解剂29.5μL，引物和探针体积合计6μL，其中通用上游引物和通用下游引物均为2μL，HPV16型探针和HPV18型探针各1μL，余量为蒸馏水。

又一方面，本发明还公开了一种快速分型检测HPV16型和HPV18型病毒的试剂盒的分析方法，所述分析方法流程如下：

S1、待检样本中核酸的释放或提取；

S2、以处理过的所述待测样本为模板，使用RPA恒温扩增方法对模板进行扩增，得到RPA扩增产物；

S3、使用双标记的胶体金免疫层析试纸条对所述RPA扩增产物进行检测，根据试纸条上条带的有无对阴阳性进行判断及具体型别的鉴定。

作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S1中待检样本中核酸的释放或提取采用的是一步法核酸提取试剂，对核酸进行快速释放，形成待扩增模板。

作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S1之前还包括将质控品用生理盐水稀释至相应浓度后，采用的是一步法核酸提取试剂，进行核酸释放，形成待扩增模板，形成对照组。作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S2中采用的RPA扩增总反应体系体积为采用的RPA扩增总反应体系体积为50μL,包括280mM醋酸镁2.5μL，模板2-10μL，溶解剂29.5μL，10μM通用上样引物0.5-5μL，10μM通用下游引物0.5-5μL，10μM HPV16型探针0.1-2μL，10μMHPV18型探针各0.1-2μL，余量为蒸馏水。

作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S2具体包括：先将4μL模板、29.5μL溶解剂、6μL引物和探针、蒸馏水加入到RPA冻干酶复合物的反应管中混合均匀，将醋酸镁加在管盖上，盖上管盖后瞬时离心，将醋酸镁离心至管中启动RPA反应，整个反应在27-42℃之间，反应时长为5-30min。

作为本发明实施方式的进一步改进，所述步骤S3具体包括：

将所述RPA扩增产物用PBST稀释20倍形成扩增产物溶液，在所述扩增产物溶液中插入双标记的胶体金免疫层析试纸条，5-10min后取出双标记的胶体金免疫层析试纸条进行观察。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明克服了现有技术的不足，满足临床对HPV16和18型分型的需求，提供了一种可快速检测HPV16型和18型病毒核酸的引物组与探针序列，及其含有该序列的检测试剂盒及分析方法，这是首次采用多重RPA技术对HPV病毒进行检测并对感染率最高的HPV16型和18型进行鉴定；

2、本发明通过一步法快速释放核酸，以此核酸为模板，以能同时扩增HPV16型和18型的特异性序列的引物组为引物，结合RPA快速扩增系统对模板进行扩增，最后通过双重标记的免疫层析试纸条对结果进行判断，可确定待测样品中是否感染HPV16型和18型，并能准确分型；

3、本发明的灵敏度高，对HPV16型和HPV18型病毒最低可检测到500copies/mL，优于市面上的恒温检测产品，其灵敏度与PCR相当；

4、本发明的特异性高，本发明在设计引物探针时特异性的选择其保守序列，覆盖度高，特异性强；

5、对设备及人员要求低，本发明选择对温度要求极低的恒温扩增技术组合胶体金免疫层析技术对人乳头瘤病毒进行检测，整个流程无需特殊加热设备及检测设备，常温即可实现(27-42℃)，对人员也无任何要求，操作简便，快速，可应用于基层及大规模筛查使用；

6、本发明中的解决方案为本行业中其他病原体的检测提供了试验依据和技术参考。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的所述双标记的胶体金免疫层析试纸条的结构示意图；

图2是本发明实施例提供的所述双标记的胶体金免疫层析试纸条的检测原理示意图；

图3为本发明具体例1提供的HPV16型和18型RPA扩增反应检测结果图；

图4为本发明具体例2提供的HPV16型和18型RPA双模板扩增反应检测结果图；

图5为本发明具体例3提供的生殖道其他常见病原体扩增反应检测结果图；

图6为本发明实施例提供的分型检测HPV16型和HPV18型的微流控检测装置原理图；

图中示例表示为：

1-样品垫；2-纳米金颗粒结合垫；3-喷涂链霉亲和素的第一检测线；4-喷涂抗地高辛抗体的第二检测线；5-喷涂第二抗体的质控线；6-吸水垫；7-硝酸纤维素膜层；8-PVC背衬板；9-FAM-生物素双标产物；10-抗FAM抗体；11-FAM-地高辛双标产物；12-加样孔；13-核酸释放剂仓；14-RPA反应液仓；15-第一仓室；16-稀释液仓；17-第二仓室；18-试纸条放置仓。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本发明实施例提供了一种快速分型检测HPV16型和HPV18型病毒的引物组，为选择HPV16型和HPV18型的L1区设计特异的RPA引物组，RPA引物组的核酸序列包括：

通用上游引物F:5’-GAATATGATTTACAGTTTATTTTTCAGCTGTG-3’；

通用下游引物R:5’-FAM-ATTTAAAGGAAAAGTTTTCTGTAGACCTAGATCA-3’；

使用特异性的探针对通用引物进行区分，并对其进行不同标记，其中通用下游引物R的序列5端用FAM标记，HPV16型探针序列5端标记生物素，3端用C3 spacer进行封闭，中间距离3端15个碱基处使用四氢呋喃进行处理；HPV18型探针序列5端标记地高辛，3端用C3spacer进行封闭，中间距离3端15个碱基处使用四氢呋喃进行处理，具体的引物组序列及其标记如下：

16P:Biotin-AACATCCCAGGCAATTGCTTGTCAAAAACA/THF/ACACCTCCAGCACCT-C3Spacer；

18P:Dig-ACAATCTGTTGCTATTACCTGTCAAAAGGA/THF/GCTGCACCGGCTGAA-C3 Spacer。

其中，HPV16型和HPV18型的L1区的具体区域分别为ID为MN961217.1的HPV16型基因组的6746bp-6949bp位和ID为LC509006.1的HPV18型基因组的6720bp-6923bp位。

在本发明实施例中，引物和探针合成由上海生工生物有限公司合成，其中通用下游引物5端FAM,HPV16型探针5端标记生物素，3端用C3spacer封闭，中间距离3端16个碱基出用四氢呋喃代替；HPV18型探针5端标记地高辛，3端用C3spacer封闭，中间距离3端16个碱基出用四氢呋喃代替。引物探针合成后进行稀释定量至10μM。

引物的设计与筛选主要步骤包括：

首先下载GeneBank中公布的人乳头瘤病毒各高危型序列，使用DNAMAN进行序列比对，找到相对保守的区域为基因组的L1区，选择HPV16型和18型最保守的区域设计通用的上游引物和探针，由于RPA对碱基错配具有较高的耐受性，因此可允许有个别碱基的错配。下游引物设计时则选择在HPV16型和HPV18型最为特异的区域，此区域相对于其他高危型别也很特异。引物探针设计原则根据TwistDx Inc公司官网公布的原则进行。引物和探针均由上海生工生物工程有限公司合成。

实施例2

本发明实施例还公开了一种快速分型检测HPV16型和HPV18型病毒的试剂盒，试剂盒包括上述的引物组，具体包括RPA引物组的通用上下游引物和标记。

快速分型检测HPV16型和HPV18型病毒的试剂盒还包括RPA扩增总反应体系和双标记的胶体金免疫层析试纸条。

试剂盒中的RPA扩增总反应体系购自英国TwistDx Inc公司的TwistAmp Liquidnfo Kit，RPA扩增总反应体系体积为50μL，包括280mM醋酸镁2.5μL，模板4μL，溶解剂29.5μL，引物和探针体积合计6μL，其中通用上游引物和通用下游引物均为2μL，HPV16型探针和HPV18型探针各1μL，余量为蒸馏水。

在本发明实施例中，双标记的胶体金免疫层析试纸条的制备过程如下：

(1)胶体金制备：按柠檬酸三钠还原法制备胶体金，取50mL0.01％的氯金酸溶液，边加热边搅拌直至沸腾，沸腾后迅速加入2mL 1％的柠檬酸三钠溶液，快速均匀搅拌15min，直至液体变成红色不再变化，室温下自然冷却后补充超纯水至50mL，4℃保存备用。

(2)纳米金颗粒标记鼠源抗FAM抗体：将待标胶体金溶液以0.1mol/LK

(3)胶体金试纸条的制备：取玻璃纤维纸，将抗体标记的胶体金溶液按15μL/cm喷涂于玻璃纤维纸上，干燥后贮存备用。使用碳酸氢钠缓冲液将链霉亲和素、抗地高辛抗体、及抗鼠二抗稀释至0.5mg/mL，0.2mg/mL，1mg/mL后用侧向流试剂分配器以3μL/cm喷涂于硝酸纤维膜上，喷涂完成后将试纸条置于37℃干燥1小时备用。如图1所示，PVC背衬板由下至上分别将样品垫、胶体金垫、含有检测带与质控带的硝酸纤维素膜及吸收垫按顺序装配，用切条机剪切成2mm宽的条状即成核酸诊断试纸条。

所述双标记的胶体金免疫层析试纸条的结构如图1所示，包括PVC背衬板8及在PVC背衬板8上依次按预设顺序装配的样品垫1、纳米金颗粒结合垫2、硝酸纤维素膜层7和吸水垫6；其中，硝酸纤维素膜层7上设有喷涂链霉亲和素的第一检测线3、喷涂抗地高辛抗体的第二检测线3和喷涂第二抗体的质控线5；纳米金颗粒结合垫2上具有胶体金标记抗FAM抗体。如图2所示本发明实施例2提供的双标记的胶体金免疫层析试纸条的检测原理示意图；其中，标号9示意FAM-生物素双标产物；标号10示意抗FAM抗体；标号11示意FAM-地高辛双标产物。

实施例3

本发明还公开了一种快速分型检测HPV16型和HPV18型病毒的试剂盒的分析方法，所述分析方法流程如下：

S1、待检样本中核酸的释放或提取；

S2、以处理过的所述待测样本为模板，使用RPA恒温扩增方法对模板进行扩增，得到RPA扩增产物；

S3、使用双标记的胶体金免疫层析试纸条对所述RPA扩增产物进行检测，根据试纸条上条带的有无对阴阳性进行判断及具体型别的鉴定。

具体地，步骤S1中待检样本中核酸的释放或提取采用的是一步法核酸提取试剂，进行核酸释放，形成待扩增模板。

步骤S2中模板制备的具体步骤包括：在本发明实施例中，采用样本为室内质控品，购自广州邦德盛生物技术有限公司：人乳头瘤病毒16型脱氧核糖核酸(HPV16 DNA)液体质控品，人乳头瘤病毒18型脱氧核糖核酸(HPV18 DNA)液体质控品。此质控品为病毒培养物，生理盐水稀释至相应浓度后，使用本公司自主开发的一步法核酸提取试剂，进行核酸释放，此样本即为待扩增模板。

步骤S2中模板扩增，使用RPA恒温扩增方法对模板进行扩增，其中RPA扩增试剂购自英国TwistDx Inc公司的TwistAmp Liquid nfo Kit，RPA扩增总反应体系为50μL，其中280mM醋酸镁2.5μL,模板4μL，溶解剂29.5μL，引物和探针共6μL(上下游引物均为2μL，探针各1μL)，水补足至50μL。先将4μL模板、29.5μL溶解剂、6μL引物和探针、蒸馏水加入到冻干酶复合物的反应管中混合均匀，将醋酸镁加在管盖上，盖上管盖后瞬时离心，将醋酸镁离心至管中启动RPA反应，整个反应在27-42℃之间，反应时长为10-30min。

步骤S3具体包括：

将所述RPA扩增产物用PBST稀释20倍形成扩增产物溶液，在所述扩增产物溶液中插入双标记的胶体金免疫层析试纸条，5-10min后取出双标记的胶体金免疫层析试纸条进行观察。

具体例1：灵敏度分析-单模板扩增

1、模板制备：取病毒培养物人乳头瘤病毒16型脱氧核糖核酸(HPV16 DNA)质控品和人乳头瘤病毒18型脱氧核糖核酸(HPV18 DNA)质控品，分别用生理盐水10倍倍比稀释至1000copies/mL、500copies/mL后，与一步法核酸提取试剂(50mM Tris，50mM KCL，1％TritonX-100，0.5％Tween-20，0.05％Chaps)1:1混合后室温放置10min，使核酸释放，此即为待扩增模板。

2、RPA反应：RPA扩增试剂购自英国TwistDx Inc公司的TwistAmp Liquid nfoKit，RPA扩增总反应体系为50μL，其中模板4μL，溶解剂29.5μL，引物和探针共6μL(上下游引物均为2μL，探针各1μL)，水8μL。混匀后加入到Twist冻干酶复合物的反应管中，将280mM醋酸镁2.5μL加在管盖上，盖上盖子后，瞬时离心，将醋酸镁离心至管中启动RPA反应，将反应管置于恒温装置中，于37-42℃反应20min。结果检测：反应结束后，取5μL反应产物，加入到95μL PBST溶液中，混匀后加入双标试纸条，5min后取出观察条带。扩增HPV16型和18型均能达到500copies/mL。检测结果图3所示。

具体例2：灵敏度分析-双模板扩增

取病毒培养物人乳头瘤病毒16型脱氧核糖核酸(HPV16 DNA)质控品和人乳头瘤病毒18型脱氧核糖核酸(HPV18 DNA)质控品，将两者以一定比例混匀至同一管，用生理盐水稀释至500copies/mL后，与一步法核酸提取试剂1:1混合后室温放置10min，使使核酸释放，后续操作同具体例1，检测结果如图4所示，同时扩增HPV16型和HPV18型灵敏度也能达到500copies/mL。

具体例3：特异性分析-生殖道其他常见病原体

分别以购买自广州邦德盛生物技术有限公司的沙眼衣原体液体标准物质(CT)、淋球菌原体液体标准物质(NG)、解脲脲原体液体标准物质(UU)、微小脲原体液体标准物质(UP)、人型支原体液体标准物质(MH)、单纯疱疹病毒II型液体标准物质(HSV-II)、巨细胞病毒液体标准物质(HCMV)为模板，浓度在10

具体例4：特异性分析-人乳头瘤病毒其余高危及低危型别

使用人乳头瘤病毒全基因组分型参考品中的6、11、16、18、26、31、33、35、45、56、58、59、66、73、82型参考品进行测试，将参考品稀释至10

如图6所示的微流控原理图，本发明实施例还进一步公开了一种分型检测HPV16型和HPV18型的微流控系统，通过加样孔12将待检样本加入，进入核酸释放剂仓13，进行核酸释放，然后释放完成的核酸与RPA反应液在RPA反应液仓14中混合，再流入装有RPA冻干酶球的第一仓室15进行恒温反应，反应结束后，在稀释液仓16与稀释液混合，流入试纸条底部的第二仓室17以将稀释产物流入双标记的胶体金免疫层析试纸条的试纸条放置仓18进行层析反应并读数。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明克服了现有技术的不足，满足临床对HPV16和18型分型的需求，提供了一种可快速检测HPV16型和18型病毒核酸的引物组与探针序列，及其含有该序列的检测试剂盒及分析方法，这是首次采用多重RPA技术对HPV病毒进行检测并对感染率最高的HPV16型和18型进行鉴定；

2、本发明通过一步法快速释放核酸，以此核酸为模板，以能同时扩增HPV16型和18型的特异性序列的引物组为引物，结合RPA快速扩增系统对模板进行扩增，最后通过双重标记的免疫层析试纸条对结果进行判断，可确定待测样品中是否感染HPV16型和18型，并能准确分型

3、本发明的灵敏度高，对HPV16型和HPV18型病毒最低可检测到500copies/mL，优于市面上的恒温检测产品，其灵敏度与PCR相当；

4、本发明的特异性高，本发明在设计引物探针时特异性的选择其保守序列，覆盖度高，特异性强；

5、本发明操作简单，整个流程仅需15-30min，全程无需专业人员及设备，成本低廉，检测时间短，具有高灵敏度及高特异性，可应用于基层大规模筛查；

6、对设备及人员要求低，本发明选择对温度要求极低的恒温扩增技术组合胶体金免疫层析技术对人乳头瘤病毒进行检测，整个流程无需特殊加热设备及检测设备，常温即可实现(27-42℃)，对人员也无任何要求，操作简便，快速，可应用于基层及大规模筛查使用；

7、本发明中的解决方案为本行业中其他病原体的检测提供了试验依据和技术参考。

上述所有可选技术方案，可以采用任意结合形成本发明的可选实施例，在此不再一一赘述。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 英科新创（苏州）生物科技有限公司

<120> 快速分型检测HPV16型和HPV18型病毒的引物组、试剂盒及分析方法

<130> SSP21396YKI

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> Nucleotide

<400> 1

gaatatgatt tacagtttat ttttcagctg tg 32

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> Nucleotide

<400> 2

amatttaaag gaaaagtttt ctgtagacct agatca 36

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> Nucleotide

<400> 3

aacatcccag gcaattgctt gtcaaaaaca thacacctcc agcacctc 48

<210> 4

<211> 47

<212> DNA

<213> Nucleotide

<400> 4

acaatctgtt gctattacct gtcaaaagga thgctgcacc ggctgaa 47