一种禽腺病毒毒种耐热冻干保护剂及其制备方法

技术领域

本发明属于兽用疫苗生产用制剂技术领域，尤其涉及一种禽腺病毒毒种耐热冻干保护剂，还涉及一种禽腺病毒毒种耐热冻干保护剂的制备方法。

背景技术

耐热保护剂技术自从本世纪初在兽用生物制品行业推广以来，到目前为止，已经有多个兽用生物制品生产厂家使用耐热保护剂技术生产耐热保护剂活疫苗，一定程度上解决了国产冻干活疫苗在2～8℃条件下保存期短的问题。

耐热保护剂在毒种的保存中鲜有应用，尤其在禽腺病毒毒种的保存中，现有技术中仍然采用蔗糖牛奶传统保护剂。使用传统的蔗糖牛奶保护剂保存的毒种，-80℃以下可以保存数十年，但在这个过程中会有大量的病毒失活，有的高达90％以上。禽腺病毒毒种使用蔗糖牛奶保护剂进行保存时，由于保存过程中效价的降低，常常导致攻毒试验中试验动物发病不成立。具体地，Ⅰ群4型禽腺病毒(FADV-4)可以引起家禽包涵体肝炎、心包积液综合征，临床上以肝脏出现肝脏变性坏死，心包腔中有淡黄色清亮积液，对养殖业的发展危害较大。由Ⅰ群4型禽腺病毒(FADV-4)开发的灭活疫苗产品对保护鸡群免受禽腺病毒的危害有着良好的效果。在灭活疫苗成品效力的检测中，需要对免疫的SPF鸡进行攻毒，以确定疫苗的保护效果。但本公司保存的毒种无论是湿毒还是蔗糖牛奶保护剂的干毒，保存一年后常常出现腺病毒毒种攻毒空白对照组发病动物数量不达标的情况，毒种经效价检测，发现毒种效价的降低是导致试验失败的原因，在这种情况我们需要开发一种耐热保护剂配方使禽腺病毒在低温环境中长期保存。

为此，需要开发设计一种禽腺病毒的耐热保护剂，使禽腺病毒毒种的保存更加持久和稳定，进而提升疫苗成品效力检测的有效性。

发明内容

本发明为解决公知技术中存在的技术问题而提供一种禽腺病毒毒种耐热冻干保护剂，提升对禽腺病毒毒种的保护效果，减缓禽腺病毒毒种在保存过程中的效价降低问题，提升疫苗成品效力检测的有效性。

本发明为解决公知技术中存在的技术问题所采取的技术方案是：一种禽腺病毒毒种耐热冻干保护剂由A液和B液混配而成；A液的组分及质量分数为甘氨酸0.3～0.8％，谷氨酸钠0.1～0.5％，抗坏血酸1～3％，余量为水；B液的组分及质量分数为海藻糖13～17％，蔗糖6～10％，甘露醇4～8％，吐温-800.02～0.05％，明胶1～3％，聚乙烯吡咯酮2～4％，余量为水。

本发明的优点和积极效果是：

本发明提供了一种禽腺病毒毒种耐热冻干保护剂，与现有常用的蔗糖牛奶保护剂相比，本发明中的耐热保护剂产品通过优化保护剂的组分以及质量分数配比，提升了对禽腺病毒毒种的保护效果，减缓禽腺病毒毒种在保存过程中的效价降低问题，提升疫苗成品效力检测的有效性。采用本耐热保护剂制备的冻干禽腺病毒耐热保护剂毒种，其病毒冻干损失比常规的蔗糖牛奶保护剂毒种减少约50％，在2～8℃条件下保存24个月、在37℃条件下保存7天，病毒的滴度下降小于1个滴度，而现有的蔗糖牛奶保护剂制备的禽腺病毒耐热保护剂毒种效价下降大于3个滴度。因此，本耐热保护剂有效减缓了禽腺病毒毒种在保存过程中的效价降低问题，提升了采用冻干禽腺病毒毒种进行攻毒试验时对疫苗成品效力的检测有效性。

优选地：由A液和B液混配而成；A液的组分及质量分数为甘氨酸0.4～0.6％，谷氨酸钠0.1～0.3％，抗坏血酸1.5～2.5％，余量为水；B液的组分及质量分数为海藻糖14～16％，蔗糖7～9％，甘露醇5～7％，吐温-800.03～0.05％，明胶2～3％，聚乙烯吡咯酮2～3％，余量为水。

优选地：A液与B液的体积比为1:1。

本发明的另一个目的是提供一种禽腺病毒毒种耐热冻干保护剂的制备方法。

本发明为解决公知技术中存在的技术问题所采取的技术方案是：一种禽腺病毒毒种耐热冻干保护剂的制备方法包括以下步骤，(1)制备A液，按质量分数称量各组分，将甘氨酸、谷氨酸钠和抗坏血酸加入水中溶解并定容，之后过滤除菌，之后冷冻保存；(2) 制备B液，按质量分数称量各组分，将海藻糖、蔗糖、甘露醇和吐温-80加入水中溶解，将明胶和聚乙烯吡咯酮分别水浴至完全溶解并加入前述溶解液，定容后高压灭菌，之后常温条件下保存；(3)取A液和B液，对A液进行水浴溶解后与B液混配得到耐热保护剂。

优选地：制备A液时，采用0.22um的过滤器进行过滤除菌，在-20℃的条件下冷冻。

优选地：制备B液时，在121℃、0.1MPa的条件下进行高压灭菌，高压灭菌的时间为30min。

具体实施方式

耐热保护剂配方的设计过程中，首先开展了不同保护剂基质与禽腺病毒病毒(FADV-4)相容性的研究。在抗氧化剂保护剂基质的筛选过程中，使用不同的抗氧化剂与禽腺病毒毒种进行混合，在20℃下相互作用2h，接下来进行毒种效价的测定，优选出对禽腺病毒无破坏作用或影响最小的保护剂基质，通过比较筛选出抗坏血酸作为禽腺病毒抗氧化剂类的保护剂基质。

使用同样的方法筛选出吐温-80作为表面活性剂类的保护剂基质，筛选出甘氨酸作为氨基酸类的保护剂基质，筛选出蔗糖和海藻糖作为聚合物类保护剂基质，筛选出甘露醇和明胶作为填充剂类保护剂基质。

接下来针对筛选出来的保护剂基质，开展不同浓度保护剂基质与禽腺病毒毒种的配比冻干试验，对不同浓度配方的产品进行效力检测，最终筛选出冻干后物理性状合格、冻干前后损失小、在37℃条件下7天耐老化试验中病毒滴度下降小于1个滴度的耐热保护剂配方成为本发明中的保护剂配方。

各类保护剂基质筛选原理如下：

抗氧化剂：在冷冻干燥与储藏中，蛋白质中的甲硫氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸等残基的位置链可能与空气中的氧发生氧化作用，而引起生物体的变质。因此，需要在冻干样品配方中添加适量的抗氧化剂，以提高冻干样品的稳定性，延长其储藏期。本发明中使用的抗氧化剂为抗坏血酸。

表面活性剂：在禽腺病毒毒种制品的冷冻干燥过程中，表面活性剂既能在冻结和脱水过程中降低冰-水界面张力所引起的冻结和脱水变形，又能在复水过程中对活性组分起到润湿剂和重褶皱剂的作用，因此表面活性剂可以降低病毒在冷冻干燥过程中活性的损伤，增强病毒的活性恢复率。本发明中使用的表面活性剂是吐温-80。

氨基酸：由于氨基酸同时含有羧基和氨基，属于两性物质，在生物制品溶液的冻结过程中，它能够起到抑制溶液PH值变化的作用，减缓冻结过程中由于溶液的浓度升高，PH值的剧烈变化导致蛋白质变性，本发明中使用的氨基酸为甘氨酸，同时甘氨酸还是很好的填充剂。

聚合物类保护剂：是由简单的单体经过聚合反应形成的巨大分子，聚合物类保护剂具备低温保护剂和脱水保护剂的作用。本发明中使用的聚合物类保护剂为聚乙烯吡咯酮(PVP-K30)，同时它在生物制品的脱水干燥过程中又是很好的填充剂，对生物制品起到很强的支撑作用。

低聚糖：果糖类与生物制品活性组分的分子形成氢键而代替原有水的位置，从而对生物制品起到保护作用，低聚糖既能在冻结过程中起到低温保护剂的功能，又能在干燥脱水过程中起到脱水保护剂的作用，本发明中使用的低聚糖是非还原性二糖，蔗糖和海藻糖。

填充剂：能有效防止组分随水分子一起升华逸散，并使有效组分成形的物质。本发明使用的填充剂为甘露醇和明胶。

为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效，兹举以下实施例详细说明。

实施例一

由A液和B液混配而成；A液的组分及质量分数为甘氨酸0.3％，谷氨酸钠0.1％，抗坏血酸1％，余量为水；B液的组分及质量分数为海藻糖13％，蔗糖6％，甘露醇4％，吐温-800.02％，明胶1％，聚乙烯吡咯酮2％，余量为水。

制备方法：

(1)制备A液，按质量分数称量各组分，将甘氨酸、谷氨酸钠和抗坏血酸加入水中溶解并定容，采用0.22um的过滤器进行过滤除菌，之后在-20℃的条件下冷冻保存；

(2)制备B液，按质量分数称量各组分，将海藻糖、蔗糖、甘露醇和吐温-80加入水中溶解，将明胶和聚乙烯吡咯酮分别水浴至完全溶解并加入前述溶解液，定容后在 121℃、0.1MPa的条件下进行高压灭菌，高压灭菌的时间为30min，之后常温条件下保存；

(3)取A液和B液，对A液进行水浴溶解后与B液混配得到耐热保护剂。

使用方法：

将等体积的禽腺病毒毒种与耐热保护剂配比，分装后，执行现有冻干工艺得到禽腺病毒耐热保护剂冻干毒种。

实施例二

由A液和B液混配而成；A液的组分及质量分数为甘氨酸0.4％，谷氨酸钠0.25％，抗坏血酸1.5％，余量为水；B液的组分及质量分数为海藻糖14％，蔗糖7％，甘露醇5％，吐温-800.03％，明胶1.5％，聚乙烯吡咯酮2.5％，余量为水。

制备方法：

(1)制备A液，按质量分数称量各组分，将甘氨酸、谷氨酸钠和抗坏血酸加入水中溶解并定容，采用0.22um的过滤器进行过滤除菌，之后在-20℃的条件下冷冻保存；

(2)制备B液，按质量分数称量各组分，将海藻糖、蔗糖、甘露醇和吐温-80加入水中溶解，将明胶和聚乙烯吡咯酮分别水浴至完全溶解并加入前述溶解液，定容后在 121℃、0.1MPa的条件下进行高压灭菌，高压灭菌的时间为30min，之后常温条件下保存；

(3)取A液和B液，对A液进行水浴溶解后与B液混配得到耐热保护剂。

使用方法：

将等体积的禽腺病毒毒种与耐热保护剂配比，分装后，执行现有冻干工艺得到禽腺病毒耐热保护剂冻干毒种。

实施例三

由A液和B液混配而成；A液的组分及质量分数为甘氨酸0.45％，谷氨酸钠0.3％，抗坏血酸2.5％，余量为水；B液的组分及质量分数为海藻糖15％，蔗糖9％，甘露醇5.5％，吐温-800.05％，明胶2.5％，聚乙烯吡咯酮3.5％，余量为水。

制备方法：

(1)制备A液，按质量分数称量各组分，将甘氨酸、谷氨酸钠和抗坏血酸加入水中溶解并定容，采用0.22um的过滤器进行过滤除菌，之后在-20℃的条件下冷冻保存；

(2)制备B液，按质量分数称量各组分，将海藻糖、蔗糖、甘露醇和吐温-80加入水中溶解，将明胶和聚乙烯吡咯酮分别水浴至完全溶解并加入前述溶解液，定容后在121℃、XMPa的条件下进行高压灭菌，高压灭菌的时间为30min，之后常温条件下保存；

(3)取A液和B液，对A液进行水浴溶解后与B液混配得到耐热保护剂。

使用方法：

将等体积的禽腺病毒毒种与耐热保护剂配比，分装后，执行现有冻干工艺得到禽腺病毒耐热保护剂冻干毒种。

实施例四

由A液和B液混配而成；A液的组分及质量分数为甘氨酸0.8％，谷氨酸钠0.5％，抗坏血酸3％，余量为水；B液的组分及质量分数为海藻糖17％，蔗糖10％，甘露醇8％，吐温-800.05％，明胶3％，聚乙烯吡咯酮4％，余量为水。

制备方法：

(1)制备A液，按质量分数称量各组分，将甘氨酸、谷氨酸钠和抗坏血酸加入水中溶解并定容，采用0.22um的过滤器进行过滤除菌，之后在-20℃的条件下冷冻保存；

(2)制备B液，按质量分数称量各组分，将海藻糖、蔗糖、甘露醇和吐温-80加入水中溶解，将明胶和聚乙烯吡咯酮分别水浴至完全溶解并加入前述溶解液，定容后在 121℃、0.1MPa的条件下进行高压灭菌，高压灭菌的时间为30min，之后常温条件下保存；

(3)取A液和B液，对A液进行水浴溶解后与B液混配得到耐热保护剂。

使用方法：

将等体积的禽腺病毒毒种与耐热保护剂配比，分装后，执行现有冻干工艺得到禽腺病毒耐热保护剂冻干毒种。

实施例五

由A液和B液混配而成；A液的组分及质量分数为甘氨酸0.52％，谷氨酸钠0.12％，抗坏血酸2％，余量为水；B液的组分及质量分数为海藻糖15.6％，蔗糖8％，甘露醇6％，吐温-800.04％，明胶2.4％，聚乙烯吡咯酮2.4％，余量为水。

制备方法：

(1)制备A液，按质量分数称量各组分，将甘氨酸、谷氨酸钠和抗坏血酸加入水中溶解并定容，采用0.22um的过滤器进行过滤除菌，之后在-20℃的条件下冷冻保存；

(2)制备B液，按质量分数称量各组分，将海藻糖、蔗糖、甘露醇和吐温-80加入水中溶解，将明胶和聚乙烯吡咯酮分别水浴至完全溶解并加入前述溶解液，定容后在 121℃、0.1MPa的条件下进行高压灭菌，高压灭菌的时间为30min，之后常温条件下保存；

(3)取A液和B液，对A液进行水浴溶解后与B液混配得到耐热保护剂。

使用方法：

将等体积的禽腺病毒毒种与耐热保护剂配比，分装后，执行现有冻干工艺得到禽腺病毒耐热保护剂冻干毒种。

以实施例五为例，给出冻干毒种耐老化试验数据、不同冻干保护剂毒种在2～8℃、-20℃和-80℃条件下保存时的效价测定试验数据以及本发明耐热保护剂毒种保存不同时间后的攻毒试验数据。

一、冻干毒种耐老化试验

试验说明：

取冻干毒种，置于37℃条件下放置7日，取出后进行病毒含量测定，与放置前相比，病毒含量下降应不超过1个滴度。

病毒含量测定方法：

将毒种用含2％血清的DMEM培养基(DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的)作10倍系列稀释，取适宜的3个稀释度，接种良好LMH(鸡肝癌细胞系)单层细胞板(共96孔)，每个稀释度接9孔，每孔0.1ml，在37℃温度条件下、含5％CO

表1本发明耐热保护剂与蔗糖牛奶保护剂冻干毒种前后及37℃耐老化试验结果

由表1中本发明的耐热保护剂与蔗糖牛奶保护剂在毒种冻干前后以及37℃条件下的耐老化试验结果可以看出：使用本发明的耐热保护剂冻干的禽腺病毒毒种，冻干后相较于冻干前损失在0.2个滴度左右，使用蔗糖牛奶保护剂冻干的禽腺病毒毒种，冻干后相较于冻干前损失大于0.5个滴度；使用本发明的耐热保护剂冻干的毒种在37℃条件下耐老化7天与耐老化前相比，毒价下降均在1个滴度以内，而蔗糖牛奶保护剂毒种，在37℃条件下耐老化7天下降3个滴度。

综上所述，本发明的耐热保护剂对于禽腺病毒的冻干过程以及耐老化过程保护效果更佳。

二、不同冻干保护剂毒种在2～8℃、-20℃和-80℃条件下保存不同时间效价测定试验

表2不同冻干保护剂产品2～8℃条件下保存不同时间效价测定结果

从表2不同冻干保护剂毒种在2～8℃条件下保存不同时间效价测定结果可以看出：本发明耐热保护剂制备的禽腺病毒毒种，在2～8℃条件下保存，保存6个月效价没有变化，保存12个月效价降低在0.2个滴度左右，保存24个月效价降低在1个滴度以内，保存36个月效价降低在1.5个滴度以内；使用蔗糖牛奶保护剂制备的禽腺病毒毒种在2～8℃条件下保存，保存6个月效价降低在1个滴度以内，保存12个月效价显著降低2～3个滴度，保存24个月效价降低大于4个滴度，而且蔗糖牛奶保护剂制备的禽腺病毒毒种在2～8℃保存过程中逐渐发生收缩的现象，以至于后期无法进行检测。

表3不同冻干保护剂毒种在-20℃条件下保存不同时间效价测定结果

从表3不同冻干保护剂产品-20℃条件下保存不同时间效价测定结果可以看出：本发明耐热保护剂制备的禽腺病毒毒种，在-20℃条件下保存，保存24个月效价基本没有变化，保存36个月效价降低在0.2个滴度左右；使用蔗糖牛奶保护剂制备的禽腺病毒毒种在-20℃条件下保存，保存6个月效价降低在0.5个滴度以内，保存24个月效价降低在1个滴度以内，保存36个月效价降低大于1个滴度。

表4不同冻干保护剂毒种在-80℃条件下保存不同时间效价测定结果

从表3不同冻干保护剂毒种在-80℃条件下保存不同时间效价测定结果可以看出：本发明耐热保护剂制备的禽腺病毒毒种，在-80℃条件下保存，保存24个月效价基本没有变化，保存36个月效价降低在0.2个滴度左右；使用蔗糖牛奶保护剂制备的禽腺病毒毒种在-80℃条件下保存，保存12个月效价基本没有变化，保存24个月效价降低在0.5个滴度左右，保存36个月效价降低在1个滴度左右。

三、本发明的耐热保护剂毒种保存不同时间后的攻毒试验

I群4型禽腺病毒发病判定标准如下：

(1)出现精神沉郁、羽毛粗乱等临床症状，严重者死亡；

(2)剖检出现心包积液或肝脏肿大(发黄或出血)；

出现上述两项中的一项或以上时判为发病。

当SPF鸡空白非攻毒组全部健活，判定试验成立，攻毒后14日，发病鸡数量达到9/10判定攻毒试验成立。

表5本发明耐热保护剂毒种保存12、24、36个月的攻毒试验安排

表6本发明耐热保护剂毒种保存12个月的攻毒试验结果

表7本发明耐热保护剂毒种保存24个月的攻毒试验结果

表8本发明耐热保护剂毒种保存36个月的攻毒试验结果

从表6、表7、表8本发明耐热保护剂毒种保存12个月、24个月、36个月后的攻毒试验结果可以看出：使用本发明耐热保护剂制备的禽腺病毒毒种，分别在保存后12个月、24个月、36个月进行攻毒试验，SPF鸡发病均在95％以上，符合发病标准，这说明使用耐热保护剂保存的腺病毒毒种保存期间未发生毒力的减弱。

四、结论

综上所述，使用本发明耐热保护剂制备的禽腺病毒毒种，能有效降低冻干过程中病毒的损失，2～8℃条件下保存长达24个月效价降低在1个滴度以内，在-20℃和-80℃条件下保存36个月以上效价仅有微小的降低，同时使用本发明耐热保护剂保存的腺病毒毒种保存期间毒力稳定，从根本上解决了禽腺病毒长时间保存的问题。