一种基于量子点荧光的新型冠状病毒中和抗体快速检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于量子点荧光的新型冠状病毒中和抗体快速检测试剂盒及其应用。

背景技术

冠状病毒在系统分类上属冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。冠状病毒属的病毒是具外套膜(envelope)的正链单股RNA病毒，直径约80～120nm，其遗传物质是所有RNA病毒中最大的，感染宿主包括人、鼠、蝙蝠、猪、猫、穿山甲、犬、狼、鸡、牛、蛇类、禽类等脊椎动物。2019新型冠状病毒(SARS-CoV-19,曾用名2019-nCoV)是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，其余6种分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV。研究表明，其中SARS-CoV-19、SARS-CoV和HCoV-NL63是通过病毒包膜spike glycoprotein(S-protein)介导病毒与宿主细胞膜上的ACE2受体相互作用来感染人的。人感染了新型冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。血清中抗病毒IgM抗体是病毒复制和早期感染的标志，随后会有IgG抗体升高，因而血清学IgM/IgG抗体通常作为病毒感染的检测指标，且可判断近期感染和既往感染。对于感染后产生的抗病毒IgG抗体通常有防止机体再次被感染的作用。另一方面，防治新冠肺炎最直接和有效的方法是接种疫苗，通过接种新型冠状病毒疫苗，诱发机体产生抗新型冠状病毒的抗体，从而保护机体免受新型冠状病毒侵染。但是，无论是感染病毒后产生的自然免疫，还是接种疫苗后的人工免疫，并非病毒或疫苗诱生的所有抗体都能起到保护作用，只有那些能够阻断病毒和人体细胞结合的抗体才能起到较好的保护作用，这种抗体通常被称为中和抗体。目前，对疫情中或疫情后流行病血清学调查主要是检测血清总抗体；但如果能同时检测出中和抗体的含量则对预后及再次感染的风险评估具有重要意义。同样，对于接种疫苗后如果能在检测总抗体的同时检测中和抗体的含量，则对评估疫苗的效果及是否需要和何时再次免疫具有重要意义。

那么，如何检测出中和抗体呢？新型冠状病毒入侵人体细胞的机制是新型冠状病毒通过其表面的棘突蛋白S(配体)与人细胞膜上的ACE2受体特异性结合入侵人体细胞。研究表明，新冠病毒的S蛋白与人ACE2受体有非常强的结合力，亲和力为15nM(平衡解离常数)，比SARS病毒强10-20倍。S蛋白与ACE2结合的区域称为受体结合结构域(ReceptorBinding Domain,RBD)。所谓中和抗体就是以RBD为靶点并起到能够阻断S蛋白配体与ACE2受体结合的抗体。因此，我们可以建立配体-受体竞争法检测系统特异地分析血清中新冠病毒中和抗体的含量。。

发明内容

针对现有技术存在的上述技术问题，我们根据配体与受体特异性结合的原理，发明了一种基于量子点荧光的新型冠状病毒中和抗体快速检测方法及试剂盒制备。

一种含有标记量子点的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒,标记制备方法包括以下步骤：

1)将新型冠状病毒棘突蛋白的C末端依次接上人工设计的含跨膜序列的序列、蛋白定点生物素化序列，将其标记为nCoVS-TM-AVI；该人工设计序列经宿主细胞密码子优化后基因合成并亚克隆到慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP的CMV启动子下，构建表达新型冠状病毒棘突蛋白S-定点生物素化序列融合蛋白的质粒，将其标记为pMLD-nCoVS；

2)将步骤1)构建好的质粒pMLD-nCoVS与pH1质粒、pH2质粒共转染到慢病毒包装系细胞293V，制备nCoVS.copGFP慢病毒，并转染新的293V细胞，荧光显微镜下挑取高表达克隆，建立nCoVS.copGFP/293V稳转细胞系；

3)将步骤1)构建好的质粒pMLD-nCoVS与pH1质粒、pH2质粒共转染到步骤2)，建立的nCoVS.copGFP/293V稳转细胞系，转染后48小时和72小时各收集培养上清液一次；合并两次收集的上清液，4℃,4000g离心10分钟，弃沉淀；取上清，4℃,20000g离心20分钟，弃沉淀；取上清，过0.45μm孔径滤膜后，4℃,85000g离心90分钟，弃上清；沉淀即为新型冠状病毒棘突蛋白假病毒，用pH7.4的PBS溶液重悬，制备含新型冠状病毒棘突蛋白S浓度≧1mg/ml的假病毒悬液；

4)用偶联抗新型冠状病毒棘突蛋白S蛋白抗体的磁珠纯化从步骤3)制备的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒重悬液，并制备成含新型冠状病毒棘突蛋白S浓度≧1mg/ml的假病毒PBS悬液；

5)将步骤4)制备的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒用生物素蛋白连接酶使其S蛋白C-末端定点生物素化，获得生物素化的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒，将其标记为nCoVSpsvirus-Biotin；

6)将链霉亲和素SA偶联于羧基量子点微球，获得QM-SA；将步骤5)获得的nCoVSpsvirus-Biotin与QM-SA共孵育，获得牢固标记量子点的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒，将其标记为QM-nCoVSpsvirus。

其中，步骤1)中，所述新型冠状病毒棘突蛋白基因为GenBank:NC_045512.2中编码Spike glycoprotein(GeneID:43740568)的基因序列；所述人工设计的含跨膜序列的序列为TLTERLREKISRAFYNHGLLCASYPIPIILFTGFCILACCYPLLKLPL(ACCCTGACAGAGCGGCTGAGAGAGAAGATCAGCCGGGCCTTCTACAACCACGGCCTGCTGTGCGCCTCCTATCCCATCCCTATCATCCTGTTCACAGGCTTTTGTATCCTGGCCTGCTGTTACCCTCTGCTGAAGCTGCCACTG)；所述蛋白定点生物素化序列为生物素蛋白连接酶BirA，其识别位点序列为GLNDIFEAQKIEWHE；所述密码子优化的宿主为人；表达新型冠状病毒棘突蛋白和蛋白定点生物素化序列标签的人工设计序列经人宿主细胞密码子优化后的核酸序列如SEQ ID NO：1所示，构建好的质粒所表达的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

含有标记量子点的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒用于制备新型冠状病毒中和抗体快速检测试剂盒的应用。

另外，本发明提供了一种基于量子点荧光的新型冠状病毒中和抗体快速检测试剂盒。

一种基于量子点荧光的新型冠状病毒中和抗体快速检测试剂盒，包含含有标记量子点的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒。

优选的，所述试剂盒还包括免疫层析试纸条，免疫层析试纸条包括底衬、硝酸纤维素膜、样品垫、释放垫和吸水纸；样品垫、释放垫、硝酸纤维素膜和吸水纸搭接组装在底衬上，释放垫和吸水纸分别叠压在硝酸纤维素膜的两端，并在硝酸纤维素膜的表面形成检测区，样品垫叠压在释放垫上；检测区的硝酸纤维素膜上设置靠近释放垫的二条检测线区(T1和T2线)和靠近吸水纸的一条控制线区(C线)。

本发明试剂盒的制备方法,将-兔IgG偶联于羧基量子点微球，获得QM-RIgG；将QM-nCoVSpsvirus和QM-质RIgG混合液喷涂在释放垫上；在硝酸纤维素膜上T1、T2、C线区分别包被人源ACE2蛋白、抗人IgG抗体、和羊抗兔IgG抗体(GAR)，获得血清和血浆新型冠状病毒棘突蛋白中和抗体和总抗体检测试纸条。

所述血清和血浆新型冠状病毒棘突蛋白中和抗体和总抗体检测试纸条，采用干式荧光层析分析仪定量分析；提供中和抗体的阴/阳性、抑制率，抗新型冠状病毒S蛋白总IgG抗体的阴/阳性、获得率等指标；

其中，中和抗体的抑制率根据公式1来计算；检测样本中SARS-CoV-2中和抗体的阴/阳性判断可根据抑制率来设定，具体检测限可在10％-100％的抑制率范围内设定；

公式1:

公式2：

试剂盒用于新冠肺炎患者康复后和疫苗接种者血清保护抗体的评估的应用。

实验表明，重组的人ACE2蛋白与冠状病毒的S-蛋白有较强的结合力。依据竞争法免疫层析原理，我们用新型冠状病毒棘突蛋白假病毒标记量子点荧光并喷涂于试纸条的释放垫上，检测时可与血清或血浆样本中的抗新型冠状病毒棘突蛋白抗体(包括中和抗体)结合，带上量子点荧光；在试纸条的T1检测线包被重组的人ACE2蛋白，通过与棘突蛋白RBD结构域结合来捕获层析中量子点标记的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒(配体-受体结合原理)，如果检测样本中没有中和抗体，则T1线有较强的量子点荧光信号，如果检测样本中有中和抗体，则中和量子点标记的ACE2，T1线量子点荧光信号减弱，与ACE2蛋白形成量效成反比的竞争关系；在试纸条的T2检测线包被抗人IgG抗体，用来捕获层析样本中的人IgG抗体，人抗新型冠状病毒棘突蛋白抗体中通过与棘突蛋白RBD结构域结合来捕获层析中量子点标记的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒(配体-受体结合原理)；如果检测样本中人抗新型冠状病毒棘突蛋白抗体越多，则T2线的量子点荧光信号越强，如果检测样本中人抗新型冠状病毒棘突蛋白抗体越少，则T2线的量子点荧光信号越弱。

本发明公开了一种基于量子点荧光的新型冠状病毒中和抗体快速检测方法及试剂盒制备，试剂盒包括量子点标记的新型冠状病毒棘突蛋白假病毒、量子点标记的兔IgG、重组人ACE2蛋白、抗人IgG单克隆抗体、羊抗兔IgG的多抗、层析试纸条等相关材料。本发明通过配体-受体法竞争法及量子点荧光层析法定量分析新型冠状病毒感染后或接种疫苗后体内是否产生抗新冠病毒S1蛋白IgG抗体、中和抗体，并计算出中和抗体的抑制率及总抗体的获得率。抗新型冠状病毒S蛋白总IgG抗体的获得率越高表明免疫产生的抗体越多；中和抗体的抑制率越高表明中和阻断抗体越多，保护作用越强。从而判断是否感染新型冠状病毒或疫苗接种是否成功，以及对感染新型冠状病毒后或接种疫苗后体内是否产生保护抗体做出定量分析，为新型冠状病毒后期的血清学流行病普查及疫苗接种指导提供第一手资料。

本发明的优势在于在保留了胶体金免疫层析快速、简便、廉价、稳定好、可实现居家检测等优点外，采用配体与受体相互作用的原理，可将样本中的抗新型冠状病毒棘突蛋白中和抗体检测出来，结合量子点荧光的定量分析和样本中的抗新型冠状病毒棘突蛋白总抗体检测。本发明的另一个优在于采用了新型冠状病毒棘突蛋白假病毒进行检测，更能反映抗体对病毒作用的真实情况。本发明可对感染新冠病毒后是否产生的自然免疫，以及接种疫苗后的人工免疫效果进行快速筛查和评估。

附图说明

图1为pMLD-nCoVS质粒图谱；

图2为基于量子点荧光的新型冠状病毒中和抗体快速检测方法及试剂盒原理。

图3SEQ ID NO：1

图4SEQ ID NO:2

图5SEQ ID NO:2序列跨膜节段分析结果

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。

以下实施例中，慢病毒包装细胞293V购自于北京英茂盛业生物科技有限公司；重组冠状病毒棘突蛋白S1由杭州迈尔德生物科技有限公司提供。

实施例1 pMLD-nCoVS质粒构建

基因设计nCoVS-TM-AVI融合蛋白的核酸序列，经宿主(人)密码子优化后序列如SEQ ID NO：1所示(图3)，两端分别设计EcoR I和Not I限制性内切酶，表达后氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示(图4)；该氨基酸序列经蛋白分析软件分析

实施例2建立nCoVS-TM-AVI.copGFP/293稳转细胞系

将pMLD-nCoVS质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染到慢病毒包装系细胞293V，制备nCoVS-TM-AVI.copGFP慢病毒，并转染HEK293细胞，荧光显微镜下挑取克隆建立nCoVS-TM-AVI.copGFP/293稳转细胞系。具体步骤如下：

1)实验前一天对5个15cm dish进行细胞铺板，保证在转染之前，细胞均达70％-80％汇合度。

2)转染前1～2h，更换dish内培养基为无血清无抗生素的DMEM培养基。

3)准备一支15mL离心管，加入5mL 1×HBS，再依次加入100μg的pMLD-nCoVS质粒、100μg PH1/PH2混合质粒(PH1:PH2＝3:1)，轻轻混匀。

4)加入4mL PEI工作液(10μM)，轻轻混匀，置37℃孵育20min。

5)将转染复合液等分5份，均匀加入5个待转染的15cm dish内，轻轻晃动使复合物分布均匀。

6)转染6h后换液，更换为DMEM完全培养基(+10％FBS+1％青霉素/链霉素双抗)。

7)转染48h收集上清，于8000g离心15min后，冻于-80℃冰箱。

8)转染72h收集上清，于8000g离心15min后，合并转染48h所收集上清，过0.45μm滤膜，再以85000g离心2h。

9)弃上清，沉淀以1mL完全培养基(+10％FBS+1％双抗)重悬，感染HEK293细胞(6孔板1个孔，细胞60％-70％汇合度)。

10)感染的HEK293细胞培养2天后传代分至2个6孔板共12个孔；待分散的单个细胞形成克隆细胞团(约1周)，在荧光显微镜下挑取高表达绿色荧光蛋白的单克隆细胞团进行扩增培养建立nCoVS-TM-AVI.copGFP/293稳转细胞系。

实施例3 nCoVSpsvirus假病毒制备

1)将pMLD-nCoVS质粒与pH1质粒共转染到将建立的nCoVS-TM-AVI.copGFP/293V稳转细胞系，转染后48小时和72小时各收集培养上清液一次；合并两次收集的上清液，4℃,4000g离心10分钟，弃沉淀；取上清，4℃,20000g离心20分钟，弃沉淀；取上清，过0.45μm孔径滤膜后，4℃,85000g离心90分钟，弃上清；沉淀即为新型冠状病毒棘突蛋白假病毒，用pH7.4的PBS溶液重悬，制备含新型冠状病毒棘突蛋白S浓度≧1mg/ml的假病毒悬液。

2)用偶联抗新型冠状病毒棘突蛋白抗体的磁珠纯化制备新型冠状病毒棘突蛋白假病毒重悬液；洗脱后的nCoVS假病毒悬液，4℃,85000g离心90分钟，弃上清；沉淀用生物素蛋白连接酶(BirA酶)连接缓冲液(10mM ATP,10mM MgOAc,50μM D-Biotin)重悬，制备成含新型冠状病毒棘突蛋白S浓度≧1mg/ml的假病毒悬液。按产品说明书用BirA酶使nCoVS假病毒定点生物素化，即将生物素连在GLNDIFEAQKIEWHE序列中赖氨酸(K)上，获得生物素化nCoVS假病毒，将其标记为nCoVSpsvirus-Biotin；

实施例4量子点荧光标记QM-nCoVSpsvirus和QM-RIgG的制备

将链霉亲和素(SA)偶联于羧基量子点微球，nCoVSpsvirus-Biotin即可通过SA-Biotin系统牢固地标记上量子点荧光。具体步骤如下：

1)按产品说明书的方法将链霉亲和素(SA)偶联于羧基量子点微球，获得QM-SA；

2)同样将兔IgG也偶联于羧基量子点微球，获得QM-RIgG，用于试纸条质控系统；

3)在pH7.4的PBS缓冲液中将QM-SA和nCoVSpsvirus-Biotin以1:4的摩尔比混合(QM-SA以标记的SA计)，37℃、150rpm振荡孵育1小时，获得QM-nCoVSpsvirus；

4)8000g、4℃离心30分钟，去上清，沉淀用PB缓冲液(pH7.0、1％BSA、8％蔗糖、0.05％NaN

实施例5基于量子点荧光的新型冠状病毒中和抗体快速检测方法及试剂盒的制备

将以上实施例制备的QM-nCoVSpsvirus和QM-RIgG混合后喷涂在释放垫上，37℃烘干12h备用。

1)在硝酸纤维素膜上设置靠近释放垫的二条检测线区(T1和T2线)和靠近吸水纸的一条控制线区(C线)。用包被稀释液(150mM PB，pH 7.4)分别将重组人源ACE2蛋白、抗人IgG抗体、和羊抗兔IgG抗体(GAR)稀释成0.5mg/mL，以膜液量30μL/30cm分别均匀喷涂划线于硝酸纤维素膜检测线区(T1和T2线)和控制线区(C线)上，37℃烘干处理12h，封袋备用。

2)将样品垫、释放垫、硝酸纤维素膜和吸水纸搭接组装在底衬上，释放垫和吸水纸分别叠压在硝酸纤维素膜的两端，并在硝酸纤维素膜的表面形成检测区(T1线区靠近释放垫，T2线在中间，C线区靠近吸水纸)，样品垫叠压在释放垫上，组装后形成试纸板，切割成宽度3mm条状，制成所述的基于量子点荧光的新型冠状病毒中和抗体快速检测试纸(图2)。

实施例6基于量子点荧光的新型冠状病毒中和抗体快速检测试剂盒的应用

基于本发明技术方案研发的基于量子点荧光的新型冠状病毒中和抗体快速检测试剂盒可应用于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染后，以及新型冠状病毒疫苗接种后血清学中和抗体和总IgG抗体的快速检测评估，检测样本包括全血、血浆、血清。

试剂盒检测结果应用干式荧光分析仪进行定量分析，并提供中和抗体的阴/阳性、抑制率，抗新型冠状病毒S蛋白总IgG抗体的阴/阳性、获得率等指标。

中和抗体的抑制率根据公式1来计算；检测样本中SARS-CoV-2中和抗体的阴/阳性判断可根据抑制率来设定，具体检测限可在10％-100％的抑制率范围内设定，如见表1。

表1检测样本中SARS-CoV-2中和抗体的阴/阳性判断

总IgG抗体的获得率根据公式2来计算；检测样本中SARS-CoV-2S蛋白总IgG抗体阴/阳性判断可根据获得率来设定，如见表2。

表2检测样本中SARS-CoV-2S蛋白总IgG阴/阳性判断

取7份无新冠病史、没有接种新冠疫苖的健康志愿者血清和7份新冠疫苖接种二次后7天以上的志愿者血清，用本发明技术方案研发的试剂盒进行检测，结果见表3。

序列表

<110> 杭州迈尔德生物科技有限公司

<120> 一种基于量子点荧光的新型冠状病毒中和抗体快速检测试剂盒及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4103

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaattcatgt tcgtgttcct ggtgctgctg cctctggtgt cctcccagtg tgtgaacctg 60

accaccagaa cccagctgcc tcctgcctac accaatagct tcaccagagg cgtgtactac 120

cccgataagg tgtttaggtc cagcgtgctg cactccaccc aggacctgtt tctgcctttc 180

tttagcaatg tgacctggtt ccacgccatc cacgtgagcg gcaccaacgg caccaagagg 240

tttgacaacc ctgtgctgcc cttcaatgat ggcgtgtact ttgcctccac cgagaagtcc 300

aacatcatca ggggctggat ctttggcacc accctggact ccaagaccca gagcctgctg 360

atcgtgaata acgccaccaa tgtggtcatt aaggtgtgcg agtttcagtt ctgcaatgac 420

cctttcctgg gcgtgtacta tcacaagaac aacaagagct ggatggagag cgagtttaga 480

gtgtacagct ccgccaacaa ttgtaccttt gagtacgtgt cccagccctt cctgatggat 540

ctggagggca agcagggcaa ctttaagaat ctgagagagt ttgtgttcaa gaatatcgac 600

ggctacttca agatctacag caagcacacc cccatcaacc tggtgaggga cctgcctcag 660

ggcttttccg ccctggagcc tctggtggac ctgcccatcg gcatcaacat caccagattc 720

cagaccctgc tggccctgca cagaagctac ctgacccccg gcgattcctc cagcggctgg 780

accgctggcg ccgctgctta ctacgtgggc tacctgcagc ccaggacctt tctgctgaag 840

tacaacgaga acggcaccat caccgacgcc gtggattgcg ccctggaccc tctgtccgag 900

acaaagtgca ccctgaagtc cttcaccgtg gagaagggca tctaccagac cagcaatttc 960

agggtgcagc ccaccgagag catcgtgagg tttcctaata tcaccaacct gtgccctttt 1020

ggcgaggtgt tcaatgccac cagattcgcc agcgtgtacg cctggaatag gaagaggatc 1080

tccaactgcg tggccgacta ctccgtgctg tacaactccg cctcctttag caccttcaag 1140

tgttacggcg tgagccctac caagctgaac gatctgtgct tcaccaacgt gtacgccgac 1200

agctttgtga tcaggggcga cgaggtgaga cagatcgccc ctggccagac cggcaagatc 1260

gccgattaca attacaagct gcctgacgat ttcaccggct gcgtgatcgc ctggaatagc 1320

aacaacctgg atagcaaggt gggcggcaat tacaattacc tgtacaggct gttcagaaag 1380

tccaacctga agcccttcga gagggacatc agcaccgaga tctaccaggc cggcagcacc 1440

ccttgtaatg gcgtggaggg cttcaattgc tacttccccc tgcagagcta cggcttccag 1500

cctaccaatg gcgtgggcta ccagccctac agagtggtgg tgctgagctt cgagctgctg 1560

cacgcccccg ccaccgtgtg tggacctaag aagagcacca acctggtgaa gaataagtgt 1620

gtgaacttca attttaacgg cctgaccggc accggcgtgc tgaccgagtc caataagaag 1680

tttctgcctt tccagcagtt tggcagggac atcgccgaca ccaccgatgc cgtgagggac 1740

ccccagaccc tggagatcct ggacatcacc ccctgcagct ttggcggcgt gagcgtgatc 1800

acccctggca ccaacaccag caatcaggtg gccgtgctgt accaggacgt gaattgcacc 1860

gaggtgcccg tggccatcca cgccgatcag ctgaccccca cctggagggt gtacagcacc 1920

ggcagcaatg tgtttcagac cagggccggc tgcctgatcg gcgctgagca cgtgaataat 1980

tcctacgagt gtgacatccc tatcggcgcc ggcatctgcg cctcctacca gacccagacc 2040

aattccccca gaagagccag atccgtggcc agccagagca tcatcgccta caccatgtcc 2100

ctgggcgccg agaacagcgt ggcctacagc aataatagca tcgccatccc caccaatttt 2160

accatcagcg tgaccaccga gatcctgcct gtgtccatga ccaagaccag cgtggattgc 2220

accatgtaca tctgcggcga ttccaccgag tgcagcaatc tgctgctgca gtacggcagc 2280

ttctgcaccc agctgaacag ggccctgacc ggcatcgccg tggagcagga caagaacacc 2340

caggaggtgt tcgcccaggt gaagcagatc tacaagaccc ctcccatcaa ggatttcggc 2400

ggcttcaact tcagccagat cctgcctgat cctagcaagc ccagcaagag atcctttatc 2460

gaggatctgc tgttcaataa ggtgaccctg gccgacgccg gcttcatcaa gcagtacggc 2520

gactgtctgg gcgacatcgc cgccagggat ctgatctgcg cccagaagtt caacggcctg 2580

accgtgctgc cccccctgct gacagacgag atgatcgccc agtacaccag cgccctgctg 2640

gccggaacca tcacctccgg ctggaccttc ggcgccggag ctgctctgca gatccccttt 2700

gccatgcaga tggcctacag gtttaacggc atcggcgtga cccagaacgt gctgtacgag 2760

aatcagaagc tgatcgccaa ccagttcaat agcgccatcg gcaagatcca ggactccctg 2820

tccagcaccg cctccgccct gggaaagctg caggacgtgg tgaatcagaa cgcccaggcc 2880

ctgaataccc tggtgaagca gctgtcctcc aattttggcg ccatctccag cgtgctgaat 2940

gatatcctga gcagactgga taaggtggag gccgaggtgc agatcgacag gctgatcacc 3000

ggcagactgc agagcctgca gacctacgtg acccagcagc tgatcagggc cgccgagatc 3060

agagccagcg ccaacctggc cgccaccaag atgtccgagt gtgtgctggg ccagtccaag 3120

agagtggact tttgcggcaa gggctaccac ctgatgagct tccctcagag cgccccccac 3180

ggcgtggtgt ttctgcacgt gacctacgtg cctgcccagg agaagaactt taccaccgcc 3240

cctgccatct gtcacgatgg caaggcccac ttccctaggg agggcgtgtt tgtgagcaac 3300

ggcacccact ggttcgtgac ccagagaaac ttttacgagc cccagatcat caccaccgac 3360

aacacctttg tgtccggcaa ttgcgacgtg gtcattggca tcgtgaataa caccgtgtac 3420

gaccccctgc agcctgagct ggatagcttc aaggaggagc tggacaagta ctttaagaat 3480

cacacctccc ctgatgtgga cctgggcgat atctccggca tcaatgccag cgtggtgaac 3540

atccagaagg agatcgacag actgaatgag gtggccaaga atctgaatga gagcctgatc 3600

gacctgcagg agctgggcaa gtacgagcag tacatcaagt ggccctggta catctggctg 3660

ggctttatcg ccggcctgat cgccatcgtg atggtgacca tcatgctgtg ttgtatgacc 3720

agctgttgca gctgcctgaa gggctgttgc agctgtggct cctgttgtaa gtttgatgag 3780

gatgattccg agcccgtgct gaagggcgtg aagctgcact acaccggctc cggcggctcc 3840

ggaggaagcg ctggaggagg actgaacgat atctttgagg cccagaagat cgagtgggga 3900

tccaccctga cagagcggct gagagagaag atcagccggg ccttctacaa ccacggcctg 3960

ctgtgcgcct cctatcccat ccctatcatc ctgttcacag gcttttgtat cctggcctgc 4020

tgttaccctc tgctgaagct gccactggga ctgaacgata tcttcgaggc ccagaagatc 4080

gagtggcacg agtaggcggc cgc 4103

<210> 2

<211> 1363

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

35 40 45

His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

50 55 60

Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

65 70 75 80

Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser

100 105 110

Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile

115 120 125

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Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr

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Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

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Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

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Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

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Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

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Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

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Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

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Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

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Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

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Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

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Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly

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