一种抗辐射作用蝉花多糖的分离纯化方法

技术领域

本发明属于抗辐射技术领域，具体涉及一种抗辐射作用蝉花多糖的分离纯化方法。

背景技术

紫外线是位于日光高能区的不可见光线，是电磁波谱中波长从10nm到400nm辐射的总称，因此不能引起人们的视觉。人体长期暴露在紫外线之下，皮肤会出现红斑、炎症、皮肤老化，严重者可引起皮肤癌。自本世纪70年代中期以来，由于人类科技的发展，大量使用一些化学试剂从而造成大气层中臭氧层的破坏，随着高空臭氧含量的逐年减少，患皮肤癌的人数正在世界范围内逐年增加。

在现今臭氧层空洞问题得不到真正意义上解决的情况下，如何在强烈的太阳紫外线辐射下保护好我们自己的健康成了一个具有重要意义的研究课题。研究表明，多数的大型食用和药用真菌(以下简称食药真菌)含有多糖、多肽、氨基酸、核苷、甾醇类、萜类、碱基类、维生素(如胡萝卜素、维生素E、维生素C)和无机离子(如铁、锌、锗、硒)等生物活性物质，具有抗辐射、降血脂、抑制肿瘤、增强免疫、改善造血功能等多种生物学作用[4,5]，而且针对食药真菌中的真菌多糖的研究发现，其中抗辐射作用的主要天然活性成分就是真菌多糖类，因此，针对真菌多糖的抗辐射作用研究也越来越受到相关科研人员的重视。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗辐射作用蝉花多糖的分离纯化方法，通过对蝉拟青霉多糖分离纯化条件的筛选，以及各分子量范围的多糖组分对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌经紫外辐射后的活菌率的影响，得到蝉拟青霉多糖提取的最优条件，并探讨其抗紫外辐射的作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了蝉拟青霉多糖的分离提取方法，包括以下步骤：

蝉拟青霉固体培养残基粉碎后与50％乙醇混合后进行回流提取，滤液浓缩后与95％乙醇混合，静置4h后离心收集沉淀，洗涤沉淀后真空干燥，得蝉拟青霉多糖。

优选的是，所述粉碎后收集60～80目筛下的残留物。

优选的是，所述50％乙醇的体积为所述残留物体积的10倍。

优选的是，所述回流提取的次数为3次，每次提取1.5h，合并滤液。

优选的是，所述滤液的浓缩比为10：1，而后与95％乙醇混合至乙醇终浓度为60％。

优选的是，在所述真空干燥后，还包括依次利用陶瓷膜和有机卷式膜纯化。

本发明还提供了利用上述的分离提取方法得到的蝉拟青霉多糖在制备抗紫外辐射制剂中的应用。

优选的是，所述蝉拟青霉多糖的分子量为1000～1000000Da。

优选的是，所述蝉拟青霉多糖的分子量为300000～1000000Da。

本发明还提供了一种抗紫外辐射的制剂，以分子量为300000～1000000的蝉拟青霉多糖为有效成分。

有益效果：本发明提供了蝉拟青霉多糖的分离提取方法，实施例中研究蝉拟青霉多糖分离提取的最佳条件，以及不同分子量的多糖组分的抗紫外辐射作用,并根据CFU确定蝉拟青霉多糖抗辐射作用的活性物质的大致分子量范围，为进一步分离提取抗辐射物质的分离提纯提供实验基础。蝉拟青霉多糖制备最优工艺为：原药材加10倍量50％乙醇超声提取1.5h，重复3次，合并3次提取液；70℃减压浓缩至原体积的十分之一；上述浓缩液搅拌下加入3倍体积的95％乙醇，静置4小时以上，离心收集沉淀；用3倍体积的乙醇洗涤沉淀，离心，真空干燥得到蝉拟青霉多糖。一定分子量范围的蝉拟青霉多糖具有抗紫外辐射的作用，以多糖分子量范围为300000～1000000的蝉拟青霉多糖的抗辐射效果最好。

具体实施方式

实施例1

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1仪器

FA1004电子天平(上海精科天平)；高速中药粉碎机；SK2200LH超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；RE52-3旋转蒸发仪(上海沪西分析仪器厂)；冷冻干燥机；751－GW分光光度计；DKS-24型电热恒温水浴锅；卷式膜设备RNM-1812G(杭州瑞纳膜工程有限公司)；陶瓷膜设备(杭州瑞纳膜工程有限公司)；实验室专用超纯水机(四川沃特尔水处理设备有限公司)，智城恒温摇床设备ZHWY-2102C(上海智城分析仪器制造有限公司)。

1.1.2试剂

葡萄糖标准品(中国药品生物制品检定所)；浓硫酸、苯酚、乙醇等试剂均为分析纯；生理盐水(NS)。

1.1.3材料

蝉拟青霉固体培养残基。

1.2实验方法

1.2.1蝉拟青霉多糖的提取制备

将蝉拟青霉固体培养残基粉碎过60～80目筛；向粉碎的原料中加入10倍体积的50％乙醇，进行热回流提取，过滤，滤渣重复进行上述步骤，重复1～3次；合并多次滤液。70℃减压浓缩至原体积的十分之一；上述浓缩液搅拌下加入3倍体积的95％乙醇，静置4小时以上，离心收集沉淀；用3倍体积的乙醇洗涤沉淀，离心，真空干燥得到深褐色粉末状的蝉拟青霉多糖产品。

1.2.2蝉拟青霉多糖含量测定方法的建立

1.2.2.1供试液的制备

取蝉拟青霉多糖1.25g用250mL蒸馏水溶解，以3000r/min离心15min，取上清液，加蒸馏水配成250mL多糖溶液。精密移取提取液2mL，定容至50mL，混匀即得。

1.2.2.2葡萄糖标准液的制备

精密称取葡萄糖标准品8.720mg，加蒸馏水溶解并定容至100mL，则其浓度为87.20μg/mL。

1.2.2.3最大吸收波长的选择

精密量取供试液1.0mL置于25mL具塞试管中，加入5％苯酚1mL，混匀，迅速加浓硫酸5mL，混匀，放置5min，置沸水浴中加热15min，取出后置冷水浴中冷却5min。于180～1100nm波长范围内扫描，结果最大吸收波长为487.0nm。

1.2.2.4线性关系的考察与回归方程的建立

精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL葡萄糖标准液置于五管25mL具塞试管中，每管再依次分别加蒸馏水0.8、0.6、0.4、0.2、0.0mL至1mL，再分别加入5％苯酚1mL，混匀，迅速加浓硫酸5mL，混匀，放置5min，置沸水浴中加热15min，取出后置冷水浴中冷却5min。另以1.0mL蒸馏水同上平行操作为空白对照，于其最大吸收波长487.0nm处测其吸光度值。以浓度X对吸光度Y作图，得回归方程：Y＝0.0094X+0.0021，r＝1.0000。

1.2.2.5精密度实验

精密吸取供试液1.0mL置于25mL具塞试管中，加入5％苯酚1mL，混匀，迅速加浓硫酸5mL，混匀，放置5min，置沸水浴中加热15min，取出后置冷水浴中冷却5min。另以1.0mL蒸馏水同上平行操作为空白对照，于其最大吸收波长487.0nm处，重复测定吸光度5次。结果RSD为0.995％。

1.2.2.6稳定性实验

精密吸取1.0mL供试液置于25mL具塞试管中，按1.2.2.5精密度试验项方法操作，分别在0、0.5、1、2、3、4、6、8h测定吸收度，结果RSD为1.19％。

1.2.2.7重现性实验

分别准确称取同一批蝉拟青霉多糖5份，按1.2.2.1项下制备供试品溶液，按1.2.2.5精密度试验项方法操作测定，结果RSD为1.95％。

1.2.2.8回收率实验

精密取已知多糖质量分数的蝉拟青霉多糖5份，分别加入精密测定的葡萄糖标准品约1.4mg，按2.1.2项下制备供试品溶液，按2.1.6精密度试验项方法操作测定，结果加样回收率在97.38％～98.67％，平均回收率为98.08％，RSD为0.70％，符合回收率试验要求。

1.2.3蝉拟青霉多糖提取纯化工艺的优化

1.2.3.1提取条件的选择

选择提取时间、提取次数、加50％乙醇量3个因素为考察对象，根据初步试验，每个因素确定3个水平，采用L9(34)正交表安排试验，见表1。

表1因素水平表

每组取40g蝉拟青霉固体培养残基，按正交表进行实验，即每次加C倍50％乙醇量热回流提取Ah，提取B次，合并B次提取液。按1.2.2项方法测定多糖含量。

1.2.3.2纯化条件的选择

选择提取液的浓缩量，醇沉的浓度，醇沉的时间3个因素为考察对象，根据初步试验，每个因素确定3个水平，采用L

表2因素水平表

取200g蝉拟青霉固体培养残基用上述优化好的提取条件提取，提取液平均分成9组，按正交表进行实验即：每组浓缩A倍，加95％乙醇使其浓度达B％，静置Ch。按1.2.2项方法测含量。

1.2.4蝉拟青霉各分子量范围的多糖组分的分离纯化

1.2.4.1陶瓷膜分离

将实验方法1.2.1蝉拟青霉多糖提取制备过程中最后一步用3倍体积的乙醇洗涤得到的沉淀用适量去离子水稀释溶解至一定体积，将稀释溶解蝉拟青霉多糖的溶液加到陶瓷膜分离机中，先利用截留能力为200纳米的陶瓷膜，将我们先前加入到陶瓷膜分离机中的蝉拟青霉多糖溶液分离成两部分，即200纳米陶瓷膜的截流液A(多糖分子直径大小大于200纳米)与透过液B(多糖分子直径大小小于200纳米)，再将200纳米陶瓷膜的透过液加入陶瓷膜分离器中，利用截留能力为50纳米的陶瓷膜，将我们加入到陶瓷膜分离机中的蝉拟青霉多糖溶液分离成两部分，即50纳米陶瓷膜的截流液C(多糖分子直径大小大于50纳米)和透过液D(多糖分子直径大小小于50纳米)，最终通过两次过膜，我们将原本的蝉拟青霉多糖溶液按多糖分子直径大小分成了三部分，分别是多糖分子直径大小大于200纳米的溶液A、多糖分子直径大小在50纳米与200纳米之间的溶液C和多糖直径大小小于50纳米的溶液D。

1.2.4.2有机卷式膜分离

将先前得到的溶液D再进一步的分离提取。将溶液D加入到卷式膜分离机中，先利用截留分子量为10000Da的卷式膜，将加入到卷式膜分离机中的蝉拟青霉多糖溶液D分离成两部分，即截留分子量为10000Da卷式膜的截流液E(多糖分子量大于10000Da)和透过液F(多糖分子量小于10000Da)；接着将多糖溶液F加入到卷式膜分离机中，利用截留分子量为3000Da的卷式膜，将加入到卷式膜分离机中的蝉拟青霉多糖溶液F分离成两部分，即截留分子量为3000Da卷式膜的截流液G(多糖分子量大于3000Da)和透过液H(多糖分子量小于3000Da)；然后将多糖溶液H加入到卷式膜分离机中，利用截留分子量为1000Da的卷式膜，将加入到卷式膜分离机中的蝉拟青霉多糖溶液H分离成两部分，即截留分子量为1000Da卷式膜的截流液I(多糖分子量大于1000Da)和透过液J(多糖分子量小于3000Da)；最后将多糖溶液J加入到卷式膜分离机中，利用截留分子量为150Da的卷式膜，将加入到卷式膜分离机中的蝉拟青霉多糖溶液J分离成两部分，即截留分子量为150Da卷式膜的截流液K(多糖分子量大于150Da)和透过液L(多糖分子量小于150Da)。这样，经过四次过膜，我们将原本的溶液D按多糖分子量(Da)的大小分成了五部分，分别是多糖分子量(Da)大于10000的溶液E、多糖分子量(Da)在3000与10000之间的溶液G、多糖分子量(Da)在1000与3000之间的溶液I、多糖分子量(Da)在150与1000之间的溶液K和多糖分子量(Da)小于150的溶液L。

1.2.4.3各分子量多糖组分的纯化

将先前通过膜分离得到的共7种不同的多糖溶液分别在70℃条件下减压浓缩至原体积的十分之一；上述浓缩液搅拌下加入3倍体积的95％乙醇，静置4小时以上，离心收集沉淀；用3倍体积的乙醇洗涤沉淀，离心，真空干燥得到深褐色粉末状的蝉拟青霉多糖产品。

1.2.5蝉拟青霉多糖抗紫外辐射实验

1.2.5.1抗紫外辐射实验多糖溶液的配置

将真空干燥得到的各组分多糖粉末用生理盐水配置成最终多糖浓度为50g/l的溶液备用。

1.2.5.2LB培养基的制备

配制每升培养基应往950ml去离子水中加入胰蛋白胨(Tryptone)10g；酵母提取物(Yeast extract)5g；氯化钠(NaCl)10g。另外根据经验值用NaOH调节该培养基的pH，使其达到7.4(该pH适合目前使用最广的原核表达菌种E.coli的生长)。

1.2.5.3实验用菌的准备

将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌接种于LB培养基中，120r/min、37℃恒温条件下培养24h，8000r/min离心收集菌体，以生理盐水制备成约8～10×10

1.2.5.4实验分组

实验用培养基的配置：在3ml的LB基础培养基中分别添加四种不同分子量的蝉拟青霉多糖，且每一种分子量的蝉拟青霉多糖添加量分为四个量，分别为0.25ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml，最后用生理盐水都将量补齐至2ml，这样最后每管的量都为5ml，实验设5次重复。在配好的实验用培养基中，分别接种100ul的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。再将其摇床培养24h，培养条件37℃、120r/min。

1.2.5.5紫外辐射处理及CFU统计

将培养后的各组分别取5ml菌悬液于9cm的培养皿中，置30W UV紫外灯下40cm处振荡辐照处理120s，然后将细菌悬浮液定量稀释后，取一定量的不同稀释度的细菌悬浮液，分别在琼脂胶LB平板上培养，从形成菌落的数目和稀释度，可算出每毫升菌悬液中的细菌数：

每毫升菌悬液中的细菌数＝平板上CFU*稀释倍数/平板上加菌液的量(ml)

平板菌落数的选择：选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2以代表全皿菌落数。平板内如有链状菌落生长时(菌落之间无明显界线)，若仅有一条链，可视为一个菌落；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。

稀释度的选择：应选择平均菌落数在30～300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之；若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30～300之间，则视两者之比如何来决定，若其比值小于或等于2，应报告其平均值，若大于2，则报告其中较小的数字；若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之；若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之；若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之；若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，其中一大部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

菌落数的报告：菌落数在100以内的，按其实有数报告，大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数，也可采用10的指数来表示。

1.2.5.6对各组进行显著性分析，分析数据。

2结果与分析

2.1蝉拟青霉多糖提取条件的选择

从表3中可以看出，蝉拟青霉多糖的最佳提取条件为A

表3提取条件正交试验结果

2.2蝉拟青霉多糖纯化条件的选择

从表4中可以看出，蝉拟青霉多糖的最佳纯化条件为A

表4纯化条件正交试验结果

2.3蝉拟青霉多糖抗紫外辐射实验

2.3.1对试验菌的活菌数进行统计，将各试验菌的活菌数数据通过SPSS13软件进行显著性检验分析，结果如下：

因分子量范围为小于150、150～1000和大于100万的三种多糖组分处理的平板中活菌数均为0，故认为此三个组分的多糖在本次试验中不具有抗辐射作用，不计入此次数据统计。

2.3.2不同分子量的蝉拟青霉多糖对大肠杆菌经紫外辐射后的活菌率的影响

从表5中可知，蝉拟青霉多糖对大肠杆菌的紫外辐射后的活菌数有明显的增加作用，其中分子量范围在300000～1000000的蝉拟青霉多糖对其的作用最好；而且随着蝉拟青霉多糖的浓度增加，其对大肠杆菌紫外辐射后的活菌数增加的效果就越好。

表5不同分子量的蝉拟青霉多糖对大肠杆菌活菌数的显著性检验

注：以上表中的活菌数为5次重复试验的平均值

2.3.2不同分子量的蝉拟青霉多糖对金黄色葡萄球菌经紫外辐射后的活菌率的影响

从表6中可知，蝉拟青霉多糖对金黄色葡萄球菌的紫外辐射后的活菌数有明显的增加作用，其中分子量范围在300000～1000000的蝉拟青霉多糖对其的作用最好；而且随着蝉拟青霉多糖的浓度增加，其对金黄色葡萄球菌紫外辐射后的活菌数增加的效果就越好。

表6不同分子量的蝉拟青霉多糖对金黄色葡萄球菌活菌数的显著性检验

注：以上表中的活菌数为5次重复试验的平均值

试验结果表明添加有蝉拟青霉多糖的LB基础培养基中试验菌的每毫升菌悬液中的细菌数均有所增加，与生理盐水阴性对照组对比差异达到极显著，由此可见一定分子量的蝉拟青霉多糖的确具有抗紫外辐射的作用，并且不同分子量范围的蝉拟青霉多糖所具有的抗紫外辐射作用存在显著差异，其中分子量范围在300000～1000000的蝉拟青霉多糖对试验菌的活菌数影响最大，其抗紫外辐射作用均极显著得优于另外三种分子量的多糖。不同分子量的蝉拟青霉多糖对试验菌的活菌数的增加量随着多糖浓度的加大而增强，其中分子量范围为300000～1000000的蝉拟青霉多糖在添加量为1.0ml时，其对试验菌的活菌数增加量的影响极显著优于其他三组；通过两种试验菌的对比发现，蝉拟青霉多糖对金黄色葡萄球菌的活菌数的影响比对大肠杆菌的活菌数的影响要大。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。