一种运动发酵单胞菌基因表达严谨调控系统的构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种运动发酵单胞菌基因表达严谨调控系统的构建方法和应用。

背景技术

基因表达调控是生物体内基因表达的控制调节，是一个具有多层次性和复杂性的过程。基因表达调控包括基因水平、转录水平、转录后水平和翻译水平等多个层次的调控，在时间和空间上对细胞中基因的表达起到调节作用。然而，由于基因表达调控过程十分复杂，在基因表达过程中可能对宿主细胞产生毒害或致死作用，制约了基因功能的研究或细胞模型的建立等相关研究。

尽管不同的原核细胞或真核细胞表达调控系统得到了发展，目前的表达调控系统仍存在一定的局限性。例如，对于原核生物而言，其调控表达系统诱导过程缓慢、效率低，缺乏诱导特异性和表达的精确调控等，限制了表达系统的应用。故而期望出现更丰富的基因严谨调控系统，使基因的时空表达受到高效的严谨控制，有效使用细胞的资源。

运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)是一种兼性厌氧的革兰氏阴性菌，是目前已知唯一通过Entner-Doudoroff(ED)途径进行厌氧发酵的微生物，具有基因组小，乙醇产率高，耐受高糖、高酒精，生长温度(24～45℃)和pH(4.0～8.0)范围广泛等优良特性。由于运动发酵单胞菌的这些特性，使得它在工业化生产酒精等产品具有广阔的应用前景。

近年来也有针对运动发酵单胞菌开展的大量系统与合成生物学、基因工程与代谢工程等方面的研究成果。高通量测序技术的发展使得运动发酵单胞菌多个菌株的基因组序列得到了报道、更新和准确注释，基因组代谢网络建模也为细胞的理性改造和开发提供了指导；内外源CRISPR-Cas基因组编辑体系的开发也提供了新的遗传工具。同时，基于双报告基因的生物元件预测与鉴定系统与组学数据的结合，也成功预测和鉴定了一批包括强、中、弱组成性启动子与乙醇诱导性启动子及不同强度的RBS等生物元件，这些技术和方法的建立均为运动发酵单胞菌的细胞工厂的开发提供了技术支撑。但是，目前针对运动发酵单胞菌基因精准调控系统依然非常缺乏，限制了运动发酵单胞菌在基因功能解析、线路构建、代谢途径时空调控等方面的应用。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种运动发酵单胞菌基因表达严谨调控系统的构建方法和应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种运动发酵单胞菌基因表达严谨调控系统的构建方法，包括以下步骤：

步骤1：以pZM39(Genbank ID：CP023718)质粒为骨架，利用Gibson组装将T7 RNAP基因、araC基因连接，得到重组质粒；

其中，使用诱导性启动子P

步骤2：将步骤1中得到的重组质粒转入运动发酵单胞菌(ZM4)感受态细胞中，获取单菌落，实现T7表达系统在运动发酵单胞菌中的建立。

进一步地，将待表达基因片段转入已建立T7表达系统的运动发酵单胞菌中进行表达。

进一步地，将待表达基因片段转至穿梭质粒中再进行表达；所述穿梭质粒为运动发酵单胞菌-大肠杆菌穿梭表达质粒。

进一步地，所述穿梭表达质粒通过将运动发酵单胞菌的复制子替换掉大肠杆菌质粒pET22b或pET28a上的f1 origin获得。

进一步地，将pET22b的抗性基因替换为抗卡那霉素基因。

进一步地，所述T7 RNAP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，P

本发明还提供了如上述的一种运动发酵单胞菌基因表达严谨调控系统的构建方法在利用运动发酵单胞菌进行基因表达中的应用。

本发明还提供了一种运动发酵单胞菌-大肠杆菌穿梭表达质粒，所述穿梭表达质粒为pTZ22b，通过将运动发酵单胞菌的复制子替换掉pET22b上的f1 origin，并将抗性基因替换为抗卡那霉素基因获得。

本发明还提供了一种运动发酵单胞菌-大肠杆菌穿梭表达质粒，所述穿梭表达质粒为pTZ28a，通过将运动发酵单胞菌的复制子替换掉pET28a上的f1 origin基因获得。

本发明还提供了如上述一种运动发酵单胞菌-大肠杆菌穿梭表达质粒在利用运动发酵单胞菌进行基因表达中的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明尝试在运动发酵单胞菌中构建T7表达系统，用于严谨调控线路的构建，帮助解析有毒基因的功能及实现代谢途径在运动发酵单胞菌中的严谨调控；同时也将构建可以在运动发酵单胞菌与大肠杆菌中使用的穿梭质粒，方便质粒的构建及提高外源基因在运动发酵单胞菌中的表达效率，为后续蛋白的表达与分泌及代谢工程途径优化调控奠定基础。

运动发酵单胞菌T7表达系统的建立将完善运动发酵单胞菌的基因严谨调控与遗传操作工具体系，解决运动发酵单胞菌基因精准调控系统缺乏的问题，为运动发酵单胞菌在基因功能解析、线路构建、代谢途径时空调控提供更多可能。同时，由于运动发酵单胞菌是GRAS菌株，代谢产物相对单一，具有作为蛋白安全表达系统的优势，可替代大肠杆菌作为蛋白安全表达的细胞工厂。

附图说明

图1是本申请的项目概要图；

图2是调控T7 RNAP表达的重组质粒结构图；

图3是质粒p39-Ptet-araC-T7P-Cm构建设计图；

图4是重组质粒电转入菌株ZM4后的凝胶电泳结果；

图5是pTZ系列载体设计图谱；

图6是两种质粒所得单克隆菌体PCR凝胶电泳图；

图7是对照菌株和突变株在指数期和稳定期荧光强度值；

图8是3个质粒在运动发酵单胞菌中表达的SDS-PAGE图；1:pEZ15A-sfGFP15-NSP7、2:pTZ22b-sfGFP15-NSP7、3:pTZ28a-sfGFP15-NSP7。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。

本发明中涉及的基因、蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。

本发明披露了一种运动发酵单胞菌基因表达严谨调控系统的构建方法和应用。本申请将通过构建四环素与阿拉伯糖共同诱导表达T7 RNA聚合酶的穿梭载体，实现具有强正交性T7表达系统在运动发酵单胞菌中的建立。同时，基于大肠杆菌pET质粒，通过添加运动发酵单胞菌的复制子构建有P

T7 RNAP具备一定的毒性，所以对其表达进行调控：T7 RNAP由启动子P

此外，选取数种外源分泌蛋白Superfold GFP(sfGFP)，测试其在运动发酵单胞菌的分泌能力，可以与上述建立的系统实现待表达蛋白的高效表达与一步分泌。

整个技术方案概要图如图1所示。下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例

步骤一：利用pZM39质粒为骨架，通过Gibson组装构建调控T7 RNAP表达的重组质粒；引物中划线部分即为连接同源臂。片段扩增体系及程序如下：

表1.PCR反应体系

表2.PCR反应程序

本发明中使用的T7 RNAP基因序列(密码子优化后)如下：

>T7 RNAP

atgaacacgattaacatcgctaagaacgacttctctgacatcgaactggctgctatcccgttcaacactctggctgaccattacggtgagcgtttagctcgcgaacagttggcccttgagcatgagtcttacgagatgggtgaagcacgcttccgcaagatgtttgagcgtcaacttaaagctggtgaggttgcggataacgctgccgccaagcctctcatcactaccctactccctaagatgattgcacgcatcaacgactggtttgaggaagtgaaagctaagcgcggcaagcgcccgacagccttccagttcctgcaagaaatcaagccggaagccgtagcgtacatcaccattaagaccactctggcttgcctaaccagtgctgacaatacaaccgttcaggctgtagcaagcgcaatcggtcgggccattgaggacgaggctcgcttcggtcgtatccgtgaccttgaagctaagcacttcaagaaaaacgttgaggaacaactcaacaagcgcgtagggcacgtctacaagaaagcatttatgcaagttgtcgaggctgacatgctctctaagggtctactcggtggcgaggcgtggtcttcgtggcataaggaagactctattcatgtaggagtacgctgcatcgagatgctcattgagtcaaccggaatggttagcttacaccgccaaaatgctggcgtagtaggtcaagactctgagactatcgaactcgcacctgaatacgctgaggctatcgcaacccgtgcaggtgcgctggctggcatctctccgatgttccaaccttgcgtagttcctcctaagccgtggactggcattactggtggtggctattgggctaacggtcgtcgtcctctggcgctggtgcgtactcacagtaagaaagcactgatgcgctacgaagacgtttacatgcctgaggtgtacaaagcgattaacattgcgcaaaacaccgcatggaaaatcaacaagaaagtcctagcggtcgccaacgtaatcaccaagtggaagcattgtccggtcgaggacatccctgcgattgagcgtgaagaactcccgatgaaaccggaagacatcgacatgaatcctgaggctctcaccgcgtggaaacgtgctgccgctgctgtgtaccgcaaggacaaggctcgcaagtctcgccgtatcagccttgagttcatgcttgagcaagccaataagtttgctaaccataaggccatctggttcccttacaacatggactggcgcggtcgtgtttacgctgtgtcaatgttcaacccgcaaggtaacgatatgaccaaaggactgcttacgctggcgaaaggtaaaccaatcggtaaggaaggttactactggctgaaaatccacggtgcaaactgtgcgggtgtcgataaggttccgttccctgagcgcatcaagttcattgaggaaaaccacgagaacatcatggcttgcgctaagtctccactggagaacacttggtgggctgagcaagattctccgttctgcttccttgcgttctgctttgagtacgctggggtacagcaccacggcctgagctataactgctcccttccgctggcgtttgacgggtcttgctctggcatccagcacttctccgcgatgctccgagatgaggtaggtggtcgcgcggttaacttgcttcctagtgaaaccgttcaggacatctacgggattgttgctaagaaagtcaacgagattctgcaggctgatgctatcaacgggaccgataacgaagtagttaccgtgaccgatgagaacactggtgaaatctctgagaaagtcaagctgggcactaaggcactggctggtcaatggctggcttacggtgttactcgcagtgtgactaagcgttcagtcatgacgctggcttacgggtccaaagagttcggcttccgtcaacaagtgctggaagataccattcagccagctattgattccggcaagggtctgatgttcactcagccgaatcaggctgctggatacatggctaagctgatttgggaatccgtttccgttaccgttgttgctgctgttgaagcaatgaactggcttaagtctgctgctaagctgctggctgctgaggtcaaagataagaagactggagagattcttcgcaagcgttgcgctgtgcattgggtaactcctgatggtttccctgtgtggcaggaatacaagaagcctattcagacgcgcttgaacctgatgttcctcggtcagttccgcttacagcctaccattaacaccaacaaagatagcgagattgatgcacacaaacaggagtctggtatcgctcctaactttgtacacagccaagacggtagccaccttcgtaagactgtagtgtgggcacacgagaagtacggaatcgaatcttttgcactgattcacgactccttcggtaccattccggctgacgctgcgaacctgttcaaagcagtgcgcgaaactatggttgacacatatgagtcttgtgatgtactggctgatttctacgaccagttcgctgaccagttgcacgagtctcaattggacaaaatgccagcacttccggctaaaggtaacttgaacctccgtgacatcttagagtcggacttcgcgttcgcgtaa

扩增片段T7 RNAP(含T7terminator)的引物为(PCR体系及程序见表1与表2)：

T7 RNAP-F：atgaacacgattaacatcgctaagaac

T7 RNAP-R：agtagtaggttgaggccgttga

使用诱导性启动子P

>P

aaaccaattgtccatattgcatcagacattgccgtcactgcgtcttttactggctcttctcgctaaccaaaccggtaaccccgcttattaaaagcattctgtaacaaagcgggaccaaagccatgacaaaaacgcgtaacaaaagtgtctataatcacggcagaaaagtccacattgattatttgcacggcgtcacactttgctatgccatagcatttttatccataagattagcggatcctacctgacgctttttatcgcaactctctactgtttctccataagtattcaaatgatctaaagaggagaaaggatctccc

扩增片段P

P

P

使用诱导性启动子P

>araC

atggctgaagcgcaaaatgatcccctgctgccgggatactcgtttaatgcccatctggtggcgggtttaacgccgattgaggccaacggttatctcgatttttttatcgaccgaccgctgggaatgaaaggttatattctcaatctcaccattcgcggtcagggggtggtgaaaaatcagggacgagaatttgtttgccgaccgggtgatattttgctgttcccgccaggagagattcatcactacggtcgtcatccggaggctcgcgaatggtatcaccagtgggtttactttcgtccgcgcgcctactggcatgaatggcttaactggccgtcaatatttgccaatacggggttctttcgcccggatgaagcgcaccagccgcatttcagcgacctgtttgggcaaatcattaacgccgggcaaggggaagggcgctattcggagctgctggcgataaatctgcttgagcaattgttactgcggcgcatggaagcgattaacgagtcgctccatccaccgatggataatcgggtacgcgaggcttgtcagtacatcagcgatcacctggcagacagcaattttgatatcgccagcgtcgcacagcatgtttgcttgtcgccgtcgcgtctgtcacatcttttccgccagcagttagggattagcgtcttaagctggcgcgaggaccaacgtatcagccaggcgaagctgcttttgagcaccacccggatgcctatcgccaccgtcggtcgcaatgttggttttgacgatcaactctatttctcgcgggtatttaaaaaatgcaccggggccagcccgagcgagttccgtgccggttgtgaagaaaaagtgaatgatgtagccgtcaagttgtcataa

扩增片段araC的引物为：

araC-F：atggctgaagcgcaaaatgatcc

araC-R：

>TetR+P

ttaagacccactttcacatttaagttgtttttctaatccgcatatgatcaattcaaggccgaataagaaggctggctctgcaccttggtgatcaaataattcgatagcttgtcgtaataatggcggcatactatcagtagtaggtgtttccctttcttctttagcgacttgatgctcttgatcttccaatacgcaacctaaagtaaaatgccccacagcgctgagtgcatataatgcattctctagtgaaaaaccttgttggcataaaaaggctaattgattttcgagagtttcatactgtttttctgtaggccgtgtacctaaatgtacttttgctccatcgcgatgacttagtaaagcacatctaaaacttttagcgttattacgtaaaaaatcttgccagctttccccttctaaagggcaaaagtgagtatggtgcctatctaacatctcaatggctaaggcgtcgagcaaagcccgcttattttttacatgccaatacaatgtaggctgctctacacctagcttctgggcgagtttacgggttgttaaaccttcgattccgacctcattaagcagctctaatgcgctgttaatcactttacttttatctaatctagacatcattaattcctaatttttgttgacactctatcgttgatagagttattttaccactccctatcagtgatagagaaaagtattcaaatgatcttccctatcagtgatagagaaaagtattcaaatgatcttccctatcagtgatagagaaaagtattcaaatgatctaaagaggagaaaggatctccc

扩增片段TetR+P

TetR-F：

Ptet-R：

重组质粒载体从pZM39上反扩得到(PCR体系及程序见表1与表2)，扩增骨架的引物为：

39p-F：cgtcccatagatctcgagc

39p-R：ctctagaagcggccgcg

利用Gibson组装，将以上片段与骨架连接(片段连接次序依次为P

将T7 RNAP编码基因构建到穿梭质粒pZM39上，得到重组质粒p39-Ptet-araC-T7P-Cm，构建设计图如图3所示。

步骤二：得到质粒后，将质粒电转到运动发酵单胞菌(ZM4)感受态细胞中，确定最终菌株。

用提取的质粒对ZM4进行电转化：取ZM4感受态细胞于冰上，待感受态细胞融化后取50μL加入预冷的电转杯中，并在电转杯中加入500ng质粒；电转条件为1.8kV，25μF，200Ω。电转完毕后于1mL的RM液体培养基中于30℃培养箱中复苏；复苏6-12h的培养物于6000rpm，1min离心，除去900μL上清；用剩余150μL培养基重悬，全部涂布于RC氯霉素抗性(120μg/mL)平板，30℃倒置培养2天。2天后挑选单菌落，用合适的引物通过PCR进行验证。

重组质粒电转入菌株ZM4后的凝胶电泳结果如图4所示。

步骤三：将上一步得到的菌株制备成感受态细胞。

(1)挑取正确的单菌落到装有约10mL的RC(Cm:120μg/mL)液体培养基的细菌瓶中，30℃培养过夜(可以设置不同体积的培养基，以保证次日活化菌液处于对数期)。

(2)转接适量处于对数期的菌液到装有200mL RC(Cm:120μg/mL)液体培养基的500mL三角瓶中(装瓶量按40％计)，使初始OD

(3)用4个50mL圆底离心管收集菌体(25℃，4,000rpm，10min)，离心后在超净工作台内小心倒掉上清；

(4)每管加入约5mL无菌水，重悬菌体，将4管菌体集中在一个离心管内，用无菌水补齐至40mL，重悬并洗涤菌体；另准备一个等重量的离心管，与其一起离心；离心(25℃，4,000rpm，10min)后在超净工作台内小心倒掉上清；

(5)用40mL 10％甘油重悬并洗涤菌体，离心(25℃，4,000rpm，10min)后在超净工作台内小心倒掉上清。

(6)再次用40mL 10％甘油重悬并洗涤菌体，离心(25℃，4,000rpm，10min)后在超净工作台内小心倒掉上清。

(7)加入200μL 10％甘油重悬菌体，将每50μL菌液分装在1mm电转杯，细胞浓度可达到10

(8)测试感受态细胞的转化效率以及是否染菌。

步骤四：以pET载体为基础，通过添加运动发酵单胞菌的复制子，构建运动发酵单胞菌-大肠杆菌穿梭表达质粒(pTZ系列质粒)。

由于不同物种对简并密码子使用频率不同，具有一定的偏爱性，而pET22b和pET28a从BamHl开始的识别序列不同，pTZ28a从BamHl识别序列GGA三联密码子开始表达，而pTZ22b从GAT开始，故尝试使用两种质粒，通过后续蛋白表达的对比筛选出适合运动发酵单胞菌的穿梭质粒。构建的pTZ28a-sfGFP15-NSP7和pTZ22b-sfGFP15-NSP7二个质粒的设计图谱如图5所示。

使用的运动发酵单胞菌的复制子序列如下：

>pZymo_Ori

acggtgagctggtgacctgccttatctctttccccagtagctaaaaatagggtggctttgcccgtgtatataaccaacagctttctcatggtttttccgaggcaggattcaacgaatttccccactaggaagaactaagaaagggaatcgtgaaaatatccctaaaatagggaagtcgattttcagaatctgtgaaggggtctatcaatattgattaaaccgtctatcaaaaaaaggggtaaaattgatagaccttgcctcattcgatgaataggtataatcaaaaaatgtggtttttttgattaaaggtttatcaaatatggcgacaaaattgagaaagcagccaatcagatatgacgagaatcctttcatcgaaggtatggttgtgccagttaaaagtcagagggttcagttatctcgattaggacgagatgataacattctggtcaatcaagccactggtgagatgcaaggcactcatgtgacgacttacagacgtgttgatagtgaagaatttgtaaaattatttagcaccaatatcgcgctaacttttgaactaggagccgctggaataaaagctttcagcgttctggtttggatacttcaagacaaaggcatcagcaaagacctcgtccctttagacaaattcgttttagaggactttcttaacgcacaagaaaaaaaactggcactatctcaagctacctttgcaagaggtctagccgaattagaaaaagctaaaatcattgcaaagcatgttcgccaaggatggtattttattaatcctaatttcgttttcaatggcgaccgcgtagctttcacaacagttatagaacgcaaaaagacgctccaaaagcaagacgaatcagaataa

扩增运动发酵单胞菌的复制子的引物为：

zymo-ori-F：acggtgagctggtgacctg

zymo-ori-R：

将运动发酵单胞菌的复制子替换掉质粒pET22b和pET28a上的f1 origin，以常使用的质粒pET22b和pET28a作为模板，反扩得到需要加上运动发酵单胞菌的复制子的载体，扩增引物为：

22b-FK-F：caggtggcacttttcgggg

22b-FK-R：

28a-FK-F：caggtggcacttttcgggga

28a-FK-R：

通过Gibson组装将以上两个载体分别与运动发酵单胞菌的复制子连接，得到重组的穿梭质粒pTZ22b和pTZ28a。

为排除不同抗生素对基因表达的影响，将pTZ22b上的抗氨苄青霉素基因更换成与pTZ28a相同的抗卡那霉素基因：

以上述得到的质粒pTZ22b为模板，PCR扩增得到载体，使用引物为：

22b-Anti-V-F：

22b-Anti-V-R：

扩增抗卡那霉素基因的引物为：

Kana-F：

Kana-R：aattctcatgtttgacagcttatcatcgatg

步骤五：使用pTZ系列载体表达绿色荧光蛋白GFP。

以步骤四中得到的重组质粒为模板，进行PCR扩增获得骨架：

扩增pTZ22b骨架的引物为：

pTZ22b-F：

pTZ22b-R：

扩增pTZ28a骨架的引物为：

pTZ28a-F：

pTZ28a-R：

待表达基因sfGFP15+NSP7的序列如下：

>sfGFP15+NSP7

atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgcgcggcgagggcgagggcgatgccaccaacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcagcttcaaggacgacggcacctacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaacttcaacagccacaacgtctatatcaccgccgacaagcagaagaacggcatcaaggccgaatttgaaattcgtcataatgtggaagatggcagcgtgcagctggcggatcattatcagcagaataccccgattggcgatggcccagtgctgctgccggatgaccactatctgagcaccgaaagcgtgctgagcaaagatccgaatgaagatcgtgatcatatggtcctgctggaatttgtgaccgcggcaggcattgatctgggcatggatgaactgtataaattggaggttttgttccagggtccatctaaaatgtcagatgtaaagtgcacatcagtagtcttactctcagttttgcaacaactcagagtagaatcatcatctaaattgtgggctcaatgtgtccagttacacaatgacattctcttagctaaagatactactgaagcctttgaaaaaatggtttcactactttctgttttgctttccatgcagggtgctgtagacataaacaagctttgtgaagaaatgctggacaacagggcaaccttacaataa

扩增片段sfGFP15+NSP7的引物为：

sfGFP15-F：gtgagcaagggcgaggag

NSP7-R：ttattgtaaggttgccctgttgtcc

将以上骨架与片段通过Gibson组装得到重组质粒pTZ22b-sfGFP15+NSP7和pTZ28a-sfGFP15+NSP7。

对上述构建的重组质粒进行验证，并通过Sanger测序确定正确质粒。两种质粒所得单克隆菌体PCR凝胶电泳图如图6所示。

步骤六：将两个质粒及对照质粒分别电转到步骤三得到的运动发酵单胞菌感受态中。

用以上两个质粒以及对照质粒(pEZ15A-sfGFP15+NSP7)分别进行电转化，具体操作同上；

用RCK(Cm:120μg/mL；Kana:200μg/mL)平板进行筛选。

对照质粒区别于实验组为无T7启动子、T7终止子。

步骤七：通过添加诱导物四环素、阿拉伯糖来检验T7表达系统在运动发酵单胞菌中的工作情况。

将验证正确的单克隆分别于RCK(Cm:120μg/mL；Kana:200μg/mL)中进行活化；设置不同浓度梯度的四环素(Tc)、阿拉伯糖(Ara)(例如：0.8Tc/3Ara即0.8μg/mL四环素+3％阿拉伯糖)条件下以30℃，100rpm培养，每个样品、每个梯度均设置3个平行；培养至对数期后，每个平行取样200μL，12000rpm离心1min，去上清，并用1×PBS洗两次后重悬，用设定好的程序进行流式细胞仪检测荧光强度，为防止小概率及偶然事件，本发明将细胞收集事件设置为20,000。通过测试实验组与对照组基因的表达量(即荧光强度)来检验T7表达系统在运动发酵单胞菌中的工作情况。

步骤八：数据处理与结果分析

根据流式细胞仪得到的数据，每个样品取所有事件的sfGFP15的平均荧光值进行计算，以排除来自外界的误差影响。

对照菌株和突变株在指数期和稳定期荧光强度值如图7所示，其中X轴代表菌株中包含的蛋白表达质粒名称，Y轴代表荧光强度值。由图7可以看出，pEZ15A-sfGFP15-NSP7、pTZ22b-sfGFP15-NSP7、pTZ28a-sfGFP15-NSP7均可检测到荧光强度，且pTZ22b-sfGFP15-NSP7、pTZ28a-sfGFP15-NSP7两个pTZ系列质粒荧光强度远远高于pEZ15A-sfGFP15-NSP7质粒。

初步证明，T7表达系统在运动发酵单胞菌中起到一定的作用，pTZ22b和pTZ28a都表达正常，在只添加四环素或阿拉伯糖单一诱导物的情况下，蛋白表达量与在对照表达质粒pEZ15A-sfGFP-NSP7的表达接近。由于P

结果表明，在四环素和阿拉伯糖两种诱导物同时存在的时候荧光强度较对照组高，即目的蛋白GFP表达量更高；在没有添加阿拉伯糖诱导物的条件下，目的蛋白GFP没有表达或者表达量很低。实验结果说明T7表达系统在运动发酵单胞菌中成功建立，并且也实现了基因与线路的严谨调控与蛋白的高效表达。

pTZ系列载体pTZ22b-sfGFP15-NSP7、pTZ28a-sfGFP15-NSP7，与pEZ15A-sfGFP15-NSP7三个质粒同时在测试菌株ZM-1(p39-Ptet-Arac-T7P)中表达，蛋白预期大小为36kDa。蛋白表达情况通过SDS-PAGE初步检测。从图8可以看到，三个质粒中pTZ22b-sfGFP15-NSP7表达量最高，与流式细胞仪检测结果一致。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖北大学

<120> 一种运动发酵单胞菌基因表达严谨调控系统的构建方法和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2652

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaacacga ttaacatcgc taagaacgac ttctctgaca tcgaactggc tgctatcccg 60

ttcaacactc tggctgacca ttacggtgag cgtttagctc gcgaacagtt ggcccttgag 120

catgagtctt acgagatggg tgaagcacgc ttccgcaaga tgtttgagcg tcaacttaaa 180

gctggtgagg ttgcggataa cgctgccgcc aagcctctca tcactaccct actccctaag 240

atgattgcac gcatcaacga ctggtttgag gaagtgaaag ctaagcgcgg caagcgcccg 300

acagccttcc agttcctgca agaaatcaag ccggaagccg tagcgtacat caccattaag 360

accactctgg cttgcctaac cagtgctgac aatacaaccg ttcaggctgt agcaagcgca 420

atcggtcggg ccattgagga cgaggctcgc ttcggtcgta tccgtgacct tgaagctaag 480

cacttcaaga aaaacgttga ggaacaactc aacaagcgcg tagggcacgt ctacaagaaa 540

gcatttatgc aagttgtcga ggctgacatg ctctctaagg gtctactcgg tggcgaggcg 600

tggtcttcgt ggcataagga agactctatt catgtaggag tacgctgcat cgagatgctc 660

attgagtcaa ccggaatggt tagcttacac cgccaaaatg ctggcgtagt aggtcaagac 720

tctgagacta tcgaactcgc acctgaatac gctgaggcta tcgcaacccg tgcaggtgcg 780

ctggctggca tctctccgat gttccaacct tgcgtagttc ctcctaagcc gtggactggc 840

attactggtg gtggctattg ggctaacggt cgtcgtcctc tggcgctggt gcgtactcac 900

agtaagaaag cactgatgcg ctacgaagac gtttacatgc ctgaggtgta caaagcgatt 960

aacattgcgc aaaacaccgc atggaaaatc aacaagaaag tcctagcggt cgccaacgta 1020

atcaccaagt ggaagcattg tccggtcgag gacatccctg cgattgagcg tgaagaactc 1080

ccgatgaaac cggaagacat cgacatgaat cctgaggctc tcaccgcgtg gaaacgtgct 1140

gccgctgctg tgtaccgcaa ggacaaggct cgcaagtctc gccgtatcag ccttgagttc 1200

atgcttgagc aagccaataa gtttgctaac cataaggcca tctggttccc ttacaacatg 1260

gactggcgcg gtcgtgttta cgctgtgtca atgttcaacc cgcaaggtaa cgatatgacc 1320

aaaggactgc ttacgctggc gaaaggtaaa ccaatcggta aggaaggtta ctactggctg 1380

aaaatccacg gtgcaaactg tgcgggtgtc gataaggttc cgttccctga gcgcatcaag 1440

ttcattgagg aaaaccacga gaacatcatg gcttgcgcta agtctccact ggagaacact 1500

tggtgggctg agcaagattc tccgttctgc ttccttgcgt tctgctttga gtacgctggg 1560

gtacagcacc acggcctgag ctataactgc tcccttccgc tggcgtttga cgggtcttgc 1620

tctggcatcc agcacttctc cgcgatgctc cgagatgagg taggtggtcg cgcggttaac 1680

ttgcttccta gtgaaaccgt tcaggacatc tacgggattg ttgctaagaa agtcaacgag 1740

attctgcagg ctgatgctat caacgggacc gataacgaag tagttaccgt gaccgatgag 1800

aacactggtg aaatctctga gaaagtcaag ctgggcacta aggcactggc tggtcaatgg 1860

ctggcttacg gtgttactcg cagtgtgact aagcgttcag tcatgacgct ggcttacggg 1920

tccaaagagt tcggcttccg tcaacaagtg ctggaagata ccattcagcc agctattgat 1980

tccggcaagg gtctgatgtt cactcagccg aatcaggctg ctggatacat ggctaagctg 2040

atttgggaat ccgtttccgt taccgttgtt gctgctgttg aagcaatgaa ctggcttaag 2100

tctgctgcta agctgctggc tgctgaggtc aaagataaga agactggaga gattcttcgc 2160

aagcgttgcg ctgtgcattg ggtaactcct gatggtttcc ctgtgtggca ggaatacaag 2220

aagcctattc agacgcgctt gaacctgatg ttcctcggtc agttccgctt acagcctacc 2280

attaacacca acaaagatag cgagattgat gcacacaaac aggagtctgg tatcgctcct 2340

aactttgtac acagccaaga cggtagccac cttcgtaaga ctgtagtgtg ggcacacgag 2400

aagtacggaa tcgaatcttt tgcactgatt cacgactcct tcggtaccat tccggctgac 2460

gctgcgaacc tgttcaaagc agtgcgcgaa actatggttg acacatatga gtcttgtgat 2520

gtactggctg atttctacga ccagttcgct gaccagttgc acgagtctca attggacaaa 2580

atgccagcac ttccggctaa aggtaacttg aacctccgtg acatcttaga gtcggacttc 2640

gcgttcgcgt aa 2652

<210> 2

<211> 320

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaaccaattg tccatattgc atcagacatt gccgtcactg cgtcttttac tggctcttct 60

cgctaaccaa accggtaacc ccgcttatta aaagcattct gtaacaaagc gggaccaaag 120

ccatgacaaa aacgcgtaac aaaagtgtct ataatcacgg cagaaaagtc cacattgatt 180

atttgcacgg cgtcacactt tgctatgcca tagcattttt atccataaga ttagcggatc 240

ctacctgacg ctttttatcg caactctcta ctgtttctcc ataagtattc aaatgatcta 300

aagaggagaa aggatctccc 320

<210> 3

<211> 879

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggctgaag cgcaaaatga tcccctgctg ccgggatact cgtttaatgc ccatctggtg 60

gcgggtttaa cgccgattga ggccaacggt tatctcgatt tttttatcga ccgaccgctg 120

ggaatgaaag gttatattct caatctcacc attcgcggtc agggggtggt gaaaaatcag 180

ggacgagaat ttgtttgccg accgggtgat attttgctgt tcccgccagg agagattcat 240

cactacggtc gtcatccgga ggctcgcgaa tggtatcacc agtgggttta ctttcgtccg 300

cgcgcctact ggcatgaatg gcttaactgg ccgtcaatat ttgccaatac ggggttcttt 360

cgcccggatg aagcgcacca gccgcatttc agcgacctgt ttgggcaaat cattaacgcc 420

gggcaagggg aagggcgcta ttcggagctg ctggcgataa atctgcttga gcaattgtta 480

ctgcggcgca tggaagcgat taacgagtcg ctccatccac cgatggataa tcgggtacgc 540

gaggcttgtc agtacatcag cgatcacctg gcagacagca attttgatat cgccagcgtc 600

gcacagcatg tttgcttgtc gccgtcgcgt ctgtcacatc ttttccgcca gcagttaggg 660

attagcgtct taagctggcg cgaggaccaa cgtatcagcc aggcgaagct gcttttgagc 720

accacccgga tgcctatcgc caccgtcggt cgcaatgttg gttttgacga tcaactctat 780

ttctcgcggg tatttaaaaa atgcaccggg gccagcccga gcgagttccg tgccggttgt 840

gaagaaaaag tgaatgatgt agccgtcaag ttgtcataa 879

<210> 4

<211> 810

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttaagaccca ctttcacatt taagttgttt ttctaatccg catatgatca attcaaggcc 60

gaataagaag gctggctctg caccttggtg atcaaataat tcgatagctt gtcgtaataa 120

tggcggcata ctatcagtag taggtgtttc cctttcttct ttagcgactt gatgctcttg 180

atcttccaat acgcaaccta aagtaaaatg ccccacagcg ctgagtgcat ataatgcatt 240

ctctagtgaa aaaccttgtt ggcataaaaa ggctaattga ttttcgagag tttcatactg 300

tttttctgta ggccgtgtac ctaaatgtac ttttgctcca tcgcgatgac ttagtaaagc 360

acatctaaaa cttttagcgt tattacgtaa aaaatcttgc cagctttccc cttctaaagg 420

gcaaaagtga gtatggtgcc tatctaacat ctcaatggct aaggcgtcga gcaaagcccg 480

cttatttttt acatgccaat acaatgtagg ctgctctaca cctagcttct gggcgagttt 540

acgggttgtt aaaccttcga ttccgacctc attaagcagc tctaatgcgc tgttaatcac 600

tttactttta tctaatctag acatcattaa ttcctaattt ttgttgacac tctatcgttg 660

atagagttat tttaccactc cctatcagtg atagagaaaa gtattcaaat gatcttccct 720

atcagtgata gagaaaagta ttcaaatgat cttccctatc agtgatagag aaaagtattc 780

aaatgatcta aagaggagaa aggatctccc 810

<210> 5

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg cgcggcgagg gcgagggcga tgccaccaac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcagc 300

ttcaaggacg acggcaccta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaacttcaa cagccacaac gtctatatca ccgccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg ccgaatttga aattcgtcat aatgtggaag atggcagcgt gcagctggcg 540

gatcattatc agcagaatac cccgattggc gatggcccag tgctgctgcc ggatgaccac 600

tatctgagca ccgaaagcgt gctgagcaaa gatccgaatg aagatcgtga tcatatggtc 660

ctgctggaat ttgtgaccgc ggcaggcatt gatctgggca tggatgaact gtataaattg 720

gaggttttgt tccagggtcc atctaaaatg tcagatgtaa agtgcacatc agtagtctta 780

ctctcagttt tgcaacaact cagagtagaa tcatcatcta aattgtgggc tcaatgtgtc 840

cagttacaca atgacattct cttagctaaa gatactactg aagcctttga aaaaatggtt 900

tcactacttt ctgttttgct ttccatgcag ggtgctgtag acataaacaa gctttgtgaa 960

gaaatgctgg acaacagggc aaccttacaa taa 993

<210> 6

<211> 874

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acggtgagct ggtgacctgc cttatctctt tccccagtag ctaaaaatag ggtggctttg 60

cccgtgtata taaccaacag ctttctcatg gtttttccga ggcaggattc aacgaatttc 120

cccactagga agaactaaga aagggaatcg tgaaaatatc cctaaaatag ggaagtcgat 180

tttcagaatc tgtgaagggg tctatcaata ttgattaaac cgtctatcaa aaaaaggggt 240

aaaattgata gaccttgcct cattcgatga ataggtataa tcaaaaaatg tggttttttt 300

gattaaaggt ttatcaaata tggcgacaaa attgagaaag cagccaatca gatatgacga 360

gaatcctttc atcgaaggta tggttgtgcc agttaaaagt cagagggttc agttatctcg 420

attaggacga gatgataaca ttctggtcaa tcaagccact ggtgagatgc aaggcactca 480

tgtgacgact tacagacgtg ttgatagtga agaatttgta aaattattta gcaccaatat 540

cgcgctaact tttgaactag gagccgctgg aataaaagct ttcagcgttc tggtttggat 600

acttcaagac aaaggcatca gcaaagacct cgtcccttta gacaaattcg ttttagagga 660

ctttcttaac gcacaagaaa aaaaactggc actatctcaa gctacctttg caagaggtct 720

agccgaatta gaaaaagcta aaatcattgc aaagcatgtt cgccaaggat ggtattttat 780

taatcctaat ttcgttttca atggcgaccg cgtagctttc acaacagtta tagaacgcaa 840

aaagacgctc caaaagcaag acgaatcaga ataa 874