一种禽偏肺病毒抗体双抗原夹心法ELISA检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于禽偏肺病毒检测技术领域。更具体地，涉及一种禽偏肺病毒抗体 双抗原夹心法ELISA检测试剂盒及其应用。

背景技术

禽偏肺病毒(Avian metapneumovirus,AMPV)，也被称作为火鸡鼻气管炎病 毒(Turkey rhinotracheitis virus,TRTV)，早期称作禽肺病毒(Avian pneumovirus, APV)，后因从人体中分离到相似的病毒，被重新分类为禽偏肺病毒。AMPV 属副粘病毒科、肺病毒亚科、偏肺病毒属，该病毒是有囊膜，不分节段的单股负 链RNA病毒，根据糖蛋白G蛋白的不同分为A、B、C和D四个亚型。在复染 电镜下，AMPV呈直径50～200nm的高度多形性颗粒，通常是球形，也会出现 长度大于1000nm的纤丝，核衣壳呈螺旋状，病毒粒子表面会有13～14nm的纤 突。

该病毒感染后，除引起家禽呼吸道症状外，还可导致种鸭的产蛋下降。因此， 迫切需要提供检测家禽AMPV的感染的方法，如中国专利申请公开了一种禽偏 肺病毒抗体间接ELISA检测试剂盒，该方法能在一定情况下检测家禽AMPV的 感染，但其只能检测单一禽类的血清，不能对采集的全血进行检测，也不能适用 于多种禽类和多种亚型。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有禽偏肺病毒检测试剂盒不能对采集的 禽类全血进行检测，也不能适用于多种禽类的缺陷和不足，提供一种能检测禽类 全血且能同时适用于多种禽类和亚型的禽偏肺病毒抗体双抗原夹心法ELISA检 测试剂盒。

本发明的目的是提供一种试剂盒在检测禽类禽偏肺病毒中的应用。

本发明的上述目通过以下技术方案实现：

一种禽偏肺病毒抗体双抗原夹心法ELISA检测试剂盒，包括包被AMPV/C-N 蛋白的ELISA反应板、辣根过氧化物酶标记的HRP-AMPV/C-N酶标记物；所述AMPV/C-N蛋白由SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列编码或者具有SEQ ID No.2所 示氨基酸序列；其中，包被AMPV/C-N蛋白的ELISA反应板的制备方法包括：

将AMPV/C-N蛋白用包被液稀释后加入到ELISA反应板的孔中，0～10℃包 被5～25小时，洗涤，加入封闭液，室温封闭1～3小时即得。

ELISA反应板上的每个孔均包被有相同量的抗原(AMPV/C-N蛋白)，加 入稀释好的待测样品(血清或全血)，样品中的N蛋白抗体能够通过抗原抗体 反应给合到固相上(包被有AMPV/C-N蛋白的ELISA反应板上)，再加入酶标 记物(HRP-AMPV/C-N蛋白)，当样品中的禽偏肺病毒抗体浓度高时，结合到 固相上的抗体就越多，结合的酶标记物就越多，用洗液洗涤后加入显色液，显色 反应的颜色就越深，使用酶标仪检测出的吸光度就越高，表明待测样品中的禽偏 肺病毒抗体浓度越高。当检测得到的数据为有效且计算得到的S/P值高于临界值 时，就判定为阳性；反之，则为阴性。

优选地，所述AMPV/C-N蛋白的终浓度为0.6～1.4μg/mL。

更优选地，所述AMPV/C-N蛋白的终浓度为0.6～1.0μg/mL。

优选地，所述HRP-AMPV/C-N酶标记物的终浓度为0.6～1.0μg/mL。

优选地，所述试剂盒还包括标准阳性对照样品、标准阴性对照样品、辣根过 氧化物酶标记AMPV/C-N蛋白的酶标记物、包被液、封闭液、样品稀释液、显 色液、终止液。

优选地，所述包被液包括碳酸盐缓冲液(CBS)、磷酸缓冲液(PB)、0.08～0.12M 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(Tris-HCl)。

更优选地，所述碳酸盐缓冲液的浓度为0.04～0.06M。

优选地，所述碳酸盐缓冲液的pH为8～10。

优选地，所述PB的浓度为0.05～0.2M。

优选地，所述封闭液包括5～20％蔗糖溶液、2～8％BSA(乙酰胺)和2～8％ 鱼明胶的混合溶液。

更优选地，所述5～20％蔗糖溶液、2～8％BSA(乙酰胺)和2～8％鱼明胶混 合溶液的比例为1:(0.5～1):(0.5～1)。

优选地，所述AMPV/C-N蛋白、包被液、封闭液添加量的比例为： (60～100)ng:(50～150ul):(100～200μL)。

优选地，所述标准阳性对照为SPF鸭免疫AMPV疫苗后的血清，标准阴性 对照为未免疫疫苗的SPF鸭血清。

优选地，所述样品稀释液为pH 7.4的PBS溶液。

更优选地，所述PBS溶液的浓度为0.005～0.02M。

优选地，所述终止液为H

更优选地，所述H

优选地，所述试剂盒的使用方法为：

取待检样品(血清或全血)于包被AMPV/C-N蛋白的ELISA反应板的孔内， 在不同反应孔中分别加入标准阳性对照样品和标准阴性对照样品30～40℃反应 25～35min后，使用洗液洗板并拍干，再每孔加入酶标记物30～40℃反应25～35min 后，使用洗液洗板并拍干，加入显色底物液A和显色底物液B的混合溶液(体 积比为1:1)30～40℃反应8～12min后，加入终止液，于酶标仪使用450nm波长 读数，读取A

优选地，所述显色情况判定结果的判断方法为：

标准阳性对照对照样品A

标准阴性对照对照样品A

试剂空白A

若实验结果符合上述条件则结果有效，按照如下公式计算S/P值

若样品S/P值大于阳性临界值但小于0.5，则判定为弱阳性；

若样品S/P值大于0.5但小于1.0，则判定为中阳性；

若样品S/P值大于1.0，则判定为强阳性；

若样品S/P值小于阴性临界值，则判定为阴性；

若样品S/P值大于阴性临界值，但小于阳性临界值，则判定为可疑，需要重 新试验；

鸭的阳性临界值为0.286，阴性临界值为0.230；

鸡的阳性临界值为0.301，阴性临界值为0.237；

火鸡的阳性临界值为0.273，阴性临界值为0.224。

本发明进一步保护上述试剂盒在检测禽类禽偏肺病毒中的应用。

优选地，所述禽类包括火鸡、鸡、鸭。

本发明具有以下有益效果：

本发明的试剂盒能准确灵敏地检测禽类全血或血清中的禽偏肺病毒中和抗 体，从而对样品进行定性判断。该试剂盒具有灵敏度高，敏感性好、能同时检测 多种禽类和亚型的优点，同时样品处理简单快速、耗时短、成本低。本发明对大 批量禽偏肺病毒样品现场检测提供了良好的解决方法，为禽偏肺病毒的防控提供 重要手段。

附图说明

图1为AMPV/C-N蛋白的电泳图。

图2为AMPV/C-N蛋白浓度对P/N值的影响。

图3为不同包被温度与时间对P/N值的影响。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本 发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技 术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本发明以下实施例中的AMPV/C-N蛋白由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列 编码或者具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列。

SEQ ID No.1:

ATGAGCCTGCAGGGAATCCAGCTGAGCGATCTGAGCTACAAGCACGCT ATCCTGAAGGAGAGCCAGTACACAATCAAGAGGGATGTGGGAACAACAAC CGCTGTGACACCTAGCAGCCTGCAGAGGGAAGTGTCTCTGCTGTGCGGAG AGATTCTGTATGCTAAACACACAGATTACAGCCATGCAGCTGAAGTGGGAA TGCAGTATGTGAGCACTACACTGGGCGCTGAGAGAACACAGCAGATTCTG AAGAACTCTGGATCTGAGGTGCAGGCTGTGCTGACAAAGACCTACAGCCT GGGAAAGGGAAAAAATAGCAAAGGCGAGGAACTGCAGATGCTGGATATCC ACGGCGTGGAAAGATCATGGATTGAGGAGGTGGATAAAGAAGCTAGAAAA ACAATGGCCTCTGCAACCAAGGATAACAGCGGACCAATTCCACAGAACCA GAGGCCTAGCAGCCCTGATGCACCAATCATCCTGCTGTGCATTGGGGCCCT GATCTTCACAAAGCTGGCTAGCACCATCGAAGTGGGACTGGAAACAGCTG TGAGAAGAGCTAATAGAGTGCTGTCCGATGCTCTGAAAAGATTTCCTAGGA TTGATATCCCTAAGATCGCTAGGAGCTTTTACGATCTGTTTGAACAGAAAGT GTATTATAGAAGCCTGTTCATCGAATATGGAAAGGCACTGGGAAGCAGCTC TACTGGCTCTAAGGCTGAGTCACTGTTTGTGAATATTTTTATGCAGGCCTAC GGCGCCGGACAGACAATGCTGAGGTGGGGAGTGATCGCTAGATCTTCCAA CAACATTATGCTGGGACACGTGAGCGTGCAGGCTGAGCTGAAACAGGTGA CTGAAGTGTATGATCTGGTGAGAGAGATGGGCCCTGAAAGCGGACTGCTG CACCTGAGACAGAGCCCAAAAGCCGGACTGCTGAGCCTGGCTAATTGCCC TAACTTCGCTAGCGTGGTGCTGGGAAATGCTAGCGGCCTGGGCATCCTGGG AATGTACAGAGGAAGAGTGCCAAACACAGAACTGTTTGCCGCTGCAGAAT CTTACGCTAGATCTCTGAAAGAGAGCAATAAGATTAATTTTAGCAGCCTGG GCCTGACAGAGGAAGAGAAAGAGGCAGCAGAGAATTTCCTGAACATTAAC GAGGAAGGACAGAATGATTACGAG

SEQ ID No.2：

MSLQGIQLSDLSYKHAILKESQYTIKRDVGTTTAVTPSSLQREVSLLCGEIL YAKHTDYSHAAEVGMQYVSTTLGAERTQQILKNSGSEVQAVLTKTYSLGKGK NSKGEELQMLDIHGVERSWIEEVDKEARKTMASATKDNSGPIPQNQRPSSPDA PIILLCIGALIFTKLASTIEVGLETAVRRANRVLSDALKRFPRIDIPKIARSFYDLF EQKVYYRSLFIEYGKALGSSSTGSKAESLFVNIFMQAYGAGQTMLRWGVIAR SSNNIMLGHVSVQAELKQVTEVYDLVREMGPESGLLHLRQSPKAGLLSLANC PNFASVVLGNASGLGILGMYRGRVPNTELFAAAESYARSLKESNKINFSSLGLT EEEKEAAENFLNINEEGQNDYE

实施例1APMV/C-N蛋白的制备和纯化

试剂的配制：

Buffer A：1M Tris-HCl(pH 8.0)50mL，5M NaCl 100mL，甘油100mL， 加水定容至1L，121℃灭菌20min，在4℃的冰箱中保存。

Buffer B：咪唑16.02g，1M Tris-HCl(pH 8.0)50mL，5M NaCl 100mL， 甘油100mL，加水定容至1L，121℃灭菌20min，在4℃的冰箱中保存。

Buffer C：咪唑25.6g，1M Tris-HCl(pH 8.0)50mL，5M NaCl 100mL， 甘油100mL，加水定容至1L，121℃灭菌20min，在4℃的冰箱中保存。

Buffer D：咪唑32.04g，1M Tris-HCl(pH 8.0)50mL，5M NaCl 100mL， 甘油100mL，加水定容至1L，121℃灭菌20min，在4℃的冰箱中保存。

AMPV/C-N蛋白的制备过程：

(1)将由华大基因公司构建的pET-32a-AMPV/C-N原核表达载体质粒导入 DH5α感受态大肠杆菌(DE3)中扩增。再将质粒使用质粒抽提试剂盒提出，导 入到表达工程菌Rosetta和BL21中进行表达；将构建的重组质粒转化Rosetta感 受态细胞，涂布在固体LB培养基(含100μg/L氨苄青霉素)琼脂平板上37℃ 培养过夜；挑取单菌落接种到液体LB培养基中(含100μg/L氨苄青霉素)，于 37℃、200rpm培养至吸光度(OD)值为0.6～0.8时，加入诱导剂异丙基-β-D- 硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mmol/L，28℃、200rpm培养6小时。

(2)将步骤(1)中培养后的菌液于4℃、5000rpm离心5min，倒去上清； 加入pH 7.4的PBS溶液重悬菌体后于4℃、5000rpm离心5min，重复2次后用 Buffer A重悬。

(3)将步骤(2)中重悬好的菌体置于冰上超声破碎30min，破碎后于4℃、 12000rpm离心，分离上清，沉淀。将诱导前和诱导后的上清、沉淀和未破碎的 菌体用SDS-PAGE电泳确定产物是否表达，如图1所示，蛋白大小为57kDa(千 道尔顿)；与蛋白质分子量标准(ProteinMarker，用M表示)相比，转化BL21 未诱导的全菌(1)和转化Rosetta未诱导的全菌(4)未在57kDa处大量表达； 转化BL21诱导后破碎离心的上清(2)和破碎离心的沉淀(3)在57kDa处表达 量很小；转化Rosetta诱导后破碎离心的上清(5)和破碎离心沉淀(6)表达量大，说明使用Rosetta(DE3)作为工程菌可使AMPV/C-N蛋白大量表达，且为 可溶性表达。

AMPV/C-N蛋白的纯化过程(镍柱纯化法)：

(1)预装柱的平衡：用10倍柱体积(50mL)预冷的Buffer A反复洗涤柱 体积为5mL的Ni NTA Beads 6FF层析柱，除去酒精。

(2)挂柱：在4℃环境中将破碎得到的上清流穿Ni NTA Beads 6FF层析柱， 使带有6×his标签的目的蛋白结合在层析柱上。

(3)除杂：使用10倍柱体积Buffer B洗涤Ni NTA Beads 6FF层析柱，除 去非特异结合的蛋白，并收集步骤(2)流穿后的流穿液。

(4)洗脱：加入5倍柱体积预冷的Buffer C进行洗脱，收集洗脱液(即为 所纯化蛋白)。

(5)用10倍体积预冷的Buffer D反复洗涤Ni NTA Beads 6FF柱后，用5 倍体积预冷的20％乙醇洗涤，最后用2倍体积的20％乙醇保存预装柱于2～8℃。

(6)测定APMV/C-N蛋白的浓度：测定纯化蛋白在波长260nm和280nm 时的吸光值，按公式计算蛋白浓度，分装，500μL/管，-80℃保存，得到的 AMPV/C-N蛋白浓度为2.75mg/mL。

蛋白浓度(mg/mL)＝(1.45×A

(7)测定APMV/C-N蛋白的纯度：将超声后的上清、纯化蛋白进行 SDS-PAGE电泳，检测纯化蛋白的纯度，得到的AMPV/C-N蛋白纯度为99％。

实施例2HRP-AMPV/C-N辣根过氧化物酶标记

取10mg/mL辣根过氧化物酶(HRP)溶液2mL，加0.06M NaIO

实施例3禽偏肺病毒抗体双抗原夹心法ELISA检测试剂盒的建立

ELISA反应板的制备：

1.在ELISA反应板上包被AMPV/C-N蛋白，具体方法为：

使用pH 9.6的0.05M CBS，将AMPV/C-N蛋白稀释到0.6875mg/mL，每反 应孔加入100μL，于4℃包被18h，洗板2次后每反应孔加入120μL封闭液(10％ 蔗糖溶液、5％BSA和5％鱼明胶的混合溶液，1:1:1)，37℃封闭2小时，然后 甩去封闭液于37℃烘箱烘干反应板，即得到包被好的ELISA反应板。

酶标记物制备

1.将实施例2中所得HRP-AMPV/C-N使用10％蔗糖溶液稀释至0.25mg/L， 再加入0.01％皇家蓝(Royal blue，每升加入0.1mL色素)，即得到酶标记物。

三、检测试剂盒

禽偏肺病毒抗体双抗原夹心法ELISA检测试剂盒包括：

上述制备的包被AMPV/C-N蛋白的ELISA反应板、酶标记物，以及0.01M PBS(样品稀释液)、标准阳性对照(SPF鸭免疫AMPV疫苗后的血清)、标准 阴性对照(未免疫疫苗的SPF鸭血清)、0.5％PBST(洗液)、3M H

实施例4禽偏肺病毒抗体双抗原夹心法检测试剂盒的使用

S1、样品前处理

将所采禽类血清置于1.5mL离心管中室温放置过夜，室温5000rpm离心5 min，取上层清澈的血清20μL加入到140μL样品稀释液(0.01M PBS)中，震 荡混匀得待测样品；

S2.样品的检测

(1)使用前将试剂盒内各组分恢复至室温；

(2)取出检测试剂盒中包被AMPV/C-N蛋白的ELISA反应板；

(3)用移液枪吸取100μL步骤S1所得待测样品于包被AMPV/C-N蛋白的 ELISA反应板的反应孔中；

(4)将试剂盒内标准阳性对照(SPF鸭免疫AMPV疫苗后的血清)与标准 阴性对照(未免疫疫苗的SPF鸭血清)各取100μL分别加入反应孔中。

(5)37℃反应30min，用洗液(0.5％PBST)洗板4次后拍干，每孔加入 100μL酶标记物。

(6)37℃反应30min，用洗液(0.5％PBST)洗板4次后拍干，将显色底 物液A和显色底物液B等量混合均匀，每孔加入100μL混合均匀的底物液。

(7)37℃反应10min，每孔加入50μL终止液(3M H

S3.判定结果

按如下公式计算S/P值，待检样品A450nm值(S)，阳性对照A450nm值 (P)，阳性对照A450nm值(N)。

S/P＝(S-N)÷(P-N)

(1)阴性(－)：当0.230＞S/P，判为阴性；

(2)阳性(+)：当S/P＞0.286，判为阳性；

(3)无效(可疑)：当0.286＞S/P＞0.230，表示实验结果可疑，重新检测。

实施例5AMPV/C-N蛋白包被的最适浓度确定

实验方法：

用0.05M CBS将AMPV/C-N蛋白按1:1000(2.75μg/mL)1:2000(1.375 μg/mL)、1:3000(0.9167μg/mL)、1:4000(0.6875μg/mL)稀释，每孔100μL 加入到96孔包被AMPV/C-N蛋白的ELISA反应板中，置于4℃包被12h；使用 洗液(0.5％PBST)300μL每孔洗板2次，拍干后每孔加入120μL封闭液(10％ 蔗糖溶液)，置于37℃水浴锅封闭2h；甩去孔内封闭液，倒置于37℃烘箱烘干 过夜。使用稀释液(0.01M PBS)标准阳性对照(SPF鸭免疫AMPV疫苗后的 血清)与标准阴性对照(未免疫疫苗的SPF鸭血清)分别按照1:4、1:8、1:16、 1:32、1:64、1:128、1:256的梯度比例稀释。每个血清稀释度对应4个抗原包被 浓度，设3个平行对照，按上述实施例4的步骤进行试验。比较阴阳性对照的 A450nm值(S/P值)。

结果如图2所示：当的AMPV/C-N蛋白浓度为0.6875μg/mL(稀释比例为 1:4000)，S/P值最高。选择阳性对照A450nm值(P)和阴性对照A450nm值(N) 的比值(P/N)最大的抗原包被浓度和血清稀释倍数作为最佳抗原包被浓度及最 佳血清稀释倍数。

实施例6AMPV/C-N蛋白包被的最适条件确定

最佳包被液的确认：分别用0.05M CBS、0.05MPB、0.1MPB、0.2MPB、 0.01M Tris-HCl、0.1M Tris-HCl稀释包被AMPV/C-N蛋白的ELISA反应板进行 ELISA试验，结果如表1所示。当使用0.05M CBS作为包被液时，P/N值达到 最大，因此确定最佳包被液为0.05M CBS。

表1双抗原夹心法ELISA不同包被液的P/N值

最佳包被温度与时间的确认：以包被温度和时间棋盘法进行ELISA试验， 按上述方法进行测试。结果如图3所示，当温度为4℃时，P/N值最高，当时间 增加到18小时，与6小时差不多，综合考虑，确定最佳包被温度为4℃，最佳 包被时间为6h。

实施例7阴阳性临界值的确定

(1)鸭血：按照最佳条件检测60份SPF鸭血清后，计算得出平均值X为 0.118，标准差SD为0.056，阳性临界值X+3SD为0.286，阴性临界值为0.230。

(2)鸡血：按照最佳条件检测60份SPF鸡血清后，计算得出平均值X为 0.109，标准差SD为0.064，阳性临界值X+3SD为0.301，阴性临界值为0.237。

(3)火鸡血：按照最佳条件检测60份SPF火鸡血清后，计算得出平均值X 为0.126，标准差SD为0.049，阳性临界值X+3SD为0.273，阴性临界值为0.224。

实施例8重复性试验

(1)批内重复性：随机抽取同批次包被AMPV/C-N蛋白的ELISA反应板 12块中各一条进行同一批内板间重复性试验，随机抽取4块同批次包被 AMPV/C-N蛋白的ELISA反应板进行批内板内重复性试验，计算阴阳性样品 A450nm值的CV(变异系数)值。

(2)批间重复性：随机抽取2个不同批次包被AMPV/C-N蛋白的ELISA 反应板各6块内的随机一条进行不同批次间重复性试验，计算阴阳性样品 A450nm值的CV(变异系数)值。

实验结果批内板间CV值为2.54％～7.76％，批内板内CV值为1.91％～7.29％， 批间CV值为3.87％～8.63％，都小于10％，重复性良好。

实施例9稳定性试验

对在37℃烘箱内放置0天、3天、6天、9天的试剂盒中的各组分按最佳方 法进行ELISA试验。标准阳性对照在37℃放置3天的下降率为10.91％，包被 AMPV/C-N蛋白的ELISA反应板在37℃放置3天后的下降率为5.85％，酶标记 物在37℃放置3天后的下降率为12.22％，说明试剂盒各组分在4℃保存半年依 然可以保持正常性能。

实施例10全血和血清对比试验

将采集的30份鸭全血样品分为两管，其中一管不分离血清，另一管分离血 清，将全血和血清按照实施例4的操作步骤进行试验。试验结果显示，血清和全 血的结果符合率为96.67％。

实施例11多种禽类试验

分别对各100份火鸡、鸡和鸭的AMPV阳性血清和SPF级血清按实施例4 的操作步骤进行试验。结果显示，火鸡的阳性符合率为98％、鸡的阳性符合率为 99％、鸭的阳性符合率为99％，说明本方法对3种AMPV易感禽类的判定准确 度良好，具有多种禽类通用的作用。

实施例12多种亚型试验

分别对收集的A、B、C亚型AMPV阳性血清各100份，按实施例4的操作 步骤进行试验。结果显示，A亚型的符合率为96％、B亚型的符合率为97％、C 亚型的符合率为99％，具有多种亚型通用的作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种禽偏肺病毒抗体双抗原夹心法ELISA检测试剂盒及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1182

<212> DNA

<213> AMPV/C-N蛋白的核苷酸序列(SIPOSequenceListing 1.0)

<400> 1

atgagcctgc agggaatcca gctgagcgat ctgagctaca agcacgctat cctgaaggag 60

agccagtaca caatcaagag ggatgtggga acaacaaccg ctgtgacacc tagcagcctg 120

cagagggaag tgtctctgct gtgcggagag attctgtatg ctaaacacac agattacagc 180

catgcagctg aagtgggaat gcagtatgtg agcactacac tgggcgctga gagaacacag 240

cagattctga agaactctgg atctgaggtg caggctgtgc tgacaaagac ctacagcctg 300

ggaaagggaa aaaatagcaa aggcgaggaa ctgcagatgc tggatatcca cggcgtggaa 360

agatcatgga ttgaggaggt ggataaagaa gctagaaaaa caatggcctc tgcaaccaag 420

gataacagcg gaccaattcc acagaaccag aggcctagca gccctgatgc accaatcatc 480

ctgctgtgca ttggggccct gatcttcaca aagctggcta gcaccatcga agtgggactg 540

gaaacagctg tgagaagagc taatagagtg ctgtccgatg ctctgaaaag atttcctagg 600

attgatatcc ctaagatcgc taggagcttt tacgatctgt ttgaacagaa agtgtattat 660

agaagcctgt tcatcgaata tggaaaggca ctgggaagca gctctactgg ctctaaggct 720

gagtcactgt ttgtgaatat ttttatgcag gcctacggcg ccggacagac aatgctgagg 780

tggggagtga tcgctagatc ttccaacaac attatgctgg gacacgtgag cgtgcaggct 840

gagctgaaac aggtgactga agtgtatgat ctggtgagag agatgggccc tgaaagcgga 900

ctgctgcacc tgagacagag cccaaaagcc ggactgctga gcctggctaa ttgccctaac 960

ttcgctagcg tggtgctggg aaatgctagc ggcctgggca tcctgggaat gtacagagga 1020

agagtgccaa acacagaact gtttgccgct gcagaatctt acgctagatc tctgaaagag 1080

agcaataaga ttaattttag cagcctgggc ctgacagagg aagagaaaga ggcagcagag 1140

aatttcctga acattaacga ggaaggacag aatgattacg ag 1182

<210> 2

<211> 394

<212> PRT

<213> AMPV/C-N蛋白氨基酸序列(SIPOSequenceListing 1.0)

<400> 2

Met Ser Leu Gln Gly Ile Gln Leu Ser Asp Leu Ser Tyr Lys His Ala

1 5 10 15

Ile Leu Lys Glu Ser Gln Tyr Thr Ile Lys Arg Asp Val Gly Thr Thr

20 25 30

Thr Ala Val Thr Pro Ser Ser Leu Gln Arg Glu Val Ser Leu Leu Cys

35 40 45

Gly Glu Ile Leu Tyr Ala Lys His Thr Asp Tyr Ser His Ala Ala Glu

50 55 60

Val Gly Met Gln Tyr Val Ser Thr Thr Leu Gly Ala Glu Arg Thr Gln

65 70 75 80

Gln Ile Leu Lys Asn Ser Gly Ser Glu Val Gln Ala Val Leu Thr Lys

85 90 95

Thr Tyr Ser Leu Gly Lys Gly Lys Asn Ser Lys Gly Glu Glu Leu Gln

100 105 110

Met Leu Asp Ile His Gly Val Glu Arg Ser Trp Ile Glu Glu Val Asp

115 120 125

Lys Glu Ala Arg Lys Thr Met Ala Ser Ala Thr Lys Asp Asn Ser Gly

130 135 140

Pro Ile Pro Gln Asn Gln Arg Pro Ser Ser Pro Asp Ala Pro Ile Ile

145 150 155 160

Leu Leu Cys Ile Gly Ala Leu Ile Phe Thr Lys Leu Ala Ser Thr Ile

165 170 175

Glu Val Gly Leu Glu Thr Ala Val Arg Arg Ala Asn Arg Val Leu Ser

180 185 190

Asp Ala Leu Lys Arg Phe Pro Arg Ile Asp Ile Pro Lys Ile Ala Arg

195 200 205

Ser Phe Tyr Asp Leu Phe Glu Gln Lys Val Tyr Tyr Arg Ser Leu Phe

210 215 220

Ile Glu Tyr Gly Lys Ala Leu Gly Ser Ser Ser Thr Gly Ser Lys Ala

225 230 235 240

Glu Ser Leu Phe Val Asn Ile Phe Met Gln Ala Tyr Gly Ala Gly Gln

245 250 255

Thr Met Leu Arg Trp Gly Val Ile Ala Arg Ser Ser Asn Asn Ile Met

260 265 270

Leu Gly His Val Ser Val Gln Ala Glu Leu Lys Gln Val Thr Glu Val

275 280 285

Tyr Asp Leu Val Arg Glu Met Gly Pro Glu Ser Gly Leu Leu His Leu

290 295 300

Arg Gln Ser Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ser Leu Ala Asn Cys Pro Asn

305 310 315 320

Phe Ala Ser Val Val Leu Gly Asn Ala Ser Gly Leu Gly Ile Leu Gly

325 330 335

Met Tyr Arg Gly Arg Val Pro Asn Thr Glu Leu Phe Ala Ala Ala Glu

340 345 350

Ser Tyr Ala Arg Ser Leu Lys Glu Ser Asn Lys Ile Asn Phe Ser Ser

355 360 365

Leu Gly Leu Thr Glu Glu Glu Lys Glu Ala Ala Glu Asn Phe Leu Asn

370 375 380

Ile Asn Glu Glu Gly Gln Asn Asp Tyr Glu

385 390