增强型Au@PtNPs探针制备方法及具有增强型Au@PtNPs探针的纳米酶试纸条

【技术领域】

本发明涉及医疗器械领域，尤其涉及一种增强型Au@PtNPs探针制备方法及具有增强型Au@PtNPs探针的纳米酶试纸条。

【背景技术】

Au@PtNPs探针有多种现有制备方法，纳米酶检测试纸条也采用Au@PtNPs探针做为其构件，但是在应对例如疫情的检测、尤其是早期排查其灵敏度和稳定性依然有待提升。

【发明内容】

本发明的目的在于提供一种增强型Au@PtNPs探针制备方法及具有增强型Au@PtNPs探针的纳米酶试纸条，旨在解决灵敏度和稳定性不足的问题。

本发明是这样实现的：增强型Au@PtNPs探针制备方法，包括如下步骤：

(1)制备Au@PtNPs溶液，将水加到锥形瓶中并记录水体积，加入1％水体积的氯金酸，摇晃混匀，放在电热炉上加热至溶液沸腾，快速加入柠檬酸三钠，保持摇晃使溶液处于轻微沸腾状态，持续加热10-20min，确保还原反应充分进行，然后补加水到原水体积，继续加热胶体金溶液，保持轻微沸腾状态，先加入抗坏血酸，再加入氯铂酸，持续10-20min，确保还原反应充分进行，然后补加水到原水体积，冷却至室温后获得 Au@PtNPs溶液备用；

(2)制备生物素化抗体，将抗体用碳酸氢钠缓冲液稀释到1mg/ml 的抗体溶液，用DMSO溶解NHS修饰的生物素获得生物素溶液，取生物素溶液加入抗体溶液中，在室温下持续搅拌约2～4小时，再加入NH4Cl，在室温下搅拌10分钟，然后在4℃，用PBS充分透析，以除去游离的生物素，获得生物素化抗体；

(3)制备增强型Au@PtNPs探针，上述Au@PtNPs溶液用水稀释后加入碳酸钾调节pH值，然后加入亲和素，混匀后室温静置10分钟以上，加入 PEG 20000至终浓度1mg/mL，再加入BSA至终浓度10mg/mL，封闭Au@PtNPs 上多余的结合位点，室温静置10分钟以上作为待用液，取9000g待用液离心10min，弃掉上清液，再加入1mL的1％BSA进行重悬，重复离心和重悬两次，最后一次使用100μL的1％BSA重悬，最后再加入生物素化抗体，利用亲和素和生物素的结合反应制备获得增强型Au@PtNPs探针，4℃避光保存。

本发明的进一步技术方案是：所述抗坏血酸用量为0.25M抗坏血酸4 mL，，所述氯铂酸用量为1M氯铂酸300μL。

本发明的进一步技术方案是：所述碳酸氢钠缓冲液pH为8.0。

本发明的进一步技术方案是：所述生物素为NHSB。

本发明的进一步技术方案是：所述NH4Cl浓度为1M。

本发明还提供了一种具有增强型Au@PtNPs探针的纳米酶试纸条，包括增强型Au@PtNPs探针。

本发明的进一步技术方案是：所述纳米酶试纸条的制备方法为：首先将样品垫使用缓冲液进行预处理；然后将增强型Au@PtNPs探针加到探针垫上；再然后在NC膜上布置包被捕获抗体检测线和包被抗鼠二抗控制线，两线之间的距离为5mm，再然后将上述组件有序地组装在PVC板上，两个相邻部分之间有大约2mm的重叠，最后将产品切成3mm宽，获得利用增强型Au@PtNPs探针制备的纳米酶试纸条，将其密封后避光保存。

本发明的有益效果是：由于采用上述技术方案，利用创新的制备方法，将亲和素结合到Au@PtNPs探针中，使得其灵敏度和稳定性显著提升，再利用其制备成具有增强型Au@PtNPs探针的纳米酶试纸条，可以加强检测效果，可以对例如新冠疫情的严格排查起到关键作用。

【附图说明】

图1是本发明所述增强型Au@PtNPs探针制备方法及具有增强型 Au@PtNPs探针的纳米酶试纸条的制备步骤图。

【具体实施方式】

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的说明。

如图1，制备Au@PtNPs溶液，取200mL水加到锥形瓶中，加入10％氯金酸200 μL，摇晃混匀，放在电热炉上加热至溶液沸腾，快速加入3mL的1％柠檬酸三钠，保持摇晃使溶液处于轻微沸腾状态，持续加热约15min，确保还原反应充分进行，然后补加水到200mL，继续加热胶体金溶液，保持轻微沸腾状态，先加入抗坏血酸，再加入氯铂酸，持续15min，确保还原反应充分进行，然后补加水到200mL，冷却至室温后获得Au@PtNPs溶液备用。

制备生物素化抗体，将抗体用0.1M碳酸氢钠缓冲液稀释到1mg/ml的抗体溶液，用1mL DMSO溶解1mg的NHS修饰的生物素获得生物素溶液，取120μL生物素溶液加入1mL的抗体溶液中，在室温下持续搅拌约2～4小时，再加入9.6μL的NH

制备增强型Au@PtNPs探针，上述Au@PtNPs溶液用水稀释2.4倍后取1mL，加入0.2M碳酸钾32μL调节pH值，然后加入15μg亲和素，混匀后室温静置30min，加入PEG 20000至终浓度1mg/mL，再加入BSA至终浓度10mg/mL，封闭Au@PtNPs 上多余的结合位点，室温静置30min作为待用液，取9000g待用液离心10min，弃掉上清液，再加入1mL的1％BSA进行重悬，重复离心和重悬两次，最后一次使用100 μL的1％BSA重悬，最后再加入生物素化抗体，利用亲和素和生物素的结合反应制备获得增强型Au@PtNPs探针，4℃避光保存。

纳米酶试纸条的组装：纳米酶试纸条主要由PVC板、样品垫、探针垫、吸收垫和硝酸纤维素膜(NC膜)五大部分组成。样品垫使用缓冲液进行预处理；将Au@Pt NPs探针或增强型Au@Pt NPs探针加到探针垫上；NC膜上划有检测线(包被捕获抗体)和控制线(包被抗鼠二抗)，两线之间的距离为5mm。所有组件被有序地组装在PVC板上，两个相邻部分之间有大约2mm的重叠。最后，将产品切成3mm宽，密封后避光保存。

纳米酶试纸条的检测步骤：将样品稀释后，取100μL加到样品垫上。同时使用标准品设定浓度梯度，用于建立标准曲线。溶液向吸水垫方向移动，当样品中含有检测靶标时，被Au@Pt NPs探针特异性识别，形成免疫复合物，并被T线的捕获抗体识别，在T线聚集。未结合检测靶标的Au@Pt NPs探针被C线的羊抗鼠二抗捕获。侧向层析15min后，将纳米酶底物溶液加到NC膜上，催化反应15min。使用智能手机软件分别采集NC膜上底物条带的信号强度，根据标准曲线计算样品中检测靶标的浓度。

文中出现的专业用词做如下解释：

Au@PtNPs，金核铂壳纳米材料。

PEG 20000，聚乙二醇20000是一种化学物质，分子式是HO(C2H4O)nH。

BSA，是牛血清白蛋白的英文缩写，又称第五组分，是牛血清中的一种白蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430KDa，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有着广泛的应用，例如在蛋白质印迹法中作为阻断剂，在酶切反应缓冲液中加入 bsa，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用，防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻某些酶的变性，减轻某些不利环境因素，如加热、表面张力及化学因素引起的变性。

DMSO，二甲基亚砜，无色液体，重要的极性非质子溶剂。它可与许多有机溶剂及水互溶。

NHS，N-羟基琥珀酰亚胺，不带电荷的N-羟基磺基琥珀酰亚胺类似物，可控制和修饰涉及与伯胺(—NH2)偶联的羧酸盐(—COOH)活化的碳二亚胺交联反应。

nh4cl的化学名称是氯化铵。

PBS，磷酸缓冲盐溶液。

NC膜，硝酸纤维素膜。

PVC，聚氯乙烯。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。