一种预防骨坏死和/或促进血管生成的复合物及其制药用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种预防骨坏死和/或促进血管生成的复合物及其制药用途。

背景技术

骨坏死是指由于各种原因(机械、生物等)使骨循环中断、骨的活性成分死亡及随后修复的一系列复杂病理过程。骨坏死可累及全身许多关节，常见的骨坏死包括股骨头坏死、颌骨坏死、股骨髁坏死、肱骨头坏死等。

双膦酸盐(bisphosphonates，BPs)类药物作为一种抗骨质吸收的药物，主要应用于骨质疏松、佩吉特病(Paget病，又名湿疹样癌)、多发性骨髓瘤的预防和治疗以及肿瘤骨转移的预防。但是，长期使用BPs将引发严重的不良反应——双膦酸盐相关性颌骨坏死(Bisphosphonate related osteonecrosis of the jaw，BRONJ)。自2003年，关于BRONJ的报道逐年增多，发病率为1.6％-14.8％，长期使用唑来膦酸的患者中，BRONJ发病率可高达20％。BRONJ患者可出现持续疼痛、流脓、张口受限、经久不愈的皮瘘甚至病理性骨折等，严重影响患者的生活质量，但目前医学界还缺少有效的应对措施。

目前临床尚无标准化治疗BRONJ的方案，原则上采用去除死骨及抗炎等对症治疗方法，但是预后较差。对于早期的患者，临床上主要以健康教育、使用抗生素、控制疼痛、使用漱口水等方式控制病情进展。当病情进展至三期时需采用清创，甚至手术切除病变等方式进行治疗，但是效果欠佳，病情容易进展和复发。因此，现阶段临床对于BRONJ多主张以预防为主。为有效预防拔牙术后BRONJ的发生，临床多采用拔牙术后创口早期关闭、高压氧治疗、干细胞疗法、生长因子等操作，但目前临床数据较少，难以达成共识。

DNA四面体框架核酸(tetrahedral framework nucleic acids,tFNA)是一种由4条单链DNA通过变性和复性，进而链间碱基互补配对形成的一种四面体结构，它易于合成，生物相容性高，通常用作某些药物的载体。赵丹等还报道了DNA四面体框架核酸可通过促进血管生成和M2极化来促进与双膦酸盐有关的颌骨坏死的治疗(2020年中华口腔医学会口腔生物医学专业委员会第十次全国口腔生物医学学术年会暨第六次全国口腔杰青优青论坛论文汇编，2020-10-31)。但是，DNA四面体框架核酸在预防双膦酸盐相关性颌骨坏死中的效果有限，还无法满足临床需求。

因此，开发出一种对骨坏死，特别是BRONJ起到更好的预防作用的药物具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种预防骨坏死和/或促进血管生成的复合物及其制药用途。

本发明提供了一种复合物，它是以DNA四面体框架核酸和KLT多肽为原料制备而成的复合物，所述DNA四面体框架核酸和KLT多肽的摩尔比为1:(1～300)。

进一步地，所述DNA四面体框架核酸和KLT多肽的摩尔比为1:100。

进一步地，所述DNA四面体框架核酸由4条单链DNA经碱基互补配对形成，4条单链DNA的序列如SEQ ID NO.1～4所示；

和/或，KLT多肽的序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明还提供了上述复合物的制备方法：将DNA四面体框架核酸和KLT多肽共同孵育，即得。

进一步地，所述共同孵育的温度为4～30℃，时间为0.5～15小时。

进一步地，所述共同孵育的温度为室温，时间为0.5小时。

进一步地，所述DNA四面体框架核酸的制备方法为：将4条单链DNA溶解于缓冲液中，充分混合，加热至95℃保持10分钟，之后降温至4℃维持20分钟，即得。

本发明还提供了一种预防骨坏死和/或促进血管生成的药物，它是以上述复合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的药物。

本发明还提供了上述复合物在制备预防骨坏死和/或促进血管生成的药物中的用途。

进一步地，所述骨坏死为颌骨坏死；

进一步地，所述颌骨坏死为双膦酸盐相关性颌骨坏死。

进一步地，所述药物能够促进内皮细胞的增殖和迁移。

本发明中，室温指25±5℃。

实验结果表明，本发明由tFNA和KLT形成的复合物tFNA-KLT能有效促进内皮细胞的增殖和迁移，促进血管形成，并对双膦酸盐相关性颌骨坏死起到良好的预防作用。值得注意的是，与tFNA或KLT相比，本发明tFNA-KLT促进内皮细胞的增殖和迁移以及促进血管形成的效果显著提高，发挥了协同增效的作用。本发明提供的tFNA-KLT能够用于制备促血管生成的药物以及预防骨坏死的药物，具有十分良好的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：合成复合物tFNA-KLT的示意图。

图2：不同摩尔比的tFNA与KLT共同孵育后所得复合物的PAGE电泳结果。

图3：tFNA-KLT的原子力显微镜检测图(a)、Zeta电位(b)及粒径(c)检测结果。

图4：KLT和tFNA-KLT的入胞测试结果。

图5：CCK8检测不同浓度的tFNA(a)、KLT(b)和tFNA-KLT(c)在24小时和48小时对HUVEC细胞增殖的影响；(d)CCK8测定250nMtFNA，250nM tFNA KLT，25μM KLT在24小时和48小时对HUVEC细胞增殖的影响；与对照组相比有显著性差异(*：24小时；#：48小时)，*(#)p<0.05，**(##)p<0.01，***(###)p<0.001。(e)HUVEC的EdU测定(Hoechst:蓝色；EdU:绿色)及其定量分析(f)，比例尺为75μm。HUVECs的伤口愈合试验(g)和用ImageJ(h)测量迁移面积的半定量分析，比例尺为100μm。数据以平均值±标准差表示。与对照组(*)或tFNA组(#)或KLT组($)相比有显著性差异，*(#或$)p<0.05，**(##或$$)p<0.01，***(###或$$$)p<0.001。

图6：(a)小管形成试验用于评估各纳米颗粒(单链DNA、KLT、tFNA和tFNA-KLT)的血管生成能力，比例尺为75μm。通过ImageJ对所形成血管的主连接(b)、主节段(c)、总节段长度(d)和总分支长度(e)进行半定量分析。(f)出芽试验，比例尺为100μm。芽数(g)和芽面积(h)的半定量分析。(i)鸡胚绒毛尿囊膜实验，比例尺为500μm；(j)血管面积的半定量分析。(k)主动脉环实验，比例尺为200μm；(l)血管面积的半定量分析。数据以平均值±标准差表示。与对照组(*)或tFNA组(#)或KLT组($)相比有显著性差异，*(#或$)p<0.05，**(##或$$)p<0.01，***(###或$$$)p<0.001。

图7：(a)tFNA-KLT在体内促进血管生成的示意图。(b)纳米颗粒(单链DNA 、KLT、tFNA和tFNA-KLT)处理后的基质凝胶栓塞分析照片，比例尺为500μm。(c)可见凝胶和大量血管的HE染色，比例尺为100μm。(d)血液中含有红细胞的血管数量的定量分析。(e)CD31染色，比例尺为100μm。(f)CD31阳性血管数量的定量分析。数据以平均值±标准差表示。与对照组(*)或tFNA组(#)或KLT组($)相比有显著性差异，*(#或$)p<0.05，**(##或$$)p<0.01，***(###或$$$)p<0.001。

图8：(a)tFNA-KLT预防BRONJ的示意图。(b)拔牙5周后拔牙伤口愈合，比例尺为100μm。(c)粘膜愈合率。(d)micro-CT三维重建(正中矢状面)。(e)micro-CT结果(横切面)。(f)不同组的BV/TV统计结果。数据以平均值±标准差表示。与对照组(*)或tFNA组(#)或KLT组($)相比有显著性差异，*(#或$)p<0.05，**(##或$$)p<0.01，***(###或$$$)p<0.001。

图9：对照组、ZA组、ZA+KLT组、ZA+tFNA组、ZA+tFNA-KLT组的H&E染色、Masson染色和免疫组化结果。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

实施例1、tFNA与KLT多肽的复合物(tFNA-KLT)的合成

参照图1所示示意图，合成tFNA与KLT的复合物tFNA-KLT，具体步骤如下：

(1)合成tFNA

将四条DNA单链(S1、S2、S3、S4)溶解于TM缓冲液(10mM Tris-HCl，50Mm MgCl

(2)合成复合物tFNA-KLT

然后按照tFNA：KLT的摩尔比＝1：100的比例将tFN与KLT在室温下共同孵育30min，得到tFNA与KLT多肽的复合物：tFNA-KLT。

四条单链DNA的序列(5’→3’)如下：

S1：

ATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCAGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCTGAA(SEQID NO.1)。

S2：

ACATGCGAGGGTCCAATACCGACGATTACAGCTTGCTACACGATTCAGACTTAGGAATGTTCG(SEQID NO.2)。

S3:

ACTACTATGGCGGGTGATAAAACGTGTAGCAAGCTGTAATCGACGGGAAGAGCATGCCCATCC(SEQID NO.3)。

S4：

ACGGTATTGGACCCTCGCATGACTCAACTGCCTGGTGATACGAGGATGGGCATGCTCTTCCCG(SEQID NO.4)。

KLT多肽的序列(乙酰基→氨基)如下：

KLTWQELYQLKYKGI(SEQ ID NO.5)。

以下通过实验例证明本发明的有益效果。

实验例1、tFNA与KLT的比例筛选实验

1.实验方法

参照实施例1的方法制备tFNA与KLT的复合物，区别仅在于控制步骤(2)中tFNA：KLT的摩尔比分别为1：1，1：10，1：50，1：100，1：150，1：200，1：300。得到不同摩尔比的tFNA：KLT共同孵育后的复合物。

鉴定：使用PAGE电泳检测不同摩尔比的tFNA与KLT共同孵育后所得复合物；使用原子力显微镜检测tFNA-KLT的外形；使用动态光散射检测tFNA-KLT的zeta电位及粒径。

2.实验结果

如图2所示，电泳结果显示，当tFNA：KLT的摩尔比为1：100时，达到了tFNA搭载KLT的最大比例，因此tFNA与KLT共同孵育的最佳摩尔比是1:100。

如图3所示，原子力显微镜显示了tFNA：KLT的摩尔比为1：100时所得tFNA-KLT的形态，动态光散色检测到的该tFNA-KLT的zeta电位为-2mV，粒径为15-30nm，表明tFNA-KLT合成成功且稳定。

实验例2、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对tFNA-KLT的摄取

1.实验方法

将FAM(6-羧基荧光素)修饰的KLT和tFNA-KLT以250nm的浓度混合在细胞培养基中，然后培养6h。为了拍摄图像，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗HUVEC，并用4％多聚甲醛固定。细胞骨架用phalloidin染色，细胞核用DAPI染色。

本实验例采用的tFNA-KLT是实施例1制备的。

2.实验结果

如图4所示，免疫荧光染色结果显示，6h时tFNA-KLT和KLT均可被HUVEC摄取；与KLT相比，tFNA-KLT的摄取效果更佳。

实验例3、tFNA-KLT对HUVEC增殖和迁移的影响

1.实验方法

1)采用细胞计数试剂盒-8(CCK8)试验和5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)试验检测tFNA、KLT和tFNA-KLT对HUVECs增殖的影响。对于CCK8，将HUVEC(1×10

2)细胞迁移是血管生成的重要步骤。因此，本实验例还进行了划痕实验，以检测tFNA、tFNA-KLT和KLT对HUVEC迁移的影响。HUVEC接种于6孔培养板中。24小时后，使用无菌移液管尖端进行刮除，然后形成双向划痕。接下来，两组分别用250nM tFNA，250nM tFNAKLT(tFNA:KLT＝1:100)，25μM KLT处理。分别在孵育0小时和48小时后拍摄划痕愈合图像。通过图像J测量划痕愈合面积。

本实验例采用的tFNA-KLT是实施例1制备的。以加四条单链DNA(S1、S2、S3、S4)的混合物处理作为对照组(Control组)，其中四条单链DNA的总浓度为250nM。

2.实验结果

CCK8实验结果表明，tFNA、KLT、tFNA-KLT分别在250nM、25μM和250nM的浓度范围内促进HUVEC的增殖，并且在此浓度下，它们表现出最强的促进增殖能力(图5a-5c)。在图5d中，比较了各组在上述最佳增殖浓度下的增殖能力，可以看出，与tFNA组、KLT组相比，tFNA-KLT组对HUVECs增殖的促进作用最强。因此，选择250nM tFNA、25μM KLT、250nM tFNA-KLT进行接下来的EdU实验。EdU分析的结果与CCK8的结果相符(图5e，5f)。

划痕实验结果表明，与tFNA组、KLT组相比，tFNA-KLT组能够显著促进划伤的HUVEC单层的伤口愈合(图5g，5h)。进一步根据表1的计算结果可以看出，tFNA-KLT组迁移面积的提高率优于KLT组和tFNA组之和，说明本发明tFNA-KLT对促进HUVEC增殖和迁移发挥了协同增效的作用。

表1.划痕实验半定量分析结果比较

以上结果表明，tFNA-KLT可以有效促进HUVEC的增殖和迁移。并且，与tFNA、KLT相比，tFNA-KLT促进HUVEC的增殖和迁移的作用显著增强，发挥了协同增效的作用。

实验例4、tFNA-KLT对血管生成的影响

1.实验方法

1)小管形成实验：为了评估tFNA、tFNA-KLT和KLT对体外血管生成能力的影响，进行了试管形成试验。人脐静脉内皮细胞在T25培养基中培养，并在培养基中分别添加250nMtFNA，250nM tFNA KLT(tFNA:KLT＝1:100)，25μΜKLT。24h后，将100μl的人脐静脉内皮细胞(1-1.5×10

2)细胞球出芽实验：制备1.5％琼脂糖，然后添加到96孔板(50μl/孔)中。固化后，用紫外线对平板灭菌30分钟。然后将100μl HUVECs(1000/孔)添加到制备的96孔板中，72小时后将获得球体。然后将球体移入覆盖有Matrigel的96孔板中。培养基中分别含有250nMtFNA，250nM tFNA-KLT(tFNA:KLT＝1:100)，25μΜKLT。48h后观察并拍照。

3)鸡胚尿囊膜实验：受精的无菌鸡蛋在37℃和60％湿度的培养箱中培养7天，然后打开气窗。然后将明胶海绵放在CAM上，分别向明胶海绵中添加100μl 250nM tFNA，250nMtFNA KLT(tFNA:KLT＝1:100)，25μΜKLT，然后关闭气窗。孵育72小时后，取出明胶海绵，用体视显微镜拍摄CAM上的血管。使用ImageJ软件对图片进行分析。

4)动脉环实验：从两周龄C57雌性小鼠分离的主动脉被切割成约1mm长的环。然后将主动脉环置于96孔板中，并用50μl鼠尾胶原凝胶覆盖。培养15分钟后，允许鼠尾胶原凝胶凝固，将分别含有250nM tFNA，250nM tFNA-KLT(tFNA:KLT＝1:100)，25μΜKLT的100μl培养基添加到孔中。孵育72小时后拍摄主动脉环，并使用ImageJ软件测量主动脉环的血管出芽面积。

5)基质胶栓塞实验：为了评估tFNA、tFNA-KLT和KLT对体内血管生成的影响，进行了Matrigel栓塞实验。将小鼠随机分为4组，每组4只。将100μl HUVECs(1×10

本实验例采用的tFNA-KLT是实施例1制备的。以加四条单链DNA(S1、S2、S3、S4)的混合物处理作为对照组(Control组)，其中四条单链DNA的总浓度为250nM。

2.实验结果

表2.鸡胚绒毛尿囊膜实验中血管面积的半定量分析比较

表3.主动脉环实验中血管面积的半定量分析比较

表4.血液中含有红细胞的血管数量的定量分析比较

本实验研究了tFNA-KLT对HUVECs血管生成能力的影响。可以在基质凝胶上观察到管状血管的形成(图6a)。通过ImageJ软件进行定量分析，发现与对照组、KLT组和tFNA组相比，tFNA-KLT组在试管形成实验中显著增加了主连接、主节段、总节段长度和分支长度(图6b-6e)。此外，从细胞球出芽实验结果看出，血管从球体边缘发芽(图6f)。与其他三组相比，在三维细胞球出芽实验中，tFNA-KLT可以显著增加芽的数量和面积(图6g，6h)。小管形成和细胞球出芽实验结果表明，tFNA-KLT在体外具有促进血管生成的能力。

为了进一步证实体外血管生成的能力，本发明进行了离体血管生成试验。CAM结果显示，与对照组相比，KLT、tFNA和tFNA-KLT组的分支血管面积更大，其中，tFNA-KLT组显示出最强的促进血管生成的能力(图6i，6j)。同时，在主动脉环实验中可以看到新生血管生长，其结果显示KLT、tFNA和tFNA-KLT组能够显著促进血管发芽，并且它们的血管面积也比对照组大(图6k，6l)，其中tFNA-KLT组显示出最优越的刺激血管生成的能力。

基质胶栓塞实验表明，许多毛细血管在凝胶中形成(图7b)。从HE染色结果中，可以看到大量含有红细胞的血管(图7c)。通过定量图像分析，结果表明，与对照组、KLT和tFNA相比，tFNA-KLT能明显增加含有红细胞的血管数量(图7d)。同时，通过CD31染色，确认了内皮细胞的存在和新血管的形成(图7e)。定量图像分析结果显示，与对照组相比，KLT、tFNA、tFNA-KLT可显著增加CD31阳性血管的数量(图7f)。KLT组和tFNA组之间无显著差异；与KLT和tFNA相比，tFNA-KLT具有更强的促血管生成能力。

进一步根据表2和表3的计算结果可以看出，tFNA-KLT组的血管面积提高率优于KLT组和tFNA组之和；进一步根据表4的计算结果可以看出，tFNA-KLT组含有红细胞的血管数量提高率优于KLT组和tFNA组之和。说明本发明tFNA-KLT对促进血管生成发挥了协同增效的作用。

上述结果表明，tFNA-KLT在体内外能促进血管生成，并且其促进血管生成显著优于KLT和tFNA，发挥了协同增效的作用。

实验例5、tFNA-KLT预防BRONJ的大鼠实验

1.实验方法

50只Wistar大鼠(雄性，8周龄，体重为180g至200g)。所有大鼠随机分为五组：(i)对照组；(ii)ZA(即唑来膦酸)；(iii)ZA+tFNA；(iv)ZA+KLT；(v)ZA+tFNA-KLT。每只大鼠每周腹腔注射地塞米松(5mg/kg)，持续5周。除对照组外，所有大鼠均接受静脉注射ZA(125μg/kg)5周(每周两次)。第五周末拔除大鼠左侧上颌第一磨牙。ZA+tFNA组拔牙后局部粘膜每天接受100μl tFNA(1mM)，持续一周。同时，ZA+KLT组接受100μl KLT(100mM)。ZA+tFNA-KLT组接受100μl tFNA-KLT(tFNA:KLT＝1:100)(1mM)。对照组和ZA组给予等量生理盐水5周。第五周结束时，对大鼠实施安乐死，取上颌骨继续后续micro-CT、HE染色、Masson染色和CD31染色等检测和分析。图8a是实验的示意图。

本实验例采用的tFNA-KLT是实施例1制备的。

2.实验结果

本领域公知的，拔牙是引起BRONJ最常见的原因。因此，在本实验例中，拔牙用于建立BRONJ模型。拔牙窝愈合定义为肉眼看不到明显的拔牙窝，粘膜完全覆盖，无明显炎症，肉眼看不到裸露的死骨。

本实验结果表明，对照组和ZA+tFNA-KLT组拔牙窝软组织愈合率较高，分别为100％和92％(图8b，8c)。ZA组死骨暴露明显，拔牙伤口未覆盖软组织。ZA+KLT和ZA+tFNA组部分拔牙窝愈合良好，部分拔牙窝愈合不良，少量死骨外露，软组织愈合率分别为56％和70％。

对拔牙窝内的骨再生进行三维重建，并通过micro-CT进行定量分析。如图8d，8e所示，对照组完全修复，拔牙窝填充再生骨。ZA组愈合不良，几乎没有新骨形成。同时，ZA+KLT组和ZA+tFNA组有新骨形成。ZA+tFNA-KLT组拔牙窝几乎完全修复。此外，对micro-CT数据进行统计分析。骨体积/组织体积(BV/TV)是骨组织的体积分数，它可以反映不同样本中小梁骨的数量。对照组、ZA组、ZA+KLT组、ZA+tFNA组和ZA+tFNA-KLT组的BV/TV分别为1.00、0.55、0.73、0.83和0.99，这表明定量结果与重建数据一致。

H&E和Masson三色染色进一步用于新骨形成的组织学分析。结果显示对照组完全修复(图9)。然而，ZA组修复不良。此外，ZA+KLT和ZA+tFNA组实现了拔牙窝的部分愈合。ZA+tFNA-KLT组的疗效最佳，拔牙窝几乎充满了新骨。此外，ZA+tFNA-KLT组松质骨和胶原纤维的排列更为成熟。CD31染色进一步用于检测拔牙窝中的血管，可以看出，ZA+tFNA-KLT组拔牙窝内新形成的骨小梁间可见大量血管。

上述结果表明，tFNA-KLT能够有效降低牙科手术后使用过双膦酸盐的患者的BRONJ发生率，有效预防BRONJ的发生。并且，与tFNA、KLT相比，tFNA-KLT预防BRONJ的作用显著增强。

综上，本发明提供了一种预防骨坏死和/或促进血管生成的复合物tFNA-KLT及其制药用途。该复合物是DNA四面体框架核酸和KLT多肽的复合物。实验结果表明，该复合物能有效促进内皮细胞的增殖和迁移，促进血管形成，并对BRONJ起到良好的预防作用。值得注意的是，与DNA四面体框架核酸或KLT多肽相比，该复合物促进内皮细胞的增殖和迁移以及促进血管形成的效果显著提高，发挥了协同增效的作用。本发明提供的复合物能够用于制备促血管生成的药物以及预防骨坏死的药物，具有十分良好的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学

<120> 一种预防骨坏死和/或促进血管生成的复合物及其制药用途

<130> GYKH1118-2021P0114405CC

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atttatcacc cgccatagta gacgtatcac caggcagttg agacgaacat tcctaagtct 60

gaa 63

<210> 2

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acatgcgagg gtccaatacc gacgattaca gcttgctaca cgattcagac ttaggaatgt 60

tcg 63

<210> 3

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

actactatgg cgggtgataa aacgtgtagc aagctgtaat cgacgggaag agcatgccca 60

tcc 63

<210> 4

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acggtattgg accctcgcat gactcaactg cctggtgata cgaggatggg catgctcttc 60

ccg 63

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Lys Leu Thr Trp Gln Glu Leu Tyr Gln Leu Lys Tyr Lys Gly Ile

1 5 10 15