miR-491、miR-381在牛下丘脑CART转录后表达调控中的应用

技术领域

本发明涉及基因表达调控技术领域，具体为miR-491、miR-381在牛下丘脑CART转录后表达调控中的应用。

背景技术

牛属于单胎动物，在一个发情周期内通常只有一个卵泡发育成熟并释放卵子，其余卵泡均发生闭锁。可卡因-苯丙胺调节转录肽(Cocaine and Amphetamine RegulatedTranscript Peptide,CART)是一种下丘脑分泌的内源性神经肽，通过抑制促卵泡素(Follicle Stimulating Hormone,FSH)诱导的牛卵巢卵泡颗粒细胞(Granulosa Cells,GCs)增殖和雌激素(Estrogen,E2)分泌进而抑制牛卵泡发育，引起卵泡闭锁，降低排卵率，排卵率低极大制约了养牛产业的持续健康发展。微RNA(microRNA,miRNA)是一类长度约为22个核苷酸的内源性非编码RNA，研究表明，miRNA可通过与其靶基因的3′UTR区不完全互补配对抑制后续翻译过程，从而影响该蛋白的生物学功能。

发明内容

本发明的目的在于提供miR-491、miR-381在牛下丘脑CART转录后表达调控中的应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，发明提供如下技术方案：miR-491、miR-381在牛下丘脑CART转录后表达调控中的应用，其特征在于：具体包括miRNAs对CART抑制作用的比较分析和miR-491、miR-381对小鼠CART表达的调控；

所述miRNAs对CART抑制作用的比较分析，具体包括以下步骤：

步骤一：脂质体转染法转染293T细胞；

步骤二：qRT-PCR检测293T细胞基因表达，具体包括：细胞总RNA提取及检测；mRNA反转录；miRNA反转录；引物设计；荧光定量PCR检测；

步骤三：Western blot检测293T细胞CART蛋白表达，具体包括：细胞总蛋白提取；BCA法蛋白浓度测定；聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)配制；上样；电泳；转膜；封闭；一抗、二抗孵育；显影；

所述miR-491、miR-381对小鼠CART表达的调控，具体包括以下步骤：

步骤一：小鼠侧脑室注射；

步骤二：qRT-PCR检测小鼠下丘脑组织基因表达；

步骤三：Western blot检测小鼠下丘脑组织CART蛋白表达；

步骤四：Elisa检测小鼠血清CART浓度。

优选的，所述脂质体转染法转染293T细胞，具体包括：

①设置7个试验组：miR-377+CART组、miR-331-3p+CART组、miR-491+CART组、miR-493+CART组、miR-758+CART组、miR-877+CART组和miR-381+CART组；1个阳性对照组：NC+CART组；8个阴性对照组：miR-377+pEX-3组、miR-331-3p+pEX-3组、miR-491+pEX-3组、miR-493+pEX-3组、miR-758+pEX-3组、miR-877+pEX-3组、miR-381+pEX-3组和NC+pEX-3组；1个转染试剂对照组：TransIntroTM EL组；1个空白细胞组：空白组；上述每组三个重复；

②bta-miRNAs mimics与NC片段合成；

③将4μg质粒DNA/pEX-3与250pmol miRNA/NC加入到200μL DMEM basic(1×)培养基中轻柔混匀，室温放置5min；将12μL TransIntroTM EL加入到200μL DMEM basic(1×)培养基轻柔混匀，室温放置5min；将稀释后的TransIntroTM EL加入到稀释后的质粒DNA与miRNA的混合液中轻柔混匀，室温放置15～20min；

④铺板后培养12～24h，待细胞达到70～80％汇合度时，弃去旧培养液，用适量PBS清洗细胞2次；每孔加入2mL RPMI Medium 1640basic(1×)，再加入各组的转染混合物后置于37℃，5％CO

优选的，所述细胞总RNA提取及检测，具体包括转染24h后，PBS清洗细胞，每孔加入1mL Trizol裂解细胞，反复吹打，使细胞充分裂解，收集于1.5mL离心管；4℃，12,000rpm离心10min，将红色悬液转移到另一离心管，室温下静置5min；每个离心管中加入200μL预冷的氯仿，手摇振荡15s，室温静置3min，4℃，12,000rpm离心15min，此时看到溶液分为三相，RNA在上层无色有机相，吸取上层水相至另一离心管；各管加入500μL预冷的异丙醇，混匀，室温下静置10min，以沉淀RNA，4℃，12,000rpm离心10min后可看到米粒大小的沉淀物，弃上清，各管加入1mL 75％预冷的乙醇洗涤沉淀；4℃，7,500rpm离心5min，弃去酒精，室温干燥沉淀10min，加30μL DEPC水溶解沉淀；取1μL RNA样品经核酸蛋白测定仪检测其纯度及浓度，要求OD

所述mRNA反转录，具体包括gDNA Eraser去除基因组DNA，42℃反应2min(反应体系见图2所示的表2)；TB Green qPCR法进行mRNA反转录，37℃15min，85℃5s，4℃∞；

所述miRNA反转录，具体包括样品基因组DNA去除，离心管配制反应液，37℃反应30min；加入2.5μL 0.5mol/L EDTA，混匀，80℃加热处理2min，DEPC水定容至100μL；加入10μL 3mol/L醋酸钠和250μL冷乙醇，混匀后-80℃放置20min；4℃，12,000rpm离心10min，弃上清；加入70％冷乙醇洗净，4℃，7,500rpm离心5min，弃上清；干燥沉淀后用适量DEPC水溶解沉淀；使用加尾法进行miRNA反转录，37℃15min，85℃5s，4℃∞；加入90μL ddH

所述引物设计，具体包括NCBI网站搜索并下载Bos taurus的CART mRNA+UTR、miR-377、miR-331-3p、miR-491、miR-493、miR-758、miR-877及miR-381的基因序列，并使用Primer 3plus设计引物；

所述荧光定量PCR检测，具体包括荧光定量PCR检测和miRNA荧光定量PCR；

所述荧光定量PCR检测，具体包括mRNA荧光定量PCR反应体系，反应程序为：预变性95℃30s；PCR反应95℃5s，60℃30s，72℃20s，40个循环；溶解曲线阶段95℃15s，60℃60s，95℃15s；

所述miRNA荧光定量PCR，具体包括miRNA荧光定量PCR反应体系，反应程序为：预变性95℃10s；PCR反应95℃5s，60℃20s，40个循环；溶解曲线阶段95℃60s，60℃30s，95℃30s。

优选的，所述细胞总蛋白提取，具体包括每250μL RIPA加入2.5μL PMSF，混匀备用；转染后48h，PBS清洗细胞，每孔加入250μL裂解液，吹打数次，使细胞充分裂解；裂解后的样品14,000rpm离心5min，取上清；

所述BCA法蛋白浓度测定，具体包括使用1×PBS将BSA Standard Solution稀释为500μg/mL；根据样品数，每组设置三个重复，将BCA Solution A和BCA Solution B按50:1的比例稀释成工作液，充分混匀后，24h内使用；在96孔板的样品孔中对稀释后的标准液进行配制；1×PBS将待测样品按照一定比例稀释后，取20μL加入96孔板的样品孔；向每个样品孔中加入200μL的BCA工作液，37℃放置50min；将96孔板置于562nm波长下检测；绘制标准曲线，计算待测蛋白样品浓度；

所述聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)配制，具体包括配置分离胶，快速混匀后加入两板之间，蒸馏水封胶，室温放置35min；分离胶凝固后，倒出蒸馏水，用滤纸吸干；配置浓缩胶，快速混匀后加入两板之间，插入梳子室温放置30min；待浓缩胶凝固后，将胶板放入电泳夹，对齐夹紧；

所述上样，具体包括根据蛋白样品浓度测定结果，用RIPA裂解液将蛋白样品浓度统一为3.5μg/μL；每40μL蛋白样品加入10μL 5×蛋白上样缓冲液(5倍稀释)，混匀后，100℃水浴加热10min，使蛋白变性；冷却至室温后，14,000rpm离心5min，取上清进行电泳；向孔中依次加入Protein Marker及样品，每孔15μL；

所述电泳，具体包括加好样品后，向电泳槽加入适量电泳液，调节电压至80V，开始跑胶；当样品带刚进入分离胶后，调节电压至120V；当样品带跑至距胶板下沿0.5cm时，关闭电源；

所述转膜，具体包括将胶切下，放入转膜液；将转膜夹黑板向下，依次铺上浸泡透的垫网、滤纸、胶、膜，赶走胶与膜之间的气泡，再铺上滤纸及垫网，合紧转膜夹，放入转膜槽；将转膜槽放入冰浴的转膜盒，倒入转膜液，同时放入冰盒；调节电流值250mA，转膜60min；

所述封闭，具体包括将膜取下，置于5％脱脂奶粉封闭液中，常温摇床1h；

所述一抗、二抗孵育，具体包括β-actin一抗稀释：4μLβ-actin一抗+10mL封闭液(1:2,500)；β-actin二抗稀释：2μLβ-actin二抗+10mL 1×TBST(1:5,000)；CART一抗稀释：20μL CART一抗+10mL封闭液(1:500)；CART二抗稀释：2μL CART二抗+10mL 1×TBST(1:5,000)；NC膜置于孵育盒，并加入一抗稀释液，4℃过夜孵育，次日用1×TBST洗膜3次，每次8min；加入二抗稀释液，室温摇床l h，1×TBST洗膜3次，每次8min；

所述显影，具体包括eECL-A和eECL-B按照1:1的比例等体积混合，配制为化学发光检测底物工作液；弃去洗涤缓冲液，将发光底物工作液滴加在NC膜上，室温孵育5min；吸去多余发光底物工作液，将膜放置到化学发光成像仪内进行检测。

优选的，所述小鼠侧脑室注射，具体包括：

①所有小鼠适应性喂养一周后随机分为7组(agomiR-491组、antagomiR-491组、agomiR-381组、antagomiR-381组、NC组、生理盐水组、空白组)，每组10只，小鼠可自由进行水和食物的摄取；

②mmu-agomiRNA mimics、mmu-antagomiRNA mimics与NC片段合成；

③核酸与活体转染试剂恢复至室温后，用纯水将核酸稀释为1.5μg/μL，按照1:2的比例将活体转染试剂加入到稀释后的核酸溶液，立即充分振荡混匀，室温静置15min；

④固定好小鼠后，用75％酒精擦拭小鼠皮肤表面，确定注射部位为头部正中线与两耳连线的交点向左或向右1.2mm，垂直颅骨进针2.2mm；采用2μL的微量注射器进行侧脑室注射，试验组以1μL/min的流量注射核酸与活体转染试剂混合物，生理盐水组以相同流速注射生理盐水2μL，空白组不注射，注射后观察小鼠活力，无异样放回鼠笼；

⑤注射72h后，左手拇指、中指和食指抓取小鼠的颈部头皮，小指和无名指固定尾巴，轻压眼部皮肤使眼球充血突出，用镊子夹取眼球并快速摘取，用离心管接取血液，当血液滴入速度变慢时轻按小鼠心脏部位以获取更多血液，将全血在室温下切斜45°放置2h，待血清自然析出后，4℃，4,000rpm离心10min，取上清液，分装标记后保存于-80℃；

⑥使用脊椎脱臼法处死小鼠，剪下鼠头，分离下丘脑，液氮速冻后保存于-80℃备用。

优选的，所述qRT-PCR检测小鼠下丘脑组织基因表达，具体包括将保存于-80℃的下丘脑组织取出，液氮中充分研磨，每1mL Trizol加入50～100mg研磨完全的下丘脑组织，充分振荡混匀，室温放置5min使其充分裂解；总RNA的提取及检测、mRNA反转录、miRNA反转录、荧光定量PCR检测方法如上所述；miR-491、miR-381及CART基因的引物序列。

优选的，所述Western blot检测小鼠下丘脑组织CART蛋白表达，具体包括将小鼠下丘脑组织剪切成细小的碎片，每50mg组织加入500μL裂解液，匀浆至充分裂解；将裂解后的样品14,000rpm离心5min，取上清；BCA法蛋白浓度测定、SDS-PAGE配制、上样、电泳、转膜、封闭、一抗及二抗孵育、显影。

优选的，所述Elisa检测小鼠血清CART浓度，具体包括：

①原倍标准品按浓度梯度稀释为40ng/L、20ng/L、10ng/L、5ng/L、2.5ng/L；设置空白孔、标准孔(40ng/L组、20ng/L组、10ng/L组、5ng/L组、2.5ng/L组)、待测样品孔(agomiR-491组、antagomiR-491组、agomiR-381组、antagomiR-381组、NC组、生理盐水组、空白组)；

②酶标包被板上标准孔按浓度梯度各加入标准品50μL，待测样品孔先加样品稀释液40μL，再加待测样品10μL(样品最终稀释5倍)，晃动混匀；用封板膜封板后置37℃温育30min；将浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用；揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干；除空白孔外，每孔加入酶标试剂50μL，37℃温育30min；洗涤液清洗5次，每孔先加入显色剂A50μL，再加入显色剂B 50μL，振荡混匀，37℃避光显色10min；每孔加终止液50μL，终止反应；加终止液15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

与现有技术相比，发明的有益效果是：

1、本发明通过细胞与动物活体试验筛选出两个抑制牛CART表达的主要调控miRNA，bta-miR-491、bta-miR-381通过与CART mRNA的3′UTR区不完全结合，减少CART蛋白的表达，从而可促进卵泡发育，提高单胎家畜排卵率，提高母牛的繁殖能力。

2、本发明通过细胞与动物试验探究miRNAs对CART mRNA及CART蛋白的表达调控，在细胞试验中，从基因和蛋白表达情况综合分析，最终确定bta-miR-491、bta-miR-381对CART表达抑制效果最强。小鼠活体试验表明，miR-491与miR-381都能通过与小鼠下丘脑CART mRNA相应的靶位点结合，显著抑制CART基因的表达，最终影响下丘脑CART蛋白表达和血清中CART的分泌浓度。

3、本发明首次对调控牛下丘脑CART表达的miRNA进行筛选验证，筛选出bta-miR-491、bta-miR-381为抑制CART表达的主要调控miRNA，对牛下丘脑CART表达的分子机制研究奠定了理论基础，进一步丰富了CART对牛卵泡发育的调控机理，为后期设计miRNA药物通过静脉注射促进卵泡发育、提高单胎家畜的排卵率提供理论与技术支持。

4、本方案通过将miRNAs与CART过表达载体同时转染293T细胞，检测CART mRNA与CART蛋白表达量，分析得到在细胞中bta-miR-491、bta-miR-381对CART表达抑制效果最强；通过侧脑室注射在小鼠下丘脑过表达及抑制miR-491、miR-381，检测小鼠下丘脑CARTmRNA、CART蛋白表达量及血清中CART浓度，最终确定bta-miR-491、bta-miR-381为抑制CART表达的主要调控因子，且二者抑制效果无显著差异。

附图说明

图1为实施例中的bta-miRNAs mimics与NC序列示意图；

图2为实施例中的mRNA去除基因组DNA反应体系示意图；

图3为实施例中的mRNA反转录反应体系示意图；

图4为实施例中的miRNA去除基因组DNA反应体系示意图；

图5为发明的miRNA反转录反应体系示意图；

图6为实施例中的目的基因引物序列示意图；

图7为实施例中的mRNA荧光定量PCR反应体系示意图；

图8为实施例中的miRNA荧光定量PCR反应体系示意图；

图9为实施例中的BCA标准品体系示意图；

图10为实施例中的SDS-PAGE分离胶配比示意图；

图11为实施例中的SDS-PAGE浓缩胶配比示意图；

图12为实施例中的mmu-agomiRNA mimics、mmu-antagomiRNA mimics与NC序列示意图；

图13为实施例中的miRNAs过表达检测示意图一；

图14为实施例中的miRNAs过表达检测示意图二；

图15为实施例中的miRNAs过表达检测示意图三；

图16为实施例中的miRNAs过表达检测示意图四；

图17为实施例中的CART mRNA相对表达量示意图；

图18为实施例中的Western blot检测CART蛋白结果图示意图一；

图19为实施例中的Western blot检测CART蛋白结果图示意图二；

图20为实施例中的miRNAs过表达检测示意图；

图21为实施例中的CART mRNA相对表达量示意图；

图22为实施例中的CART蛋白Western blot结果示意图；

图23为实施例中的CART蛋白标准曲线示意图；

图24为实施例中的CART蛋白表达量示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-24，发明提供一种技术方案：miR-491、miR-381在牛下丘脑CART转录后表达调控中的应用，其特征在于：具体包括miRNAs对CART抑制作用的比较分析和miR-491、miR-381对小鼠CART表达的调控；

所述miRNAs对CART抑制作用的比较分析，具体包括以下步骤：

步骤一：脂质体转染法转染293T细胞；

步骤二：qRT-PCR检测293T细胞基因表达，具体包括：细胞总RNA提取及检测；mRNA反转录；miRNA反转录；引物设计；荧光定量PCR检测；

步骤三：Western blot检测293T细胞CART蛋白表达，具体包括：细胞总蛋白提取；BCA法蛋白浓度测定；聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)配制；上样；电泳；转膜；封闭；一抗、二抗孵育；显影。

所述miR-491、miR-381对小鼠CART表达的调控，具体包括以下步骤：

步骤一：小鼠侧脑室注射；

步骤二：qRT-PCR检测小鼠下丘脑组织基因表达；

步骤三：Western blot检测小鼠下丘脑组织CART蛋白表达；

步骤四：Elisa检测小鼠血清CART浓度。

本实施例中，所述脂质体转染法转染293T细胞，具体包括：

①设置7个试验组：miR-377+CART组、miR-331-3p+CART组、miR-491+CART组、miR-493+CART组、miR-758+CART组、miR-877+CART组和miR-381+CART组；1个阳性对照组：NC+CART组；8个阴性对照组：miR-377+pEX-3组、miR-331-3p+pEX-3组、miR-491+pEX-3组、miR-493+pEX-3组、miR-758+pEX-3组、miR-877+pEX-3组、miR-381+pEX-3组和NC+pEX-3组；1个转染试剂对照组：TransIntroTM EL组；1个空白细胞组：空白组；上述每组三个重复；

②bta-miRNAs mimics与NC片段由上海吉玛制药技术有限公司合成，如图1所示的表1bta-miRNAs mimics与NC序列；

③将4μg质粒DNA/pEX-3与250pmol miRNA/NC加入到200μL DMEM basic(1×)培养基中轻柔混匀，室温放置5min；将12μL TransIntroTM EL加入到200μL DMEM basic(1×)培养基轻柔混匀，室温放置5min；将稀释后的TransIntroTM EL加入到稀释后的质粒DNA与miRNA的混合液中轻柔混匀，室温放置15～20min；

④铺板后培养12～24h，待细胞达到70～80％汇合度时，弃去旧培养液，用适量PBS清洗细胞2次；每孔加入2mL RPMI Medium 1640basic(1×)，再加入各组的转染混合物后置于37℃，5％CO

本实施例中，所述细胞总RNA提取及检测，具体包括转染24h后，PBS清洗细胞，每孔加入1mL Trizol裂解细胞，反复吹打，使细胞充分裂解，收集于1.5mL离心管；4℃，12,000rpm离心10min，将红色悬液转移到另一离心管，室温下静置5min；每个离心管中加入200μL预冷的氯仿，剧烈手摇振荡15s，室温静置3min，4℃，12,000rpm离心15min，此时看到溶液分为三相，RNA在上层无色有机相，小心吸取上层水相至另一离心管；各管加入500μL预冷的异丙醇，混匀，室温下静置10min，以沉淀RNA，4℃，12,000rpm离心10min后可看到米粒大小的沉淀物，弃上清，各管加入1mL 75％预冷的乙醇洗涤沉淀；4℃，7,500rpm离心5min，弃去酒精，室温干燥沉淀10min，加30μL DEPC水溶解沉淀；取1μL RNA样品经核酸蛋白测定仪检测其纯度及浓度，要求OD

所述mRNA反转录，具体包括gDNA Eraser去除基因组DNA，42℃反应2min，如图2所示的表2mRNA去除基因组DNA反应体系；TB Green qPCR法进行mRNA反转录，37℃15min，85℃5s，4℃∞(4℃无限小伙循环，PCR机器设置的保存条件)，如图3所示的表3mRNA反转录反应体系；

所述miRNA反转录，具体包括样品基因组DNA去除，离心管配制反应液，如图4所示的表4miRNA去除基因组DNA反应体系，37℃反应30min；加入2.5μL 0.5mol/L EDTA，混匀，80℃加热处理2min，DEPC水定容至100μL；加入10μL 3mol/L醋酸钠和250μL冷乙醇，混匀后-80℃放置20min；4℃，12,000rpm离心10min，弃上清；加入70％冷乙醇洗净，4℃，7,500rpm离心5min，弃上清；干燥沉淀后用适量DEPC水溶解沉淀；使用加尾法进行miRNA反转录，如图5所示的表5miRNA反转录反应体系，37℃15min，85℃5s，4℃∞；加入90μLddH

所述引物设计，具体包括NCBI网站搜索并下载Bos taurus的CART mRNA+UTR、miR-377、miR-331-3p、miR-491、miR-493、miR-758、miR-877及miR-381的基因序列，并使用Primer 3plus设计引物；交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，如图6所示的表6目的基因引物序列。

所述荧光定量PCR检测，具体包括荧光定量PCR检测和miRNA荧光定量PCR；

所述荧光定量PCR检测，具体包括mRNA荧光定量PCR反应体系，如图7所示的表7mRNA荧光定量PCR反应体系，反应程序为：预变性95℃30s；PCR反应95℃5s，60℃30s，72℃20s，40个循环；溶解曲线阶段95℃15s，60℃60s，95℃15s；

所述miRNA荧光定量PCR，具体包括miRNA荧光定量PCR反应体系，如图8所示的表8miRNA荧光定量PCR反应体系，反应程序为：预变性95℃10s；PCR反应95℃5s，60℃20s，40个循环；溶解曲线阶段95℃60s，60℃30s，95℃30s。

本实施例中，所述细胞总蛋白提取，具体包括每250μL RIPA加入2.5μL PMSF，混匀备用；转染后48h，PBS清洗细胞，每孔加入250μL裂解液，吹打数次，使细胞充分裂解；裂解后的样品14,000rpm离心5min，取上清；

所述BCA法蛋白浓度测定，具体包括使用1×PBS将BSA Standard Solution稀释为500μg/mL；根据样品数，每组设置三个重复，将BCA SolutionA和BCA Solution B按50:1的比例稀释成工作液，充分混匀后，24h内使用；如图9所示的表9BCA标准品体系，在96孔板的样品孔中对稀释后的标准液进行配制；1×PBS将待测样品按照一定比例稀释后，取20μL加入96孔板的样品孔；向每个样品孔中加入200μL的BCA工作液，37℃放置50min；将96孔板置于562nm波长下检测；绘制标准曲线，计算待测蛋白样品浓度；

所述聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)配制，具体包括如图10所示的表10SDS-PAGE分离胶配比，配置分离胶，快速混匀后加入两板之间，蒸馏水封胶，室温放置35min；分离胶凝固后，倒出蒸馏水，用滤纸吸干；如图11所示的表11SDS-PAGE浓缩胶配比，配置浓缩胶，快速混匀后加入两板之间，插入梳子室温放置30min；待浓缩胶凝固后，将胶板放入电泳夹，对齐夹紧；

所述上样，具体包括根据蛋白样品浓度测定结果，用RIPA裂解液将蛋白样品浓度统一为3.5μg/μL；每40μL蛋白样品加入10μL 5×蛋白上样缓冲液(5倍稀释)，混匀后，100℃水浴加热10min，使蛋白变性；冷却至室温后，14,000rpm离心5min，取上清进行电泳；向孔中依次加入Protein Marker及样品，每孔15μL；

所述电泳，具体包括加好样品后，向电泳槽加入适量电泳液，调节电压至80V，开始跑胶；当样品带刚进入分离胶后，调节电压至120V；当样品带跑至距胶板下沿0.5cm时，关闭电源；

所述转膜，具体包括将胶切下，放入转膜液；将转膜夹黑板向下，依次铺上浸泡透的垫网、滤纸、胶、膜，赶走胶与膜之间的气泡，再铺上滤纸及垫网，合紧转膜夹，放入转膜槽；将转膜槽放入冰浴的转膜盒，倒入转膜液，同时放入冰盒；调节电流值250mA，转膜60min；

所述封闭，具体包括将膜取下，置于5％脱脂奶粉封闭液中，常温摇床1h；

所述一抗、二抗孵育，具体包括β-actin一抗稀释：4μLβ-actin一抗+10mL封闭液(1:2,500)；β-actin二抗稀释：2μLβ-actin二抗+10mL 1×TBST(1:5,000)；CART一抗稀释：20μL CART一抗+10mL封闭液(1:500)；CART二抗稀释：2μL CART二抗+10mL 1×TBST(1:5,000)；NC膜置于孵育盒，并加入一抗稀释液，4℃过夜孵育，次日用1×TBST洗膜3次，每次8min；加入二抗稀释液，室温摇床l h，1×TBST洗膜3次，每次8min；

所述显影，具体包括eECL-A和eECL-B按照1:1的比例等体积混合，配制为化学发光检测底物工作液；弃去洗涤缓冲液，将发光底物工作液滴加在NC膜上，室温孵育5min；吸去多余发光底物工作液，将膜放置到化学发光成像仪内进行检测。

本实施例中，所述小鼠侧脑室注射，具体包括：

①所有小鼠适应性喂养一周后随机分为7组(agomiR-491组、antagomiR-491组、agomiR-381组、antagomiR-381组、NC组、生理盐水组、空白组)，每组10只，小鼠可自由进行水和食物的摄取；

②mmu-agomiRNA mimics、mmu-antagomiRNA mimics与NC片段由上海吉玛制药技术有限公司合成；如图12所示的表12mmu-agomiRNA mimics、mmu-antagomiRNA mimics与NC序列。

③核酸与活体转染试剂恢复至室温后，用纯水将核酸稀释为1.5μg/μL，按照1:2的比例将活体转染试剂加入到稀释后的核酸溶液，立即充分振荡混匀，室温静置15min；

④固定好小鼠后，用75％酒精擦拭小鼠皮肤表面，确定注射部位为头部正中线与两耳连线的交点向左或向右1.2mm，垂直颅骨进针2.2mm；采用2μL的微量注射器进行侧脑室注射，试验组以1μL/min的流量注射核酸与活体转染试剂混合物，生理盐水组以相同流速注射生理盐水2μL，空白组不注射，注射后观察小鼠活力，无异样放回鼠笼；

⑤注射72h后，左手拇指、中指和食指抓取小鼠的颈部头皮，小指和无名指固定尾巴，轻压眼部皮肤使眼球充血突出，用镊子夹取眼球并快速摘取，用离心管接取血液，当血液滴入速度变慢时轻按小鼠心脏部位以获取更多血液，将全血在室温下切斜45°放置2h，待血清自然析出后，4℃，4,000rpm离心10min，取上清液，分装标记后保存于-80℃；

⑥使用脊椎脱臼法处死小鼠，剪下鼠头，分离下丘脑，液氮速冻后保存于-80℃备用。

本实施例中，所述qRT-PCR检测小鼠下丘脑组织基因表达，具体包括将保存于-80℃的下丘脑组织取出，液氮中充分研磨，每1mL Trizol加入50～100mg研磨完全的下丘脑组织，充分振荡混匀，室温放置5min使其充分裂解；总RNA的提取及检测、mRNA反转录、miRNA反转录、荧光定量PCR检测方法如上所述；miR-491、miR-381及CART基因的引物序列如图6所示的表6(小鼠与牛的miR-491、miR-381及CART基因序列相同，故各基因的引物序列也相同)。

本实施例中，所述Western blot检测小鼠下丘脑组织CART蛋白表达，具体包括将小鼠下丘脑组织剪切成细小的碎片，每50mg组织加入500μL裂解液，匀浆至充分裂解；将裂解后的样品14,000rpm离心5min，取上清；BCA法蛋白浓度测定、SDS-PAGE配制、上样、电泳、转膜、封闭、一抗及二抗孵育、显影。

本实施例中，所述Elisa检测小鼠血清CART浓度，具体包括：

①原倍标准品按浓度梯度稀释为40ng/L、20ng/L、10ng/L、5ng/L、2.5ng/L；设置空白孔、标准孔(40ng/L组、20ng/L组、10ng/L组、5ng/L组、2.5ng/L组)、待测样品孔(agomiR-491组、antagomiR-491组、agomiR-381组、antagomiR-381组、NC组、生理盐水组、空白组)；

②酶标包被板上标准孔按浓度梯度各加入标准品50μL，待测样品孔先加样品稀释液40μL，再加待测样品10μL(样品最终稀释5倍)，晃动混匀；用封板膜封板后置37℃温育30min；将浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用；揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干；除空白孔外，每孔加入酶标试剂50μL，37℃温育30min；洗涤液清洗5次，每孔先加入显色剂A50μL，再加入显色剂B 50μL，振荡混匀，37℃避光显色10min；每孔加终止液50μL，终止反应；加终止液15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

试验分析及结果：

(1)293T细胞bta-miRNAs mimics过表达检测：

qRT-PCR检测表明，7个miRNAs在miRNAs+CART组、miRNAs+pEX-3组均有表达，且miRNAs+pEX-3组中miRNAs的表达均极显著高于miRNAs+CART组(P<0.0001)，NC+CART组、NC+pEX-3组、转染试剂组、空白细胞组均未检测到miRNAs的表达，结果如图13-16所示miRNAs过表达检测，其中的，A：miR-377过表达检测，B：miR-331-3p过表达检测，C：miR-491过表达检测，D：miR-493过表达检测，E：miR-758过表达检测，F：miR-877过表达检测，G：miR-381过表达检测，EL：转染试剂组，CK：空白细胞组(****代表P<0.0001)。

结果表明7个bta-miRNAs均过表达成功，且在miR-377+CART组、miR-331-3p+CART组、miR-491+CART组、miR-493+CART组、miR-758+CART组、miR-877+CART组及miR-381+CART组中，bta-miRNAs与CART mRNA发生互作，从而降低了bta-miRNAs的相对表达量。

(2)293T细胞CARTmRNA表达检测：

qRT-PCR检测18个分组中CART mRNA的相对表达量，结果如图17所示的CARTmRNA相对表达量，其中的图中不同上标字母代表差异极显著(P<0.0001)，相同上标字母代表差异不显著(P>0.05)，EL：转染试剂组，CK：空白细胞组；

CARTmRNA在7个试验组(miR-377+CART组、miR-331-3p+CART组、miR-491+CART组、miR-493+CART组、miR-758+CART组、miR-877+CART组和miR-381+CART组)及NC+CART组中均有表达，8个阴性对照组(miR-377+pEX-3组、miR-331-3p+pEX-3组、miR-491+pEX-3组、miR-493+pEX-3组、miR-758+pEX-3组、miR-877+pEX-3组、miR-381+pEX-3组和NC+pEX-3组)、转染试剂对照组及空白组未检测到CARTmRNA的表达，表明pEX-3-CART mRNA+UTR重组质粒成功转染293T细胞且完整表达出CART mRNA+UTR序列。

7个试验组中CARTmRNA的表达均极显著低于NC+CART组(P<0.0001)；miR-377+CART组、miR-331-3p+CART组、miR-491+CART组、miR-758+CART组及miR-877+CART组中CART mRNA的表达均极显著低于miR-493+CART组、miR-381+CART组(P<0.0001)；miR-331-3p+CART组、miR-491+CART组及miR-877+CART组中CARTmRNA的表达均极显著低于miR-377+CART组、miR-758+CART组(P<0.0001)；miR-491+CART组中CART mRNA的表达极显著低于miR-331-3p+CART组、miR-877+CART组(P<0.0001)。

结果表明：7个bta-miRNAs均可抑制CARTmRNA的表达(P<0.0001)，其中，bta-miR-491抑制效果最强，bta-miR-331-3p、bta-miR-877抑制效果次之(P>0.05)，bta-miR-377和bta-miR-758抑制效果较弱(P>0.05)、bta-miR-493和bta-miR-381抑制效果最弱(P>0.05)。

(3)293T细胞CART蛋白表达检测：

Western blot检测各组CART蛋白的表达，结果表明，miR-377+CART组中CART蛋白的表达极显著低于NC+CART组(P<0.01)，miR-331-3p+CART组中CART蛋白的表达显著低于NC+CART组(P<0.05)；miR-491+CART组中CART蛋白的表达极显著低于NC+CART组(P<0.01)，miR-493+CART组中CART蛋白的表达显著低于NC+CART组(P<0.05)；miR-758+CART组、miR-877+CART组中CART蛋白的表达与NC+CART组相比无显著差异(P>0.05)；miR-381+CART组中CART蛋白的表达极显著低于NC+CART组(P<0.001)，如图18和19所示，其中的A：1-3孔为miR-377+CART组、4-6孔为NC+CART组、7-9孔为miR-331-3p+CART组，B：1-3孔为miR-491+CART组、4-6孔为NC+CART组、7-9孔为miR-493+CART组，C：1-3孔为miR-758+CART组、4-6孔为NC+CART组、7-9孔为miR-877+CART组，D：1-3孔为miR-381+CART组、4-6孔为NC+CART组(***代表P<0.001，**代表P<0.01，*代表P<0.05)。

结果表明：bta-miR-381对CART蛋白表达抑制作用最强(P<0.001)；bta-miR-377、bta-miR-491对CART蛋白表达抑制作用次之(P<0.01)；bta-miR-331-3p、bta-miR-493对CART蛋白表达抑制作用较弱(P<0.05)；bta-miR-758、bta-miR-877对CART蛋白表达无显著抑制作用(P>0.05)。

(4)小鼠下丘脑组织miRNA表达检测：

qRT-PCR检测miR-491在agomiR-491组、antagomiR-491组、NC组、生理盐水组及空白组小鼠下丘脑组织的表达情况，结果如图20中的A所示，agomiR-491组中miR-491的表达极显著高于空白组(P<0.0001)；antagomiR-491组中miR-491的表达极显著低于空白组(P<0.0001)；NC组、生理盐水组中miR-491的表达与空白组无显著差异(P>0.05)。

结果表明，miR-491在小鼠下丘脑的过表达及沉默作用均取得成功。

qRT-PCR检测miR-381在agomiR-381组、antagomiR-381组、NC组、生理盐水组及空白组小鼠下丘脑组织的表达情况，结果如图20中的B所示，agomiR-381组中miR-381的表达极显著高于空白组(P<0.0001)；antagomiR-381组中miR-381的表达显著低于空白组(P<0.05)；NC组、生理盐水组中miR-381的表达与空白组无显著差异(P>0.05)。

图20中的A：miR-491过表达检测，B：miR-381过表达检测，NS：生理盐水组，CK：空白组(****代表P<0.0001，*代表P<0.05)。

结果表明，miR-381在小鼠下丘脑的过表达及沉默作用均取得成功。

(5)小鼠下丘脑组织miRNA表达检测：

qRT-PCR检测7个处理组小鼠下丘脑组织CART mRNA的表达，结果如图21所示的CART mRNA相对表达量，agomiR-491组、agomiR-381组中CART mRNA的表达极显著低于空白组(P<0.0001)；agomiR-491组中CART mRNA的表达与agomiR-381组无显著差异(P>0.05)；antagomiR-491组、antagomiR-381组中CART mRNA的表达极显著高于空白组(P<0.0001)；antagomiR-381组中CART mRNA的表达极显著高于antagomiR-491组(P<0.0001)；NC组、生理盐水组中CART mRNA的表达与空白组无显著差异(P>0.05)。

图21中的NS：生理盐水组，CK：空白组(****代表P<0.0001)。

结果表明：过表达miR-491、miR-381均抑制小鼠下丘脑组织CART mRNA的表达，且二者抑制效果无显著差异；沉默miR-491、miR-381取得相反的结果，且沉默miR-381组CARTmRNA的表达极显著高于沉默miR-491组；注射NC与生理盐水对CART mRNA的表达无显著影响。

(6)小鼠下丘脑组织CART蛋白表达检测：

Western blot检测7个处理组小鼠下丘脑组织CART蛋白的表达，结果如图22所示的CART蛋白Western blot结果图，agomiR-491组、agomiR-381组中CART蛋白的表达显著低于空白组(P<0.05)；agomiR-491组中CART蛋白的表达与agomiR-381组无显著差异(P>0.05)；antagomiR-491组、antagomiR-381组中CART蛋白的表达极显著高于空白组(P<0.01)；antagomiR-491组中CART蛋白的表达与antagomiR-381组无显著差异(P>0.05)；NC组、生理盐水组中CART蛋白的表达与空白组无显著差异(P>0.05)。

图22中的A、B、C：Westernblot检测CART蛋白表达显影图(3个生物学重复)，1：agomiR-491组，2：antagomiR-491组，3：NC组，4：生理盐水组，5：空白组，6：antagomiR-381组，7：agomiR-381组；D：各组CART蛋白含量检测结果，NS：生理盐水组，CK：空白组(**代表P<0.01，*代表P<0.05)。

结果表明：过表达miR-491、miR-381均抑制小鼠下丘脑组织CART蛋白的表达，沉默miR-491、miR-381取得相反的结果，且二者的调控效果无显著差异。注射NC与生理盐水对小鼠下丘脑组织CART蛋白的表达无显著影响。

(7)小鼠血清CART浓度检测：

根据不同浓度标准品构建CART蛋白标准曲线，如图23所示，以标准物浓度为横坐标，OD值为纵坐标求出关系曲线为：y＝0.0498x+0.1677，R2＝0.9835。

根据标准曲线，求出7个分组血清中CART浓度，结果如图24所示，agomiR-491组、agomiR-381组中CART蛋白浓度极显著低于空白组(P<0.01)；agomiR-491组中CART蛋白浓度与agomiR-381组无显著差异(P>0.05)；antagomiR-491组、antagomiR-381组中CART蛋白浓度极显著高于空白组(P<0.01)；antagomiR-491组中CART蛋白浓度与antagomiR-381组无显著差异(P>0.05)；NC组、生理盐水组中CART蛋白浓度与空白组无显著差异(P>0.05)。

图24中的NS：生理盐水组，CK：空白组(**代表P<0.01)。

结果表明：小鼠下丘脑组织过表达miR-491、miR-381均能降低小鼠血清中CART蛋白浓度，沉默miR-491、miR-381取得相反的结果，且二者的调控效果无显著差异。注射NC序列与生理盐水对小鼠血清中CART蛋白浓度无显著影响。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。