法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2022-07-26
公开
发明专利申请公布
技术领域
本发明涉及一种小鼠模型的构建方法，具体是一种以炎症为特征的突发性聋小鼠模型的构建方法。
背景技术
根据《突发性聋诊断和治疗指南(2015)》(《中华耳鼻咽喉头颈外科杂志2015年6月第50卷第6期》的记载，突发性聋是指突然发生的、原因不明的感音神经性听力损失，3天内至少相连的2个频率听力下降20dB以上，其发病机制不清，病因不明，诱因多，无满意的动物模型进行相关的研究。在既往已有的突发性聋动物模型中，有根据突发性聋的可能机制，采取的阻断颈部血管或微球阻断小脑动脉，造成内耳缺血性改变来构建突发性聋动物模型(《磁微粒栓塞法突发性聋动物模型建立》，迟晓琳、夏瑞明、余力生，《中国耳鼻咽喉头颈外科》，2010年10月，第17卷第10期)，这种建模方式存在不稳定因素多、伴有造成动物脑组织器官损伤、动物存活时间短的缺陷。2004年，Hoya N等报道采用经圆窗膜投放线粒体毒素3-硝基丙酸(3-NP)至内耳，产生急性线粒体功能紊乱大鼠模型(A novel animal model ofacute cochlear mitochondrial dysfunction.Hoya N.Neuroreport.2004Jul 19；15(10)：1597-600)，表现为听力下降、耳蜗螺旋神经节细胞损伤。2007年后张亚、罗蓉分别报道采用3-NP投放到圆窗膜，构建突发性聋豚鼠模型，并探讨氧化应激在其中的作用(《线粒体毒素诱导伴有眩晕的突发性耳聋模型的建立》，张亚,邹静,IlmariPyykko,吴皓,上海交通大学学报(医学版)2007年第29卷第1期；《线粒体毒素诱导突发性耳聋模型血管纹损伤机制的研究》，罗蓉,孔维佳,程华茂，《中国组织化学与细胞化学杂志》，2009年，第18卷第2期)。2005年有作者报道采用经鼓膜穿刺注射脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)到中耳腔，然后经圆窗膜渗透到内耳，构建感音神经性聋动物炎症豚鼠模型，这种方法操作简单，但是同时导致中耳炎，影响听力检测的准确性(《感染性神经性耳聋动物模型的建立及评估》，王宜南，王朝永，姬长友，《中国临床康复》2005年，第9卷第4期)。
发明内容
申请人经研究发现，越来愈多的证据提示突发性聋发生发展与炎症反应密切相关。基于上述发现，申请人通过大量的实验和研究，提出了通过园窗膜径路先用胶原酶浸润园窗膜，后给予LPS，渗透到内耳的技术，构建以炎症反应为特征的急性感音性聋(突发性聋)小鼠模型的方法。该方法的具体步骤如下：
1、采用C57BL/6小鼠，在小鼠听泡后下方与颞骨临近处打孔，暴露圆窗，在小鼠圆窗龛内注入胶原酶进行浸润，浸润后用明胶海绵将圆窗龛内残余胶原酶吸除；
2)取3μl浓度为5mg/ml的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)溶液，先向圆窗龛内注入1μl LPS溶液，用明胶海绵填塞圆窗龛，然后再将余下的2μl LPS溶液注入明胶海绵内，注入完毕后逐层缝合肌肉和皮肤，待小鼠苏醒后放入笼中继续饲养；
3、术后第3天检测听性脑干反应(Auditory brainstem response,ABR)及耳蜗形态学观察。平均ABR反应阈值下降15dBHL以上，耳蜗形态发生炎症改变，毛细胞缺失，表明LPS诱导的突发性聋小鼠模型成功，可用于研究在体状态下炎性因素引发的耳蜗毛细胞、螺旋神经节等急性损伤的分子机制。
上述步骤1)中，C57BL/6小鼠雌雄不分，周龄为6-8周为宜，年龄小的小鼠体质相对差一些，对手术和麻醉的承受差一些，年龄大一些的小鼠平均听力水平会减退。
上述步骤1)中，先用7号尖刀扩大打孔范围至约直径1.5mm，可见到紧贴鼓室内侧壁纵向走行的镫骨动脉，在镫骨动脉后上方，可见一椭圆形骨性凹陷，即为圆窗龛所在位置，再用显微镊分离圆窗龛周围组织，使圆窗充分暴露。
上述步骤1)中，通过微量吸液管抽取1μl浓度为30mg/ml的胶原酶I，再通过微量注射泵注入小鼠圆窗龛内。
申请人经研究发现，步骤1)中，胶原酶I放入小鼠圆窗龛的浸润时间过长会引起圆窗膜过度消化后组织结构破坏，时间太短则起不到作用，在基于大量实验的基础上，确定浸润时间为10分钟。
上述步骤2)中，注射LPS溶液速率均为50nl/s，以免速率过快导致LPS溶液溢出；明胶海绵应填充至听泡打孔处，填满圆窗龛，体积为5–10mm
相对于现有技术，本发明具有如下优点和进步：
1，相对于既往的突发性聋模型，本发明采用小鼠听泡开小窗，在放置LPS前，预先用胶原酶I消化圆窗膜表面的组织细胞，而不损伤其上皮组织，提高LPS经园窗膜到内耳外淋巴液的渗透率。
2，将LPS直接浸润到园窗龛的海绵上，再通过园窗膜渗透到内耳，避免了鼓膜穿刺方法导致的中耳腔感染。
3，既往突发性聋模型都是采用豚鼠或大鼠构建，由于小鼠和人的基因具有极高的相似度，近年来越来越多的耳聋研究采用了基因小鼠，本发明采用C57BL/6小鼠进行模型构建，满足了研究发展的需求。
4，由于突发性聋的发病机制不清，主要学说有内耳供血障碍、病毒感染、免疫功能紊乱、应激等，而各因素导致的突发性聋均有炎症反应，本发明采用LPS诱发内耳急性损伤，成功构建了炎症为特征的突发性聋小鼠模型。
附图说明
图1是本发明对照组【人工淋巴液(Artificial perilymph，AP)组】耳蜗HE光镜照片。
其中，图1A是耳蜗HE染色全景光镜照片，图1B是耳蜗基底膜光镜照片，图1C是耳蜗血管纹光镜照片，图1D是耳蜗蜗轴光镜照片。
图1A、图1B显示：耳蜗内外毛细胞排列整齐，无毛细胞缺失，基底膜完整，螺旋韧带染色均匀。
图1C显示：耳蜗血管纹无充血、肿胀、断裂。
图1D显示：耳蜗蜗轴中的螺旋神经细胞染色均匀，排列整齐，无缺失，浆核比均匀。
对照组是向小鼠耳蜗圆窗龛海绵浸润AP，通过HE染色观察耳蜗结构变化情况，图1A-图1D表明向小鼠耳蜗圆窗龛海绵浸润技术不会引起耳蜗损伤。
图2是本发明实施例(实验组)的LPS组HE染色光镜照片。
其中，图2A是耳蜗全景光镜照片，图2B是耳蜗基底膜光镜照片，图2C是耳蜗血管纹光镜照片，图2D是耳蜗蜗轴光镜照片。
图2A、3B显示：耳蜗螺旋韧带结构疏松，与蜗壳间距加大。
图2C显示：耳蜗血管纹变薄，有断裂现象。
图2D显示：耳蜗蜗轴中螺旋神经细胞空泡变性，浆核比明显降低。
实验组是采用本发明所述步骤向小鼠圆窗龛投放LPS，通过HE染色观察耳蜗结构变化情况。图1A-图1D表明，经圆窗膜注入LPS可以引起耳蜗结构损伤。
图3是小鼠突发性聋模型耳蜗基底膜铺片免疫荧光染色光镜照片。
其中，图3A是正常对照组，显示耳蜗基底膜外毛细胞完整，图3B是LPS给药(造模)组，显示外毛细胞出现明显缺失(箭头标记处)。
图4是LPS诱导突发性聋小鼠模型各频率ABR阈值比较图。
LPS组与AP组比较，**p<0.01,***p<0.001。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，结合附图，对本发明进行详细阐述。
突发性聋小鼠模型的构建
1、实验组(LPS组)
方法及材料：
1)取雄性7周龄C57BL/6小鼠10只，分别在听泡后下方与颞骨临近处打孔，用7号尖刀扩大打孔范围至约直径1.5mm，可见到紧贴鼓室内侧壁纵向走行的镫骨动脉，在镫骨动脉后上方，可见一椭圆形骨性凹陷，即为圆窗龛所在位置，用显微镊分离圆窗龛周围组织，使圆窗充分暴露后，用微量吸液管抽取1μl浓度为30mg/ml的胶原酶I并通过微量注射泵将胶原酶I注入小鼠圆窗龛内，浸润10分钟后用明胶海绵将圆窗龛内残余胶原酶吸除。
2)用微量吸液管抽取3μl浓度为5mg/ml的LPS溶液，通过微量注射泵先将1μl LPS溶液以50nl/s的速率注入圆窗龛，然后在圆窗龛内置放体积约为5–10mm
3)术后第三天ABR反应阈值检测及耳蜗HE染色形态观察，各频率平均阈值下降15dbHL以上，耳蜗形态结构发生炎症改变，表明LPS诱导的急性内耳损伤模型造模成功，可用于研究在体状态下炎性因素引发的耳蜗毛细胞急性损伤的分子机制。
2、对照组(AP组)实验
1)取雄性7周龄C57BL/6小鼠10只，分别在听泡后下方与颞骨临近处打孔，用7号尖刀扩大打孔范围至约直径1.5mm，可见到紧贴鼓室内侧壁纵向走行的镫骨动脉，在镫骨动脉后上方，可见一椭圆形骨性凹陷，即为圆窗龛所在位置，用显微镊分离圆窗龛周围组织，使圆窗充分暴露后，用微量吸液管抽取1μl浓度为30mg/ml的胶原酶I并通过微量注射泵将胶原酶I注入小鼠圆窗龛内，浸润10分钟后用明胶海绵将圆窗龛内残余胶原酶吸除。
2)用微量吸液管抽取3μl浓度为5mg/ml的AP溶液，通过微量注射泵先将1μl AP溶液以50nl/s的速率注入圆窗龛，然后在圆窗龛内置放体积约为5–10mm
3)术后第三天进行ABR检测小鼠听力水平及耳蜗形态结构观察，各频率平均听阈下降5dBHL以内，耳蜗形态结构基本正常，表明向小鼠耳蜗圆窗龛放置胶原酶及AP浸润海绵技术操作不会引起耳蜗损伤。
3、耳蜗形态结构观察
AP组：参见图1A-图1D，AP组耳蜗HE染色见内外毛细胞排列整齐，无毛细胞缺失，基底膜完整，螺旋韧带染色均匀。血管纹无充血、肿胀、断裂。蜗轴中的螺旋神经细胞染色均匀，排列整齐，无缺失，浆核比均匀。
LPS组：参见图2A图2D，LPS组耳蜗HE染色见螺旋韧带结构疏松，与蜗壳间距加大。血管纹变薄，有断裂现象，蜗轴中螺旋神经细胞空泡变性，浆核比明显降低。以上改变均说明LPS组耳蜗形态结构发生了明显变化，表明本发明所述的造模方法可以对小鼠内耳产生影响，耳蜗形态结构的变化表明采用本发明可以有效构建突发性聋小鼠模型。
术后所有小鼠均存活良好，未见步态不稳等前庭功能障碍。术后耳蜗取材时见听泡打孔处被正常黏膜组织包裹，中耳腔内洁净，黏膜无肿胀、充血及渗液。
4、ABR检测：
LPS组：小鼠突发性聋模型构建手术前，各频率平均ABRIII波反应阈值39.25±3.01dBHL，术后第3天所测得术侧耳各频率平均ABR阈值61.25±4.05dBHL，较术前有显著上升，差异具有统计学意义(P＜0.05)，且在4kHz、8kHz、16kHz、32kHz处术后ABR阈值较术前均有显著改变，差异具有统计学意义(均P＜0.05)。
AP组：手术前，小鼠各频率平均ABRIII波反应阈值38.25±2.877dBHL，术后第3天所测得术侧耳各频率平均ABR阈值40.00±3.85dBHL，差异无统计学意义(P＞0.05)，在4kHz、8kHz、16kHz、32kHz处术后ABR阈值较术前均无显著改变，差异无统计学意义(均P＞0.05)。
两组小鼠术后各频率ABR阈值结果，提示LPS组各频率的ABR阈值均有明显上升(见图4)。
5、通过基底膜铺片免疫荧光染色观察耳蜗毛细胞缺失情况
图3是突发性聋模型小鼠耳蜗基底膜免疫荧光染色图
参见图3，图3A显示AP组耳蜗基底膜外毛细胞排列完整；图3B显示LPS给药(造模)组，外毛细胞出现明显缺失(白色箭头标记处)。
根据耳蜗形态结构观察、ABR检测以及通过基底膜铺片免疫荧光染色观察耳蜗毛细胞缺失的结果，表明本发明所述的通过园窗膜径路给予LPS，渗透到内耳的方法，可以有效构建以炎症为特征的突发性聋小鼠模型。
机译： 皮肤疾病模型小鼠，用于构建相同模型的饲料以及利用小鼠评估试验物质的方法
机译： 防止免疫细胞与其他细胞结合的方法，bst2诱饵，嵌合构建体，单克隆抗体，分离bst2配体的方法，其体质细胞和生殖细胞包含功能受损的bst2或潮湿基因的转基因小鼠，其体质细胞和生殖细胞包括被bst2基因完全或部分替换的潮湿基因，减少患者炎症的方法，治疗患者炎症相关疾病的症状的方法以及确定有效抑制化学化合物的方法测试bst2介导的细胞间结合
机译： 人类基因组构建报告细胞和小鼠模型，以筛选针对小胶质细胞表达的疾病相关基因的治疗方法
