用于维生素D和钙代谢相关基因分型的扩增引物组及探针、试剂盒、分型方法

技术领域

本申请属于基因检测技术领域，具体涉及用于维生素D和钙代谢相关基因分型的扩增引物组及探针、试剂盒、分型方法。

背景技术

维生素D(Vitamin D)是一种脂溶性维生素，它是维持人体生命活动所必需的营养素，主要功能是调节钙、磷代谢，促进肠内钙磷吸收和骨质钙化，维持血钙和血磷的平衡。另外，维生素D还具有调节细胞生长分化和免疫调节的作用。钙(Calcium)也是人体所必需营养素，它不仅是组成骨骼、牙齿的主要无机成分，也是神经递质、肌肉收缩、血液凝结、激素释放和乳汁分泌等所必需的元素。

缺乏维生素D和钙可导致婴幼儿佝偻病和成人软骨病，同时，也会对神经系统造成影响，比如婴儿智力发育迟缓、易哭闹，成人易失眠多梦，而且缺乏维生素D还会降低人体免疫力。另外，当维生素D和钙摄入不足时，糖尿病和心血管疾病的发病率会升高，甚至可能引发恶性肿瘤。因此，开展个体营养需求检测对于每个人的健康都是不可或缺的。

通常个体营养需求的检测主要通过生化检测方法，但是这种方法只能检测个体当前的营养状态，且易受到外界因素的影响。而营养代谢基因检测是从基因层面对营养代谢能力的常态检测，一次检测终身受益。

与维生素D和钙代谢相关的主要基因有CYP2R1、GC和VDR等。VDR基因编码维生素D受体(Vitamin D receptor，VDR)，作为一种亲核蛋白，VDR是介导1,25(OH),D发挥生物学效应的核内大分子，在维持钙-磷代谢、调节细胞增殖、分化等方面起着重要的作用。VDR基因中的rs2228570的突变会降低受体亲和力，从而降低维生素D衍生物与受体的结合，阻碍肠道对钙的吸收。GC基因编码维生素D结合蛋白，也称GC球蛋白，能够与各种形式的维生素D结合，可在皮肤、肝脏和肾脏之间转运维生素D的代谢产物并运送至靶器官中，rs2282679位点的突变会降低GC球蛋白的活性从而影响维生素D和钙的吸收。CYP2R1编码的蛋白是细胞色素P450超家族酶的成员，可以将维生素D转化成活性形式从而与维生素D受体结合，进而促进钙的吸收，rs10741657位点的突变也会影响维生素D和钙的代谢。因此，开展维生素D和钙代谢基因多态性的检测对于了解个体营养需求状况意义重大。

目前，检测SNP多态性的主要方法有sanger测序法、基因芯片法、PCR-RFLP、Taqman探针法等。例如，中国专利CN113604558A公开了维生素D受体基因SNP位点检测试剂，使用Sanger测序法检测了VDR基因rs2228570的多态性。中国专利CN108893531A公开了一种儿童维生素需求基因检测试剂盒，利用基因芯片法检测了CYP2R1 rs10741657的多态性；这两种方法的成本均比较高，不利于市场推广。中国专利CN110358844A公开了基于核酸质谱分型技术的运动遗传标记位点检测方法及其产品，使用核酸质谱法检测了GC rs2282679的多态性，但是质谱法对设备的要求较高。另外，PCR-RFLP法操作复杂繁琐，且灵敏度较低。传统的Taqman探针法需要根据不同的碱基突变设计不同的荧光探针，较为麻烦且成本较高；中国专利CN113215227A公开了一种维生素D受体基因分型检测用的引物和探针，使用ARMS-PCR的方法检测了VDR基因四个位点的多态性，但是该专利所包含与维生素D和钙代谢相关基因检测不够全面。

发明内容

有鉴于此，一方面，一些实施例公开了用于维生素D和钙代谢相关基因分型的扩增引物组及探针，包括：CYP2R1-rs10741657位点的ARMS引物组及探针、GC-rs2282679位点的ARMS引物组及探针以及VDR-rs2228570位点的ARMS引物组及探针；其中，

CYP2R1-rs10741657位点的ARMS引物组及探针包括：

CYP2R1-rs10741657野生型正向引物，其序列如SEQ ID NO：01所示；

CYP2R1-rs10741657突变型正向引物，其序列如SEQ ID NO：02所示；

CYP2R1-rs10741657共用反向引物，其序列如SEQ ID NO：03所示；

CYP2R1-rs10741657共用探针，其序列如SEQ ID NO：04所示；

GC-rs2282679位点的ARMS引物组及探针包括：

GC-rs2282679野生型正向引物，其序列如SEQ ID NO：05所示；

GC-rs2282679突变型正向引物，其序列如SEQ ID NO：06所示；

GC-rs2282679共用反向引物，其序列如SEQ ID NO：07所示；

GC-rs2282679共用探针，其序列如SEQ ID NO：08所示；

VDR-rs2228570位点的ARMS引物组及探针包括：

VDR-rs2228570野生型正向引物，其序列如SEQ ID NO：09所示；

VDR-rs2228570突变型正向引物，其序列如SEQ ID NO：10所示；

VDR-rs2228570共用反向引物，其序列如SEQ ID NO：11所示；

VDR-rs2228570共用探针，其序列如SEQ ID NO：12所示。

另一方面，一些实施例公开了用于维生素D和钙代谢相关基因分型的试剂盒，包括用于维生素D和钙代谢相关基因分型的扩增引物组及探针。

进一步，一些实施例公开的用于维生素D和钙代谢相关基因分型的试剂盒，还包括PCR扩增试剂。

一些实施例公开的用于维生素D和钙代谢相关基因分型的试剂盒，包括扩增引物组、探针和PCR扩增试剂的扩增反应体系配置为：

再一方面，一些实施例公开了维生素D和钙代谢相关基因的分型方法，包括：利用用于维生素D和钙代谢相关基因分型的扩增引物及探针对维生素D和钙代谢相关基因进行扩增。

进一步，一些实施例公开的维生素D和钙代谢相关基因的分型方法，包括：利用CYP2R1-rs10741657位点的ARMS引物组及探针、GC-rs2282679位点的ARMS引物组及探针以及VDR-rs2228570位点的ARMS引物组及探针对维生素D和钙代谢相关基因分别进行扩增。

一些实施例公开的维生素D和钙代谢相关基因的分型方法，扩增反应体系为：

一些实施例公开的维生素D和钙代谢相关基因的分型方法，包括：利用用于维生素D和钙代谢相关基因分型的试剂盒对维生素D和钙代谢相关基因进行扩增。

一些实施例公开的维生素D和钙代谢相关基因的分型方法，利用试剂盒中的CYP2R1-rs10741657位点的ARMS引物组及探针、GC-rs2282679位点的ARMS引物组及探针以及VDR-rs2228570位点的ARMS引物组及探针对维生素D和钙代谢相关基因分别进行扩增。

本发明实施例公开的用于维生素D和钙代谢相关基因分型的扩增引物组及探针、试剂盒、分型方法，能够对CYP2R1-rs10741657、GC-rs2282679以及VDR-rs2228570三个基因位点多态性进行准确检测分析，较为全面的包含了与维生素D和钙代谢相关的基因位点，有利于全面了解个体营养需求，扩增引物组和探针具有良好的扩增特异性，检测灵敏度高、检测时间短，检测成本低，操作方法简便，在本领域有良好的推广应用使用前景。

附图说明

图1.CYP2R1-rs10741657位点基因型为AA的样本扩增结果；

图2.CYP2R1-rs10741657位点基因型为GG的样本扩增结果；

图3.CYP2R1-rs10741657位点基因型为AG的样本扩增结果；

图4.GC-rs2282679位点基因型为TT的样本扩增结果；

图5.GC-rs2282679位点基因型为GG的样本扩增结果；

图6.GC-rs2282679位点基因型为TG的样本扩增结果；

图7.VDR-rs2228570位点基因型为AA的样本扩增结果；

图8.VDR-rs2228570位点基因型为GG的样本扩增结果；

图9.VDR-rs2228570位点基因型为AG的样本扩增结果；

图10.CYP2R1-rs10741657位点基因型为GG纯合型，GC-rs2282679位点基因型为TG杂合型，VDR-rs2228570基因型为AG杂合型的样本扩增结果。

具体实施方式

在这里专用的词“实施例”，作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。本申请实施例中性能指标测试，除非特别说明，采用本领域常规试验方法。应理解，本申请中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本申请公开的内容。

除非另有说明，否则本文使用的技术和科学术语具有本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义；作为本申请中其它未特别注明的试验方法和技术手段均指本领域内普通技术人员通常采用的实验方法和技术手段。

本文所用的术语“基本”和“大约”用于描述小的波动。例如，它们可以是指小于或等于±5％，如小于或等于±2％，如小于或等于±1％，如小于或等于±0.5％，如小于或等于±0.2％，如小于或等于±0.1％，如小于或等于±0.05％。在本文中以范围格式表示或呈现的数值数据，仅为方便和简要起见使用，因此应灵活解释为不仅包括作为该范围的界限明确列举的数值，还包括该范围内包含的所有独立的数值或子范围。例如，“1～5％”的数值范围应被解释为不仅包括1％至5％的明确列举的值，还包括在所示范围内的独立值和子范围。因此，在这一数值范围中包括独立值，如2％、3.5％和4％，和子范围，如1％～3％、2％～4％和3％～5％等。这一原理同样适用于仅列举一个数值的范围。此外，无论该范围的宽度或所述特征如何，这样的解释都适用。本文中，正向引物用“F”表示，又称为上游引物，反向引物用“R”表示，又称为下游引物。

在本文中，包括权利要求书中，连接词，如“包含”、“包括”、“带有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“容纳”等被理解为是开放性的，即是指“包括但不限于”。只有连接词“由……构成”和“由……组成”是封闭连接词。

为了更好的说明本申请内容，在下文的具体实施例中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本申请同样可以实施。在实施例中，对于本领域技术人员熟知的一些方法、手段、仪器、设备等未作详细描述，以便凸显本申请的主旨。

在不冲突的前提下，本申请实施例公开的技术特征可以任意组合，得到的技术方案属于本申请实施例公开的内容。

一些实施方式中，用于维生素D和钙代谢相关基因分型的扩增引物组及探针，包括：CYP2R1-rs10741657位点的ARMS引物组及探针、GC-rs2282679位点的ARMS引物组及探针以及VDR-rs2228570位点的ARMS引物组及探针；其中，

CYP2R1-rs10741657位点的ARMS引物组及探针包括：

CYP2R1-rs10741657野生型正向引物，其序列如SEQ ID NO：01所示；

CYP2R1-rs10741657突变型正向引物，其序列如SEQ ID NO：02所示；

CYP2R1-rs10741657共用反向引物，其序列如SEQ ID NO：03所示；

CYP2R1-rs10741657共用探针，其序列如SEQ ID NO：04所示；

GC-rs2282679位点的ARMS引物组及探针包括：

GC-rs2282679野生型正向引物，其序列如SEQ ID NO：05所示；

GC-rs2282679突变型正向引物，其序列如SEQ ID NO：06所示；

GC-rs2282679共用反向引物，其序列如SEQ ID NO：07所示；

GC-rs2282679共用探针，其序列如SEQ ID NO：08所示；

VDR-rs2228570位点的ARMS引物组及探针包括：

VDR-rs2228570野生型正向引物，其序列如SEQ ID NO：09所示；

VDR-rs2228570突变型正向引物，其序列如SEQ ID NO：10所示；

VDR-rs2228570共用反向引物，其序列如SEQ ID NO：11所示；

VDR-rs2228570共用探针，其序列如SEQ ID NO：12所示。

基于突变扩增阻滞系统(Amplification Refractory Mutation System，ARMS)，发明人基于错配碱基的替换原则进行ARMS引物设计，在使用一般耐热DNA聚合酶(缺乏外切校正活性)的条件下PCR引物3’末端错配导致产物急剧减少，根据已知的突变位点设计相应的ARMS引物，其3’端碱基分别与野生型和突变型的模板碱基互补，分别对待测样本进行荧光PCR并监测扩增曲线可以直接达到区别野生型和突变型基因的目的。

发明人基于等位基因特异性扩增法设计得到的突变型和野生型引物，提高了扩增的特异性；而且灵敏度高，最低仅需10ng DNA模板量即可完成对人DNA样本的分型；检测用时短，1h内即可完成对待测样本的分型；成本较低，所使用的试剂耗材在临床上较为常用，成本较低，便于临床的推广。

一些实施方式中，用于维生素D和钙代谢相关基因分型的试剂盒，包括用于维生素D和钙代谢相关基因分型的扩增引物组及探针。

进一步，用于维生素D和钙代谢相关基因分型的试剂盒，还包括PCR扩增试剂。

一些实施例公开的用于维生素D和钙代谢相关基因分型的试剂盒，包括扩增引物组、探针和PCR扩增试剂的扩增反应体系配置为：

一些实施方式中，维生素D和钙代谢相关基因的分型方法，包括：利用扩增引物及探针对待测样本的维生素D和钙代谢相关基因进行扩增。

进一步，一些实施例公开的维生素D和钙代谢相关基因的分型方法，包括：利用CYP2R1-rs10741657位点的ARMS引物组及探针、GC-rs2282679位点的ARMS引物组及探针以及VDR-rs2228570位点的ARMS引物组及探针对待测样本的维生素D和钙代谢相关基因分别进行扩增。

一些实施例公开的维生素D和钙代谢相关基因的分型方法，包括利用用于维生素D和钙代谢相关基因分型的试剂盒对待测样本的维生素D和钙代谢相关基因进行扩增。

一些实施例公开的维生素D和钙代谢相关基因的分型方法，利用试剂盒中的CYP2R1-rs10741657位点的ARMS引物组及探针、GC-rs2282679位点的ARMS引物组及探针以及VDR-rs2228570位点的ARMS引物组及探针对待测样本的维生素D和钙代谢相关基因分别进行扩增。

一般地，用于维生素D及钙代谢相关基因分型的试剂盒包括扩增引物组及探针，以及与扩增引物组配套使用的扩增试剂，扩增引物组及探针和扩增试剂组成扩增反应体系，进行扩增反应。

作为可选实施例，扩增反应体系的配置如表1所列。

表1扩增反应体系配置

一般地，配置扩增体系分为野生型反应体系和突变型反应体系两个独立的扩增反应体系，表1中的扩增反应体系统一适用于野生型反应体系和/或突变型反应体系；

例如，对于野生型反应体系，2×Taq Pro HS U Probe Master Mix包括PCRbuffer、dNTP、热稳定性Taq聚合酶；Primer Forward Mix是指包括CYP2R1-rs10741657、GC-rs2282679以及VDR-rs2228570三个基因位点的上游引物混合物；Primer Reverse Mix是指包括CYP2R1-rs10741657、GC-rs2282679以及VDR-rs2228570三个基因位点各自共有的下游引物混合物；Probe Mix是指CYP2R1-rs10741657、GC-rs2282679以及VDR-rs2228570三个基因位点共用荧光探针的混合物；

对于突变型反应体系，2×Taq Pro HS U Probe Master Mix包括PCR buffer、dNTP、热稳定性Taq聚合酶；Primer Forward Mix是指包括CYP2R1-rs10741657、GC-rs2282679以及VDR-rs2228570三个基因位点的突变型上游引物混合物；Primer ReverseMix是指包括CYP2R1-rs10741657、GC-rs2282679以及VDR-rs2228570三个基因位点各自共有的下游引物混合物；Probe Mix是指CYP2R1-rs10741657、GC-rs2282679以及VDR-rs2228570三个位点共用荧光探针的混合物。

为了验证设计的扩增引物组及探针的基因分型效果，进行如下试验：

(1)样品处理和核酸提取

使用商业化的DNA提取试剂盒提取待测样本DNA，并使用分光光度计对提取的DNA进行浓度和纯度测定，其中，当待测样本的OD260/OD280为1.8～2.0即为合格样品，方可进行后续实验。

(2)配置扩增反应体系

在两个扩增管中，分别配置野生型扩增反应体系和突变型扩增反应体系，配置体系参考本文表1，使用的引物及探针为CYP2R1-rs10741657位点的ARMS引物组及探针、GC-rs2282679位点的ARMS引物组及探针以及VDR-rs2228570位点的ARMS引物组及探针；其中，

CYP2R1-rs10741657位点的ARMS引物组及探针包括：CYP2R1-rs10741657野生型正向引物CYP2R1_F1，CYP2R1-rs10741657突变型正向引物CYP2R1_F2，CYP2R1-rs10741657共用反向引物CYP2R1_R，CYP2R1-rs10741657共用探针CYP2R1_P，其序列及序列号如表2所示；

GC-rs2282679位点的ARMS引物组及探针包括：GC-rs2282679野生型正向引物GC_F1，GC-rs2282679突变型正向引物GC_F2，GC-rs2282679共用反向引物GC_R，GC-rs2282679共用探针GC_P，其序列及序列号如表2所示；

VDR-rs2228570位点的ARMS引物组及探针包括：VDR-rs2228570野生型正向引物VDR_F1，VDR-rs2228570突变型正向引物VDR_F2，VDR-rs2228570共用反向引物VDR_R，VDR-rs2228570共用探针VDR_P，其序列及序列号如表2所列。

表2扩增引物组及其序列列表

(3)进行扩增反应

使用qPCR仪ABI 7500对配置好的野生型扩增反应体系和突变型扩增反应体系分别进行扩增，并采集荧光信号；荧光检测通道分别为VIC、CY5和ROX，其中，VIC荧光反映CYP2R1-rs10741657位点扩增情况，CY5荧光反映GC-rs2282679位点扩增情况，ROX荧光反映VDR-rs2228570位点扩增情况；

扩增反应程序设置如表3所列；

表3 qPCR反应程序设定

(4)实验结果

依照上述扩增试验方法对多个待测样本进行扩增试验，以下列出多个待测样本的实验结果，并结合附图对实验结果进行说明；

图1所示的样本中，CYP2R1-rs10741657野生型反应体系中VIC通道正常扩增，而CYP2R1-rs10741657突变型反应体系中VIC通道无扩增，表明该样本基因型为AA纯合型。

图2所示的样本中，CYP2R1-rs10741657突变型反应体系中VIC通道正常扩增，而CYP2R1-rs10741657野生型反应体系中VIC通道无扩增，表明该样本基因型为GG纯合型；

图3所示的样本中，CYP2R1-rs10741657突变型和野生型反应体系中VIC通道均正常扩增，表明该样本基因型为AG杂合型；

如图4所示的样本中，GC-rs2282679野生型反应体系中CY5通道正常扩增，而GC-rs2282679突变型反应体系中CY5通道无扩增，表明该样本基因型为TT纯合型；

如图5所示的样本中，GC-rs2282679突变型反应体系中CY5通道正常扩增，而GC-rs2282679野生型反应体系中CY5通道无扩增，表明该样本基因型为GG纯合型；

如图6所示的样本中，GC-rs2282679突变型和野生型反应体系中CY5通道均正常扩增，表明该样本基因型为TG杂合型；

如图7所示的该样本中，VDR-rs2228570野生型反应体系中ROX通道正常扩增，而VDR-rs2228570突变型反应体系中ROX通道无扩增，表明该样本基因型为AA纯合型；

如图8所示的样本中，VDR-rs2228570突变型反应体系中ROX通道正常扩增，而VDR-rs2228570野生型反应体系中ROX通道无扩增，表明该样本基因型为GG纯合型；

如图9所示的样本中VDR-rs2228570突变型和野生型反应体系中ROX通道均正常扩增，表明该样本基因型为AG杂合型；

如图10所示的样本中，CYP2R1-rs10741657突变型反应体系中VIC通道正常扩增，而CYP2R1-rs10741657野生型反应体系中VIC通道无扩增，表明该样本rs10741657位点基因型为GG纯合型；GC-rs2282679突变型和野生型反应体系中CY5通道均正常扩增，表明该样本GC-rs2282679位点基因型为TG杂合型；VDR-rs2228570突变型和野生型反应体系中ROX通道均正常扩增，表明该样本位点VDR-rs2228570基因型为AG杂合型。

从样本库中随机选取20个临床样本，分别使用ARMS-PCR方法和一代测序的方法对20个临床样本的CYP2R1-rs10741657基因位点、GC-rs2282679基因位点和VDR-rs2228570基因位点进行分型。

操作步骤：

(1)随机选取20份临床样本，使用商业化的DNA试剂盒提取待测样本DNA，并测定其浓度和纯度；其中，当待测样本的OD260/OD280为1.8～2.0即为合格样品，方可进行后续实验；

(2)配置ARMS扩增反应体系

参照表1配置扩增反应体系，分别加入待测样本DNA、引物、荧光探针、PCR buffer、dNTP和热稳定Taq酶等；本实施例中的引物是指本申请实施例公开的CYP2R1-rs10741657位点的ARMS引物组及探针、GC-rs2282679位点的ARMS引物组及探针以及VDR-rs2228570位点的ARMS引物组及探针，其序列为表2所列；

(3)进行PCR扩增反应

按照表3所列的qPCR反应程序设定，使用qPCR仪ABI 7500对其进行扩增并采集荧光信号；检测通道分别为VIC、CY5和ROX，其中，VIC荧光反映CYP2R1-rs10741657位点扩增情况，CY5荧光反映GC-rs2282679位点扩增情况，ROX荧光反映VDR-rs2228570位点扩增情况；

(4)根据PCR反应后的荧光信号判断所测临床样本的基因型；

(5)使用一代测序的方法对选取的20份临床样本进行测序分型，并与ARMS-PCR分型结果进行比较。

结果如表4所示，发现ARMS-PCR和一代测序结果一致性达到100％，这也验证了本方法的准确度。

表4临床样本的ARMS-PCR和一代测序分型结果对照表

一些实施例公开的维生素D和钙代谢相关基因的分型方法，包括采用试剂盒对待测样本进行扩增，具体包括：

(1)样本处理，提取待测样本DNA；

(2)利用试剂盒中的用于维生素D和钙代谢相关基因分型的扩增引物组及探针配置ARMS扩增反应体系，扩增引物组及探针序列如表2所列，扩增反应体系如表1所列；

(3)进行PCR扩增反应，并检测荧光信号；

(4)根据扩增反应的荧光信号判断待测样本的基因型。

一些实施例公开的维生素D和钙代谢相关基因的分型方法，包括利用用于维生素D和钙代谢相关基因的扩增引物组和探针对待测样本的基因分别进行扩增，具体包括：

(1)样本处理，提取待测样本DNA；

(2)用于维生素D和钙代谢相关基因的扩增引物组和探针配置ARMS扩增反应体系，扩增引物组及探针序列如表2所列，扩增反应体系如表1所列；

(3)进行PCR扩增反应，并检测荧光信号；

(4)根据扩增反应的荧光信号判断待测样本的基因型。

本发明实施例公开的用于维生素D和钙代谢相关基因分型的扩增引物组及探针、试剂盒、分型方法，能够对CYP2R1-rs10741657、GC-rs2282679以及VDR-rs2228570三个基因位点多态性进行准确检测分析，较为全面的包含了与维生素D和钙代谢相关的基因位点，扩增引物组和探针具有良好的扩增特异性，检测灵敏度高、检测时间短，检测成本低，操作方法简便，有利于在本领域进行推广。

本申请公开的技术方案和实施例中公开的技术细节，仅是示例性说明本申请的发明构思，并不构成对本申请技术方案的限定，凡是对本申请公开的技术细节所做的常规改变、替换或组合等，都与本申请具有相同的发明构思，都在本申请权利要求的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 郑州大学

河南申友医学检验所有限公司

<120> 用于维生素D和钙代谢相关基因分型的扩增引物组及探针、试剂盒、分型方

法

<130> 20220415

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gggagatact ttagcacgca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gggagatact ttagcagtcg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctgtcagccc tggaagactc 20

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgacattgga gctgagatca actgcta 27

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctaacaataa aaaatacctg gctt 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctaataataa aaaatacctg gctg 24

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggagctggga ctacagttgc 20

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<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

taagagacag agatttgctg ggcatg 26

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cttgctgttc ttacaggaat 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cttgctgttc ttacaggaac 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cccttcatgg aaacaccttg 20

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aggtcatagc attgaagtga aagccag 27