替罗非班在用于制备治疗人呼吸道合胞病毒感染的药物中的应用

技术领域

本发明涉及抗病毒感染的技术领域，具体而言，涉及替罗非班在用于制备治疗人呼吸道合胞病毒感染的药物中的应用。

背景技术

正常血管内皮下存在黏附血小板糖蛋白(Glycoprotein,GP)，完整的内皮系统将GP与循环系统中的血小板分隔开来，血小板膜上的 GP不仅对维持血小板的形态及完整性十分重要，并且构成了血小板的各种受体，使血小板发挥止血及有关功能。在纤维蛋白原、纤维黏连蛋白、血管性血友病因子、ADP、胶原和凝血酶等激活血小板后导致血小板聚集的过程中，血小板GPⅡb/Ⅲa是上述激活通路的最后共同效应蛋白，最后导致血小板交联及血小板聚集。

替罗非班(Tirofiban)是以脒基或苯脒基替换精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列中的精氨酸。替罗非班克服了RGD肽稳定性差、半衰期短的缺点，是一种高度特异性GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂 (Glycoprotein Inhibitor，GPI)。替罗非班通过与GPⅡb/Ⅲa受体可逆性结合，阻止了纤维蛋白原与GPⅡb/Ⅲa结合，从而阻断了血小板交联及血小板聚集，具有强效抗血小板作用。

同时，有报道发现替罗非班具有较好的抗炎作用。如替罗非班可明显抑制急性心肌梗死患者C反应蛋白(CRP)升高的水平，降低炎性反应、削弱趋化因子的作用和黏附分子的表达(Ercan E，2004)。除了CRP，替罗非班还可降低急性冠脉综合征患者血清丙二醇、IL-6、可溶性细胞间黏附因子(sICAM-1)和可溶性血管细胞黏附因子 (sVCAM-1)水平(Eki A，2007)，提示替罗非班对急性冠脉综合征患者炎性反应过度、氧化应激反应异常和血管内皮功能障碍有一定的调节作用。有研究表明，替罗非班可明显减轻稳定性心绞痛高危人群sCD40L的上升幅度(Azar RR，2005)。sCD40L是由CD40L水解释放而成，来自激活的淋巴细胞和活化的血小板细胞，是炎性反应和促凝机制的共同标记物质。循环中sCD40L95％以上来自于血小板，可间接反映血小板、CD40-CD40L系统的激活程度。TNF受体(TNFR) 家族是一组反映炎性反应严重程度的因子，其典型代表即为CD40L。

目前，未检索到替罗非班抗人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory SyncytialVirus,HRSV)的任何报道。HRSV是引起儿童病毒性肺炎的最重要病原，对长者下呼吸道感染亦为重要病原体之一，该病毒感染引起的重症肺炎每年可致数十万儿童或长者死亡，迄今却未有疫苗上市。

在目前的呼吸道病毒感染中，以SARS-CoV-2感染导致的重症冠状病毒病2019(Coronavirus disease 2019,COVID-19)已被确认能够通过与宿主细胞膜受体ACE2结合而感染导致显著血小板聚集，进而引起血栓形成和炎症反应，增高患者死亡率，并有明确病案报道对 42例重症COVID-19并发脓毒症诱导的凝血病患者使用低分子量肝素后可显著降低28天内死亡率(Tang N，2020)，同时我国报道对2例COVID-19并发急性缺血性脑卒中患者使用替罗非班、氯吡格雷和肝素后可显著改善脑部小血管血栓栓塞(Fu B，2021)。此外，在意大利米兰Sacco大学医院开展的单中心临床2b期实验中同样发现对5例重症COVID-19患者使用替罗非班、氯吡格雷和肝素后可显著改善患者血氧饱和度，4例患者在治疗7日后均不再使用呼吸机治疗并先后康复，而对照组5例患者仅以肝素治疗后3例死亡(Viecca M,2020)。替罗非班和氯吡格雷分别通过特异性抑制GPⅡb/Ⅲa变构和ADP与血小板膜受体结合而发挥抗血小板聚集作用，肝素主要通过激活抗凝血酶Ⅲ，增强对凝血酶的抑制作用而抗凝。因此，一系列临床证据证实血栓形成是重症病毒性肺炎致病的关键因素，对于目标人群适时干预血小板聚集和血栓形成将可能逆转其对患者生命的巨大威胁。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种替罗非班在用于制备治疗人呼吸道合胞病毒感染的药物中的应用。

本发明是这样实现的：

一种替罗非班在用于制备治疗人呼吸道合胞病毒感染的药物中的应用。

发明人发现，替罗非班对于人呼吸道合胞病毒(HRSV)感染具有良好的治疗效果，通过小鼠肺部病理切片实验可知，替罗非班治疗组小鼠一般状态良好，背毛光滑、精神活跃、采食量正常，无呼吸急促和呼吸困难症状，体重自第3日即开始回升，且小鼠存活率极显著高于非治疗组。免疫荧光染色结果显示，替罗非班治疗组的病毒感染程度低于非治疗组，且替罗非班治疗组的病毒血小板数量明显低于非治疗组。这些结果均表明，替罗非班具有良好的体内抗人呼吸道合胞病毒效果。发明人还发现，替罗非班抗感染的机制可能通过抑制炎症的方式进行。

行之有效的人呼吸道合胞病毒疫苗仍在研发中且机体具有不同的免疫属性，本发明的提出，从人呼吸道合胞感染后血小板与中性粒细胞交互作用这一病理生理学出发，通过抗血小板治疗从而抑制炎症反应，由此达到抗病毒保护机体的作用，为临床上治疗人呼吸道合胞病毒感染提供了有利的药物支持，丰富了临床药物干预人呼吸道合胞病毒感染的药物类型，拓宽了替罗非班抗病毒的种类。此外，由于替罗非班作为一种临床用药已具备良好的安全有效性，因此，发明人将其用于治疗人呼吸道合胞病毒感染具有良好的安全用药基础。本发明的提出为具有抗血栓能力的药物进一步开发为抗感染药物奠定了基础。

在本发明应用较佳的实施方式中，人呼吸道合胞病毒感染的对象为婴儿、儿童、成人、免疫抑制病人或接受器官移植患者。成人尤指老年人(65岁以上)。

替罗非班在制备由人呼吸道合胞病毒引起的毛细支气管炎的药物中的应用。

替罗非班在制备由人呼吸道合胞病毒引起的肺炎的药物中的应用。

肺炎征象包括不限于：轻度病毒性肺炎、中度病毒性肺炎、重度病毒性肺炎，例如重症病毒性肺炎征象：肺小血管和支气管周围见大量炎性细胞浸润，大部分肺泡结构破坏，大量红细胞自小血管渗漏至肺泡腔和肺间质，于肺间质见广泛血栓形成。

在一种可选的实施方式中，上述肺炎为病毒性肺炎、细菌性肺炎、真菌性肺炎或支原体肺炎。

肺炎为急性病毒性肺炎、急性细菌性肺炎、急性真菌性肺炎或急性支原体肺炎。

例如，急性病毒性肺炎包括由甲型流感病毒、乙型流感病毒、禽流感病毒、SARS病毒、MERS病毒、寨卡病毒、埃博拉病毒和 SARS-CoV-2病毒中一种或多种引起的急性渗出性肺炎。

急性真菌性肺炎包括由隐球菌、曲霉菌、毛霉菌和念珠菌中一种或多种引起的急性渗出性肺炎。

急性细菌性肺炎包括由肺炎链球菌、金葡菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌、军团菌和铜绿假单胞菌中一种或多种病原体引起的急性渗出性肺炎。

替罗非班在制备由人呼吸道合胞病毒引起的中耳炎的药物中的应用。

替罗非班和联用药物在制备用于治疗人呼吸道合胞病毒感染的药物中的应用，联用药物选自抗血栓的药物。

在本发明应用较佳的实施方式中，抗血栓的药物选自：肝素、阿司匹林、氯吡格雷、依替巴肽、血塞通和银杏叶片中的至少一种。

在本发明应用较佳的实施方式中，药物的剂型为散剂、丸剂、片剂、胶囊剂、口服液、气雾剂或注射剂。

本发明具有以下有益效果：

发明人发现，替罗非班对于人呼吸道合胞病毒感染具有良好的治疗效果，通过小鼠肺部病理切片实验可知，替罗非班治疗组小鼠一般状态良好，背毛光滑、精神活跃、采食量正常，无呼吸急促和呼吸困难症状，体重自第3日即开始回升，且小鼠存活率极显著高于非治疗组。免疫荧光染色结果显示，替罗非班治疗组的病毒感染程度低于非治疗组，且替罗非班治疗组的病毒血小板数量明显低于非治疗组。这些结果均表明，替罗非班具有良好的体内抗人呼吸道合胞病毒效果。发明人还发现，替罗非班抗感染的机制可能通过抑制炎症的方式进行。

本发明的提出，为临床上治疗人呼吸道合胞病毒感染提供了有利的药物支持，丰富了临床药物干预人呼吸道合胞病毒感染的药物类型，拓宽了替罗非班抗病毒的种类。此外，由于替罗非班作为临床用药的一种已经具备良好的安全有效性，因此，发明人将其用于治疗人呼吸道合胞病毒感染具有良好的安全用药基础。本发明的提出为具有抗血栓能力的药物进一步开发为抗感染药物奠定了基础。本发明填补了治疗人呼吸道合胞病毒的药物、特别是儿科药物的空白，具有重大的社会价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为HRSV高毒株感染后替罗非班治疗组和HRSV高毒株感染组体重变化(A)和存活率(B)统计结果图；

图2为HRSV高毒株感染后替罗非班治疗组、HRSV高毒株感染组和对照小鼠全肺或局部肺病理切片H&E染色图片；

图3为R96-5感染组(A&B)和空白对照组(C)小鼠局部肺病理切片H&E染色图片；

图4为HRSV高毒株感染后替罗非班治疗组和HRSV高毒株感染组全肺(A&F)或局部肺(B-E&G-J)免疫荧光图片。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学 (包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成 (OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养 (Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和 C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene TransferVectors for Mammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(Current Protocols in Molecular Biology)》 (F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

体内抗病毒实验：以贵州医科大学基础医学院病原生物学实验室保存之HRSV高毒株R96-5攻毒小鼠3次，每次攻毒剂量为1x 10

在感染后21d的观察期内，我们发现替罗非班治疗组小鼠一般状态良好，背毛光滑、精神活跃、采食量正常，无呼吸急促和呼吸困难，体重自第3日即开始回升，至观察终点已完全恢复正常(图1中A)，感染后第10日死亡小鼠1只，存活率为90％(共10只小鼠)；而HRSV 高毒株感染组在21d的观察期内小鼠一般状态不佳，背毛皱缩、精神萎靡、采食量下降，且随观察时间延长，小鼠的呼吸急促和呼吸困难渐次出现并加重，感染后体重出现持续下降，自第11日才开始回升，感染后第2日至第14日间均观察到小鼠死亡，存活率仅为20％，显著低于替罗非班治疗组(图1中B，p<0.001)。

本实施例结果表明替罗非班具有良好的抗HRSV感染效果。

图1中，Tirofiban：替罗非班；R96-5：HRSV高毒株；***：p< 0.001；每组n＝10；实验独立重复2次。

实施例2

在实施例1的体内抗病毒实验中，不同时间点下采集鼠肺进行病理切片，H&E染色。

鼠肺病理切片，H&E染色结果参照图2所示，结果提示替罗非班治疗组局部肺组织出现轻中度病毒性肺炎征象，肺小血管和支气管周围可见炎性细胞浸润，但大部分肺泡结构完整，未见红细胞渗漏和血栓形成。但HRSV感染组现重症病毒性肺炎征象，肺小血管和支气管周围见大量炎性细胞浸润，大部分肺泡结构破坏，大量红细胞自小血管渗漏至肺泡腔和肺间质，于肺间质见广泛血栓形成。图2中 Tirofiban：替罗非班；R96-5：HRSV高毒株；Mock：对照；比例尺为2000μm或100μm。

图3中A&B可见HRSV高毒株R96-5攻毒小鼠肺部显著病变情况，大部分肺泡融合破坏，肺间质增厚水肿，大量炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主，此外有大量血栓形成于各级肺血管，红细胞渗漏情况明显，说明HRSV高毒株感染能导致显著的肺血管内皮细胞受损，红细胞血小板等渗漏到肺泡腔。

本实施例结果表明，替罗非班可以避免重症病毒性肺炎的发生，使用替罗非班治疗后，肺泡结构完整，未见红细胞渗漏和血栓形成，具有良好的治疗效果。

图3中A：黑色箭头示肺间质可见广泛的血栓形成；B：黑色箭头示肺间质和肺泡内大量红细胞漏出；比例尺为100μm。

实施例3

在实施例1的体内抗病毒实验中，不同时间点下采集鼠肺进行免疫荧光染色实验。

HRSV F蛋白表达量多少表示病毒感染程度高低，而CD42b蛋白为巨核细胞和血小板细胞特异性膜蛋白，其表达量多少与表达位置分别表示血小板数量多少与血小板位置，图4中B与图4中G结果说明替罗非班治疗组病毒感染程度低于HRSV高毒株R96-5攻毒组，图4中C与图4中H结果说明替罗非班治疗组病毒血小板数量低于 R96-5攻毒组，且HRSV高毒株攻毒组小鼠血小板分布于肺泡样组织，结合图3中B结果，提示HRSV高毒株攻毒组小鼠肺血管内皮细胞受损，红细胞、血小板渗漏至肺泡腔，同时可见HRSV F蛋白与CD42b 蛋白共表达，提示替罗非班抗感染的机制可能通过抑制炎症展开。

图4中，Tirofiban：替罗非班；R96-5：HRSV高毒株；HRSV F：红色荧光；CD42b：粉色荧光；DAPI：蓝色荧光；比例尺为100μm或 2,000μm。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。