一种与青鱼生长相关QTL紧密连锁的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于水产动物遗传育种领域，具体涉及一种与青鱼生长相关QTL紧密连锁的分子标记及其应用。

背景技术

青鱼(Mylopharyngodon piceus)又称黑鲩，是我国四大家鱼之一，也是我国重要淡水养殖鱼类，自然分布于东亚的大中型江河水系中，其分布区为北起黑龙江、南至珠江，同时是我国重要的淡水养殖鱼类。据中国渔业年鉴统计，2020年我国青鱼产量达69.45万吨，相比2019年产量增长了2.20％。由于在青鱼生产过程中不注重种质资源管理和养殖环境的不断恶化，使得青鱼的种质资源开始逐渐减少，造成生长缓慢、抗逆能力下降等诸多现象，不利于青鱼养殖业的可持续发展，而传统选育方法是通过对表型性状的筛选达到选育目的，存在费时费力、性状不稳定等缺点，因此充分发掘青鱼自身的遗传因素，利用遗传学方法实现青鱼高效、稳定的良种选育根本途径。

青鱼的生长性状是复杂的数量性状，容易受环境的影响。一般来说，优良的生长性状能缩短养殖时间，同时能收获更高的效益。现有技术中，根据家系或个体表型和谱系信息选择具有优良生长性状的个体作为亲本，可以提高生长性能，但这种方法存在选育周期长、效率低等问题。而分子标记辅助育种速度快、准确可靠、特异性强等优点，且不受生长发育阶段和环境的影响，可以加快青鱼种质资源的选育进程，该技术的前提是获得与目标性状基因紧密连锁的分子标记，通过对比不同基因型表型性状差异从而找到优势基因型表型个体，实现选育的目的。

QTL定位是分离与目标性状紧密连锁分子标记的重要步骤，单核苷酸多态性(SNP)在基因组水平上由单个核苷酸的转换、颠换、由碱基的插入或缺失所引起的DNA序列多态性，其技术是通过与已知序列信息比对来找到SNP位点，再利用发掘的变异位点设计特异性引物来对基因组DNA进行PCR扩增，得到基于该SNP位点的特定的多态性产物，最后利用凝胶电泳分析产物的多态性，具有密度高、遗传稳定、富有代表性和易实现分析的自动化等优点。目前尚没有关于青鱼生长相关QTL紧密连锁的分子标记开发和应用的相关报道。

发明内容

针对现有技术中通过选择具有优良性状(如生长性状和抗病性)的家系或个体作为优良亲本自交或杂交建立家系或群体的青鱼传统育种方法耗时且通常是劳动密集型，以及选择由多个基因所决定的质量性状(例如生长、抗病性和耐盐性)时相对缓慢或不稳定的问题，本发明的主要目的是提供一种与青鱼生长相关QTL紧密连锁的分子标记。

本发明的另一目的是提供上述青鱼生长相关QTL紧密连锁的分子标记在青鱼标记辅助育种中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种与青鱼生长相关QTL紧密连锁的分子标记，包括分子标记snp8107和snp9562，其中：分子标记snp8107具有长度为437bp且核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的靶序列，在第163位核苷酸存在一个A/G SNP位点；分子标记snp9562具有长度为274bp且核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的靶序列，在第172位核苷酸存在一个G/A SNP位点。

作为优选，所述分子标记snp8107的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物序列如SEQ ID NO:4所示；所述分子标记snp9562的上游引物序列如SEQ ID NO:5所示，下游引物序列如SEQ ID NO:6所示。

本发明提供上述与青鱼生长相关QTL紧密连锁的分子标记的筛选方法，包括以下步骤：

(1)选择正常生长且无畸形的雌雄青鱼作为健康的青鱼亲本，通过注射激素催熟人工受精的方法构建青鱼群体；

(2)对上述青鱼群体包含体重、体长、体宽和体高的表型性状进行测量，并在青鱼尾部剪取8-12cm

(3)采用JionMap和MapQTL两个软件进行QTL定位，前者计算各个标记的位置信息，后者计算与体质量相关的QTL区间，在效应最高的QTL区间内得到与青鱼体质量相关的分子标记，即得。

作为优选，步骤(1)中，采用的激素为绒毛膜促性腺激素类似物LRH-A和地欧酮DOM的混合物。

作为优选，步骤(2)中，青鱼群体的体重采用精确到0.1g的电子天平测量，体长、体宽和体高采用精确到0.1cm的直尺测量。

本发明还提供上述与青鱼生长相关QTL紧密连锁的分子标记在辅助检测青鱼体质量性状中的应用。

本发明还提供上述与青鱼生长相关QTL紧密连锁的分子标记在青鱼标记辅助育种中的应用。

本发明还提供一种根据所述与青鱼生长相关QTL紧密连锁的分子标记筛选青鱼品种的方法，包括以下步骤：

(a)采集待测青鱼的鳍条组织，即在青鱼尾部剪取8-12cm

(b)以待测青鱼的基因组DNA为模板，采用如SEQ ID NO:3-6所示的引物对分别进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(c)对上述PCR扩增产物用一代Sanger测序后，用Senquencher软件观察测序峰图进行SNP分型，得到与青鱼体质量相关的基因型；

(d)结合青鱼包含体重、体长、体宽和体高的表型形状数据与上述与青鱼体质量相关的基因型结合进行多重比较，得到与青鱼体质量相关的优势基因型，由此选择青鱼品种。

作为优选，步骤(a)中，采用天根海洋生物组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA。

作为优选，步骤(b)中，PCR扩增的反应体系为25μL反应体系，为12.5μL的2×TaqPCR Master Mix、8.5μL的ddH

作为优选，步骤(d)中，与邗江青鱼体质量相关的优势基因型为由snp8107的AA和snp9562的GA组成的二倍型，与湘江青鱼体质量相关的优势基因型为由snp8107的AG和snp9562的AA组成的二倍型。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明中筛选并鉴定出与青鱼生长相关QTL紧密连锁的分子标记snp8107和snp9562，基于此可以筛选具有优势基因型的青鱼个体，具有简便、高效、准确和特异性较高的优势，用于青鱼的标记辅助育种选育具有良好性状的青鱼品种，可以大大节约养殖成本，提高育种效率。

附图说明

图1是实施例中分子标记snp8107和snp9562测序分型后不同基因型的测序峰图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例筛选与青鱼生长相关QTL紧密连锁的分子标记及引物设计，具体步骤如下：

(1)准备亲本：采用的青鱼来自于邗江野生群体，从中选择生长性状优良的雌雄个体作为亲本，孵化后先在流水养殖桶(1.5m

(2)生长数据测量：孵化后养殖到10个月时，测量384个子代个体的体重、体长、体宽和体高四个生长数据，电子天平用于体质量性状的测量(精确至0.1g)，标准直尺测量形态性状(精确至0.1cm)。

(3)主效SNP筛选：从384个个体中选择体重具有极端值的128个个体用于后续体质量SNP开发。先用试剂盒(天根海洋生物组织DNA提取试剂盒)提取青鱼总DNA，将DNA送至诺禾致源生物公司进行简化基因组测序，用软件BWA(v0.7.17)将测序得到的原始数据与基因组比对，再用软件Stacks(v2.54)进行SNP开发和基因分型，利用VCFtools(v0.1.15)以缺失数据<20％、测序深度＞5×为过滤标准，过滤未达到标准的SNP，最终仅保留MAF(次要等位基因频率)＞10％的SNP。使用软件JoinMap4.0来构建遗传连锁图谱，先将最终保留的标记被重新编码为“CP”种群类型下的JoinMap格式，标记类型分：1:1(lm×ll或nn×np)、1:2:1(hk×hk)两种模式。利用χ2检验，排除在χ2拟合优度检验中显示显著分离失真且p<0.01的SNP，将剩余的标记分配到连锁群(LG)，并使用CP算法在对数优势比(LOD)阈值为10.0的条件下构建图谱，使用回归映射算法和Kosambi函数来确定沿单个连锁群的标记顺序和标记间的遗传距离，重组率参数设置为0.40。利用软件MapQTL6的多QTL模型映射(MQM)的方法，以每个性状1000次排列检验(t检验)确定LOD值，置信区间为95％，LOD值超过全染色体LOD阈值的QTL被认为与生长性状相关。利用基因型数据构建遗传连锁图谱进行QTL定位，最终获得一个与体重相关的主效QTL，位于17号连锁群5.446-7.492cM位置。这一段QTL区间内包含五个SNP分子标记，其中snp8107和snp9562是LOD值与PVE值较高的两个标记，LOD值分别为3.83和3.21，PVE分别为12.9％和10.9％。

(4)包含分子标记的片段引物设计：利用snp8107和snp9562的ID找到SNP详细信息，包括其在基因组中的遗传距离、LOD值和PVE值，用于后续序列提取。首先利用软件BWA(v0.7.17)构建青鱼参考基因组索引，再通过bedtools提取出包含SNP的侧翼序列。利用得到的序列，在软件Primer Premier5中进行引物设计，要求扩增出的片段包含有SNP位点。

实施例2

本实施例根据与青鱼生长相关QTL紧密连锁的分子标记筛选青鱼品种，步骤如下：

(1)采用邗江水系青鱼构建青鱼群体，选取生长性状优良的雌雄个体作为亲本进行人工授精，将受精卵在孵化桶培育至水花后放入池塘，进行培养。孵化后养殖到10个月时，随机选取288尾青鱼进行体质量和体长性状的测量，并植入PIT电子标记，随后剪去小块尾鳍组织置于装有无水乙醇的96孔板中并保存于-20℃冰箱中保存备用。

(2)从基因组中分别提取分子标记左右300bp序列用于引物构建，其中S为正向，A为反向，具体为：snp8107引物序列：S：5’TGGTCTGCTGTGTTCTCCTC 3’(SEQ ID NO:3)；A：5’CGGTGTGGATGAACAGACTC3’(SEQ ID NO:4)；snp9562引物序列：S：5’CTATCAGCACACTCACCACATT 3’(SEQ ID NO:5)；A：5’CAGACCACAATGCTCTTCCA3’(SEQ ID NO:6)。

(3)用分子标记snp8107和snp9562的引物对分别进行PCR扩增，其中体系为25μL，组分包含12.5μL 2×Taq Master Mix、8.5μL ddH

(4)直接测序，将PCR产物交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行一代测序，序列分别如下：

snp8107：TGGTCTGCTGTGTTCTCCTCAATAGCAGTACAGGCGTTTCATTGGACCAGTAATAATTACAATGTGCCGTGTCCAAATGAACACATGATTATAAGCTGCCATTTTTCTCACACAGTGGAATCTGGTGTGCGACAGCGAGTGGAGAGTCCCGTTCGCAACCTCAACGTTATACATGGGCTACTTGTTGGGCTCTCTTGTTTCTGGTCAACTTTCTGACAGGTACTGCTTTTGTCCACATATCATAATTAATGCAAACAGTCGGTTTTGATGGAGAGTATCTGGCCGAAGCTATATGACACCACCTGTGTGCTTTACAGATCTAGTAAGCTAGTGAAGCAATAGTAAAACAGTTTTTGTTTACTGGTCTACTTCCACTCTCATAACTGAAGATGTTCTCGTTGCTCTCTCCTAACCTGAAGAGTCTGTTCATCCACACCG(SEQ ID NO:1)；

snp9562：CTATCAGCACACTCACCACATTCGCTGTTTTATTCTGAAATACAAAAATGGATGCGATAGCTTTTTAATAATGCACATGTTCATTACTGTCATTTTTATTCGAGTGAACTTCTCCAAACAGACTTTTGGCTCCGCTGACCTGGATTCATTCAGGTGAGCGCAGGAGACAGGGAACGCAAACTAATCCGAAGAAGTCATGTGTGAACCGCATCTTTACAACAAACGTGTGCATTTGTGTGTGTGATGATCCATGTTTGGAAGAGCATTGTGGTCTG(SEQ ID NO:2)。拿到测序数据后用软件Sequencher(v5.4.6)观察测序峰图(图1)，根据峰图中的峰型确定其基因型。

(5)利用测得的基因型数据(由于三个表型性状间存在极显著相关性，即改善其中一种性状的同时也可以改善其他性状，本实施例主要用于改善体质量并以体长性状加以佐证)，结合表型数据，统计出不同基因型的基因频率和平均体重，结果用平均值±标准差表示，通过平均值来确定该群体的优势基因型，结果如表1-4所示。首先对单SNP位点进行等位基因和基因频率的统计(表2)，可见snp8107的A基因频率和snp9562的G基因频率较高，然后对不同单倍型的生长表型数据进行统计(去除数量仅有1个个体的单倍型或双倍型)，从表3可以看出snp8107的单倍型AG与snp9562的单倍型GA的体重和体长平均值要明显高于总体样本的平均值。由于三个SNP位于同一连锁群，可能存在连锁效应，所以将不同单倍型组成二倍型进行统计分析可以提高准确率，从表4可以看出由snp8107的AA和snp9562的GA组成的二倍型的平均体重要明显高于288尾青鱼的总平均体重(表4)，因此可以认为该双倍型即为邗江群体的优势基因型。

表1：邗江青鱼群体288个个体表型数据及相关性

注：**在0.01级别(双尾)，相关性显著。

表2：邗江青鱼群体两个SNP位点的基因型及基因型频率

注：在snp8107中，AA为AA，AB为AG，BB为GG；在snp9562中，AA为GG，AB为GA，BB为AA。

表3：邗江青鱼群体两个SNP位点不同单倍型与生长性状关联分析

表4：snp8107和snp9562位点组成的二倍型与邗江青鱼群体体重、体长性状的关联分析

实施例3

本实施例验证分子标记snp8107和snp9562在湘江群体中的应用，具体如下：

供试材料选取30尾湘江成体青鱼，生长性状的测量、序列信息、PCR扩增、SNP分型同实施例2，对未检测到的单/双倍型和数量为1个的基因型样本不进行统计分析。对湘江30尾青鱼群体进行体质量和体长相关性分析、不同基因型频率统计、不同单倍型及双倍型与生长性状的关联分析，结果如表5-8所示。从表7可以看出，在随机选取的30尾成体青鱼中，snp8107的单倍型AG和snp9562的单倍型AA要明显高于其他单倍型的体重平均值(表6)。另外，在组成二倍型后，snp8107的AG和snp9562的AA组成的二倍型要明显高于其他二倍型的体重平均值(表8)。相关性分析显示，体体质量和体长有极显著的相关性(表5)。由此证明本发明中与青鱼生长相关QTL紧密连锁的分子标记snp8107和snp9562同样适用于其他水系群体的青鱼，但由于遗传和环境等因素的影响，不同水系的群体优势基因型存在差异。

表5：湘江青鱼群体30个个体表型数据及体重和体长的相关性

注：**在0.01级别(双尾)，相关性显著。

表6：湘江青鱼群体两个SNP位点的基因型及基因型频率

注：在snp8107中，AA为AA，AB为AG，BB为GG；在snp9562中，AA为GG，AB为GA，BB为AA。

表7：湘江青鱼群体两个SNP位点不同单倍型与生长性状关联分析

表8：snp8107和snp9562位点组成的二倍型与湘江青鱼群体体重、体长性状的关联分析

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。