一种SD大鼠肝脏库普弗细胞和肝星状细胞原代分离、培养方法

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种SD大鼠肝脏库普弗细胞和肝星状细胞原代分离、培养方法。

背景技术

肝脏疾病已成为世界不可忽视的健康问题之一。肝脏是人体器官中的最大的消化腺及代谢中心，其在多种功能中发挥重要作用。肝脏作为一个异质性的器官，其由不同细胞类型构成—肝实质细胞如肝细胞和非实质细胞如库普弗细胞(Kupffer cell，KC)、肝星状细胞(Hepatic stellate cell，HSC)、肝窦内皮细胞等，其中，KC和HSC分别约占肝脏细胞总数的15％～20％、5％-8％

HSC也称为肝贮脂细胞和维生素A贮存细胞，是肝脏稳态的主要调节因子，也是肝纤维化时的关键效应者

众所周知，炎症反应是肝纤维化发生过程中不可或缺的环节，而HSC的活化主要是由于KC的炎症反应所引起

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术难题如何从大鼠体内同时获取高得率的KC和HSC，提供一种SD大鼠肝脏库普弗细胞和肝星状细胞原代分离、培养方法。

为了解决上述所涉及到的问题，本发明采取如下方法获得KC和HSC：

一种SD大鼠肝脏库普弗细胞和肝星状细胞原代分离、培养方法，包括如下步骤：

(1)麻醉和抗凝：取健康成年SD大鼠1只，200-350g，禁食12小时后，按0.8-1.0％戊巴比妥钠、0.5ml/100g体质量腹腔注射麻醉大鼠，随后注入0.2-0.4％抗凝剂、0.2ml/100g体质量，麻醉抗凝完毕后，大鼠常规腹部备皮，75％酒精喷浴后迅速放置于无菌操作台中，仰卧位固定四肢及头部，再次消毒腹部皮肤，解剖，充分暴露肝脏门静脉和下腔静脉；

(2)插管：取24GY型留置针插入门静脉，针尖部位推送至1-2mm处，止血夹固定，抽出针芯并旋开端帽后，可见深红色血液回流；

(3)原位灌注：灌注1：套管针末端连接灌注泵并启动，灌注灌注液，待肝脏膨胀时剪断下腔静脉并结扎上腔静脉，流速为50-70r/min，时间为20-30min，期间间歇用镊子夹闭血管使肝脏充盈；灌注2：冲出液体为无色时，肝脏颜色由原来的暗红色变为土黄色(肝脏出现裂纹)，换灌注液灌注，流速为30-50r/min，时间为10-20min，消化至肝脏失去弹性，期间间歇用镊子夹闭血管使肝脏充盈，便于消化细胞；

(4)体外消化并获取总细胞悬液：钝性分离肝脏于100mm培养皿中，若还有大块组织，用灭菌的镊子组织，移入50ml离心管，然后加入20-40ml消化分散液，封口膜封口，35-40℃、90-110r/min，振荡消化20-40min，直至消化液呈匀浆状，加入20-40ml预冷的无血清DMEM终止消化，枪头轻轻吹打，然后40-100um细胞筛过滤未消化组织块1-3遍，50ml离心管收集滤液，即得肝脏细胞混悬液；

(5)KC和HSC的纯化、分离：步骤(4)中所得细胞混悬液，100-300rpm，3-5℃离心4-6min，上清重复2-4次；取上清，500-1000rpm，3-5℃离心8-12min；取沉淀，加入40ml 17.6％碘克沙醇混匀沉淀后，取8根15ml离心管，每管加入5ml含细胞沉淀的17.6％碘克沙醇，后缓慢加入5ml 10％碘克沙醇，小心铺上2ml DMEM，1300-1500rpm，3-5℃离心20-30min；最后取10％碘克沙醇与DMEM交界处的细胞环和取17.6％碘克沙醇与10％碘克沙醇处细胞环，分别于15ml离心管，加入DMEM重悬，800-1200rpm，离心4-6min，1-3次，取沉淀，整个离心操作步骤均在冰上进行；

(6)细胞培养及形态观察：步骤(5)中所得沉淀用预热的含20％胎牛血清的完全培养基重悬，进行细胞计数及台盼蓝拒染，调整细胞浓度为1-2×10

(7)存活率检测：采用0.4％台盼蓝拒染及吉姆萨染色检测KC存活率，0.4％台盼蓝拒染检测HSC存活率；

(8)细胞鉴定：采用印度墨汁吞噬实验、CD68细胞免疫荧光实验鉴定KC，采用油红O染色实验、α-SMA细胞免疫荧光实验鉴定HSC。

优选的，步骤(1)中所述按0.9％戊巴比妥钠、0.5ml/100g体质量腹腔注射麻醉大鼠，随后注入0.3％抗凝剂、0.2ml/100g体质量。

优选的，步骤(3)灌注1中所述灌注液为含EGTA的D-Hank’s溶液、含0.3％抗凝剂的EGTA溶液。

进一步优选的，步骤(3)灌注1中所述灌注液为含0.3％抗凝剂的EGTA溶液。

优选的，步骤(3)灌注1中所述流速为60r/min，时间为25min。

优选的，步骤(3)灌注2中所述灌注液为0.4mg/mlPronaseE灌注液、0.16mg/mlⅣ型胶原酶灌注液、0.5mg/mlⅣ型胶原酶灌注液、0.8mg/mlⅣ型胶原酶灌注液。

进一步优选的，步骤(3)灌注2中所述灌注液为0.8mg/mlⅣ型胶原酶灌注液，所述灌注流速为40r/min，时间为15min。

优选的，步骤(4)所述加入30ml消化分散液，封口膜封口，37℃、100r/min，振荡消化30min，直至消化液呈匀浆状，加入30ml预冷的无血清DMEM终止消化，枪头轻轻吹打，然后70um细胞筛过滤未消化组织块2遍。

优选的，步骤(5)所述细胞混悬液，200rpm，4℃离心5min，上清重复3次；取上清，600rpm，4℃离心10min；所述小心铺上2ml DMEM，1400rpm，4℃离心25min；所述加入DMEM重悬，1000rpm，离心5min，2次。

优选的，步骤(6)所述调整细胞浓度为1×10

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供一种SD大鼠肝脏库普弗细胞和肝星状细胞原代分离、培养方法，两种灌流液依次灌注，期间间歇用镊子夹闭血管使肝脏充盈，有利于消化细胞，保证了肝脏得到充分灌注，提高了细胞的产量。

2、本发明提高酶的浓度至0.8mg/ml，并改善离心转速，最终获得KC和HSC细胞数量分别可达到5×10

3、本发明提供一种SD大鼠肝脏库普弗细胞和肝星状细胞原代分离、培养方法，可以在体外单层长期培养，所获得的KC能够满足后续实验如酶联免疫吸附、蛋白印迹及细胞免疫荧光等试验的要求。

4、本发明提供一种SD大鼠肝脏库普弗细胞和肝星状细胞原代分离、培养方法，所提供技术方案中Ⅳ型胶原酶的浓度，能够导致肝脏消化完全，满足后续实验的细胞数量；密度梯度离心能够把大部分肝实质细胞去除，且使KC、HSC出现在不同的密度层；换液时间，当细胞贴壁1h换液能够提高KC纯度。

5、本发明解决了如何从大鼠体内同时获取高得率的KC和HSC难题，使获得的大鼠KC和HSC产量高、存活率高、纯度高。该方法简便、经济，以为后续实验提供一个良好的实验基础。

附图说明

图1KC和HSC分离流程图

图2三种方案离心结果图(A为方案1离心结果；B方案2离心结果；C方案3离心结果)

图3方案2细胞环培养结果图(A为方24h形态图，×400；B为72h形态图，×400)

图4方案3的KC生长形态图(A为1小时换液后KC形态图，×100；B为24小时后KC形态图，×40；C为7天后KC形态图，×400)

图5方案3的HSC生长形态图(A为2小时换液后HSC形态图，×100；B为24小时后HSC形态图，×100；C为72小时后HSC形态图，×100)

图6方案3的KC及HSC活力检测图(A为新鲜分离的KC台盼蓝拒染图，×100；B为5天的KC吉姆萨染色图，×400；C为新鲜分离的HSC台盼蓝拒染图，×100)

图7方案3的KC鉴定结果图(A为24小时吞墨结果图，×400；B为72小时吞墨结果图×400；C为24小时CD68免疫荧光结果图，×200)

图8方案3的HSC鉴定结果图(A为24小时油红O染色结果图，×200；B为24小时自发荧光结果图，×100；C为7天α-SMA免疫荧光结果图，×100)

具体实施方式

为了使本发明的目的及优势更清新地展现，现将具体实施方式进一步阐述。此处所阐述的具体实施方式仅针对本发明进行解释，并不用于限定本发明。

实施例1

一种SD大鼠肝脏库普弗细胞和肝星状细胞原代分离、培养方法，具体操作如下：

(1)麻醉和抗凝：取健康成年SD大鼠1只，300g，禁食12小时后，按0.9％戊巴比妥钠、0.5ml/100g体质量腹腔注射麻醉大鼠，随后注入0.3％抗凝剂、0.2ml/100g体质量，麻醉抗凝完毕后，大鼠常规腹部备皮，75％酒精喷浴后迅速放置于无菌操作台中，仰卧位固定四肢及头部，再次消毒腹部皮肤，解剖，充分暴露肝脏门静脉和下腔静脉；

(2)插管：取24GY型留置针插入门静脉，针尖部位推送至1-2mm处，止血夹固定，抽出针芯并旋开端帽后，可见深红色血液回流；

(3)原位灌注：灌注1：套管针末端连接灌注泵并启动，灌注含0.3％抗凝剂的EGTA溶液，待肝脏膨胀时剪断下腔静脉并结扎上腔静脉，流速为60r/min，时间为25min，期间间歇用镊子夹闭血管使肝脏充盈；灌注2：冲出液体为无色时，肝脏颜色由原来的暗红色变为土黄色(甚至肝脏出现裂纹)，换0.8mg/mlⅣ型胶原酶灌注液灌注，流速为40r/min，时间为15min，消化至肝脏失去弹性，期间间歇用镊子夹闭血管使肝脏充盈，便于消化细胞；

(4)体外消化并获取总细胞悬液：钝性分离肝脏于100mm培养皿中，若还有大块组织，用灭菌的镊子组织，移入50ml离心管，然后加入30ml消化分散液，封口膜封口，37℃、100r/min，振荡消化30min，直至消化液呈匀浆状，加入30ml预冷的无血清DMEM终止消化，枪头轻轻吹打，然后70um细胞筛过滤未消化组织块2遍，50ml离心管收集滤液，即得肝脏细胞混悬液；

(5)KC和HSC的纯化、分离：步骤(4)中所得细胞混悬液，200rpm，4℃离心5min，上清重复3次；取上清，600rpm，4℃离心10min；取沉淀，加入40ml17.6％碘克沙醇混匀沉淀后，取8根15ml离心管，每管加入5ml含细胞沉淀的17.6％碘克沙醇，后缓慢加入5ml 10％碘克沙醇，小心铺上2ml DMEM，1400rpm，4℃离心25min；最后取10％碘克沙醇与DMEM交界处的细胞环和取17.6％碘克沙醇与10％碘克沙醇处细胞环，分别于15ml离心管，加入DMEM重悬，1000rpm，离心5min，2次，取沉淀，整个离心操作步骤均在冰上进行；

(6)细胞培养及形态观察：步骤(5)中所得沉淀用预热的含20％胎牛血清的完全培养基重悬，进行细胞计数及台盼蓝拒染，调整细胞浓度为1×10

(7)存活率检测：采用0.4％台盼蓝拒染及吉姆萨染色检测KC存活率，0.4％台盼蓝拒染检测HSC存活率；

(8)细胞鉴定：采用印度墨汁吞噬实验、CD68细胞免疫荧光实验鉴定KC，采用油红O染色实验、α-SMA细胞免疫荧光实验鉴定HSC。

实施例2

一种SD大鼠肝脏库普弗细胞和肝星状细胞原代分离、培养方法，具体操作如下：

(1)麻醉和抗凝：取健康SD大鼠1只，350g，禁食12小时后，按1.0％戊巴比妥钠、0.5ml/100g体质量腹腔注射麻醉大鼠，随后注入0.4％抗凝剂、0.2ml/100g体质量，麻醉抗凝完毕后，大鼠常规腹部备皮，75％酒精喷浴后迅速放置于无菌操作台中，仰卧位固定四肢及头部，再次消毒腹部皮肤，解剖，充分暴露肝脏门静脉和下腔静脉；

(2)插管：取24G Y型留置针插入门静脉，针尖部位推送至1-2mm处，止血夹固定，抽出针芯并旋开端帽后，可见深红色血液回流；

(3)原位灌注：灌注1：套管针末端连接灌注泵并启动，灌注含EGTA的D-Hank's液，待肝脏膨胀时剪断下腔静脉并结扎上腔静脉，流速为70r/min，时间为30min，期间间歇用镊子夹闭血管使肝脏充盈；灌注2：冲出液体为无色时，肝脏颜色由原来的暗红色变为土黄色(肝脏出现裂纹)，换0.5mg/mlⅣ型胶原酶灌注液灌注，流速为50r/min，时间为20min，消化至肝脏失去弹性，期间间歇用镊子夹闭血管使肝脏充盈，便于消化细胞；

(4)体外消化并获取总细胞悬液：钝性分离肝脏于100mm培养皿中，若还有大块组织，用灭菌的镊子组织，移入50ml离心管，然后加入40ml消化分散液，封口膜封口，40℃、110r/min，振荡消化40min，直至消化液呈匀浆状，加入40ml预冷的无血清DMEM终止消化，枪头轻轻吹打，然后100um细胞筛过滤未消化组织块3遍，50ml离心管收集滤液，即得肝脏细胞混悬液；

(5)KC和HSC的纯化、分离：步骤(4)中所得细胞混悬液，300rpm，5℃离心6min，上清重复4次；取上清，1000rpm，5℃离心12min；取沉淀，加入40ml 17.6％碘克沙醇混匀沉淀后，取8根15ml离心管，每管加入5ml含细胞沉淀的17.6％碘克沙醇，后缓慢加入5ml 10％碘克沙醇，小心铺上2ml DMEM，1500rpm，5℃离心30min；最后取10％碘克沙醇与DMEM交界处的细胞环和取17.6％碘克沙醇与10％碘克沙醇处细胞环，分别于15ml离心管，加入DMEM重悬，1200rpm，离心6min，3次，取沉淀，整个离心操作步骤均在冰上进行；

(6)细胞培养及形态观察：步骤(5)中所得沉淀用预热的含20％胎牛血清的完全培养基重悬，进行细胞计数及台盼蓝拒染，调整细胞浓度为2×10

(7)存活率检测：采用0.4％台盼蓝拒染及吉姆萨染色检测KC存活率，0.4％台盼蓝拒染检测HSC存活率；

(8)细胞鉴定：采用印度墨汁吞噬实验、CD68细胞免疫荧光实验鉴定KC，采用油红O染色实验、α-SMA细胞免疫荧光实验鉴定HSC。

实施例3

一种SD大鼠肝脏库普弗细胞和肝星状细胞原代分离、培养方法，具体操作如下：

(1)麻醉和抗凝：取健康SD大鼠1只，200g，禁食12小时后，按0.8％戊巴比妥钠、0.5ml/100g体质量腹腔注射麻醉大鼠，随后注入0.2％抗凝剂、0.2ml/100g体质量，麻醉抗凝完毕后，大鼠常规腹部备皮，75％酒精喷浴后迅速放置于无菌操作台中，仰卧位固定四肢及头部，再次消毒腹部皮肤，解剖，充分暴露肝脏门静脉和下腔静脉；

(2)插管：取24G Y型留置针插入门静脉，针尖部位推送至1-2mm处，止血夹固定，抽出针芯并旋开端帽后，可见深红色血液回流；

(3)原位灌注：灌注1：套管针末端连接灌注泵并启动，灌注含抗凝剂的EGTA溶液，待肝脏膨胀时剪断下腔静脉并结扎上腔静脉，流速为50r/min，时间为20min，期间间歇用镊子夹闭血管使肝脏充盈；灌注2：冲出液体为无色时，肝脏颜色由原来的暗红色变为土黄色(肝脏出现裂纹)，换0.16mg/mlⅣ型胶原酶灌注液灌注，流速为30r/min，时间为10min，消化至肝脏失去弹性，期间间歇用镊子夹闭血管使肝脏充盈，便于消化细胞；

(4)体外消化并获取总细胞悬液：钝性分离肝脏于100mm培养皿中，若还有大块组织，用灭菌的镊子组织，移入50ml离心管，然后加入20ml消化分散液，封口膜封口，35℃、90r/min，振荡消化20min，直至消化液呈匀浆状，加入20ml预冷的无血清DMEM终止消化，枪头轻轻吹打，然后40um细胞筛过滤未消化组织块1遍，50ml离心管收集滤液，即得肝脏细胞混悬液；

(5)KC和HSC的纯化、分离：步骤(4)中所得细胞混悬液，100rpm，3℃离心6min，上清重复2次；取上清，500rpm，3℃离心8min；取沉淀，加入40ml17.6％碘克沙醇混匀沉淀后，取8根15ml离心管，每管加入5ml含细胞沉淀的17.6％碘克沙醇，后缓慢加入5ml 10％碘克沙醇，小心铺上2ml DMEM，1300rpm，3℃离心20min；最后取10％碘克沙醇与DMEM交界处的细胞环和取17.6％碘克沙醇与10％碘克沙醇处细胞环，分别于15ml离心管，加入DMEM重悬，800rpm，离心4min，1次，取沉淀，整个离心操作步骤均在冰上进行；

(6)细胞培养及形态观察：步骤(5)中所得沉淀用预热的含20％胎牛血清的完全培养基重悬，进行细胞计数及台盼蓝拒染，调整细胞浓度为1×10

(7)存活率检测：采用0.4％台盼蓝拒染及吉姆萨染色检测KC存活率，0.4％台盼蓝拒染检测HSC存活率；

(8)细胞鉴定：采用印度墨汁吞噬实验、CD68细胞免疫荧光实验鉴定KC，采用油红O染色实验、α-SMA细胞免疫荧光实验鉴定HSC。

实施例4

同实施例1的区别为，步骤(3)原位灌注不同：

灌注1：套管针末端连接灌注泵并启动，先以含EGTA的D-Hank’s液灌注，待门静脉膨胀时剪断门静脉并结扎近心端的下腔静脉，流速为60r/min，30min；

灌注2：当冲出液体为无色时，换用0.4mg/ml PronaseE灌注，流速为30r/min，15min，继续使用0.16mg/mlⅣ型胶原酶液灌注，流速为30r/min，15min，当肝脏颜色由原来的暗红色变为土黄色即可停止灌注。

为了进一步验证本发明的有效性，发明进行了一系列的验证试验，具体如下：

一、实验仪器与试剂

1、主要器材：双人单面净化工作台(苏州净化公司：SW-CJ-2D型)、电热恒温水浴锅(上海助蓝仪器公司：HH-11-2)、恒流泵(上海嘉鹏公司：HL-2B)、离心机(上海安亭仪器厂：TDL-5000bR)、立式恒温振荡器(IS-RDV1)。

2、主要试剂：D-Hanks’液(北京索莱宝：H1045)、Hanks’液(北京索莱宝：H1025)、DNaseⅠ(瑞士Roche：041590001)、Ⅳ型胶原酶(美国sigma：C5138)、60％Optiprep(美国sigma：D1556)、Ⅰ型鼠尾胶原(美国sigma：C7661)、高糖DMEM培养基(Gibco:11995-040)、EGTA(美国sigma：E4378)、HEPES(美国sigma：H4034)、70um细胞筛(biosharp:258368)、小鼠抗大鼠单克隆抗体CD68(immunoway：YM3050)、小鼠抗大鼠单克隆抗体α-SMA(immunoway：YM3365)、山羊抗鼠荧光二抗(immunoway：RS0003)、印度墨水(Phygene：2924)、油红O染色试剂盒(细胞专用)(北京索莱宝：G1262)。

3、试剂配制：

(1)0.9％戊巴比妥钠：纯水配制，现配现用。

(2)0.3％肝素钠：生理盐水配制，现配现用。

(3)EGTA液：称取0.057gEGTA(190mg/L)、0.071gHEPES(238mg/L)，然后使用300mlD-Hanks’液混匀，0.22um过滤除菌，封口，4℃保存。

(4)Ⅳ型胶原酶灌注液：称取120mgⅣ型胶原酶(0.8mg/ml)、0.357gHEPES(238mg/L)，然后使用150mLHanks液混匀，0.22um过滤除菌，现配现用。

(5)消化分散液：取0.3ml DNaseⅠ(1mg/ml，PBS配制)、29.7ml后灌注液，混匀备用，现配现用。

(6)分离液：

①：10％Optiprep(碘克沙醇)：取6.67ml 60％Optiprep原液，PBS定容至40ml，使用前预冷。

②：17.6％Optipre(碘克沙醇)：取11.73ml 60％Optiprep原液，PBS定容至40ml，使用前预冷。

Ⅰ型鼠尾胶原包被浓度配制：按试剂说明书配制。

二、大鼠KC和HSC细胞的分离、培养整个操作过程在无菌条件下进行：如图1所示。

2.1麻醉和抗凝：取健康成年SD大鼠1只，200-350g左右，禁食12小时后，按0.9％戊巴比妥钠、0.5ml/100g体质量腹腔注射麻醉大鼠，随后注入0.3％抗凝剂(0.2ml/100g)。麻醉抗凝完毕后，大鼠常规腹部备皮，75％酒精喷浴后迅速放置于无菌操作台中，仰卧位固定四肢及头部。再次消毒腹部皮肤，解剖，充分暴露肝脏门静脉和下腔静脉。

2.2插管：取24G Y型留置针插入门静脉，针尖部位推送至1-2mm处，止血夹固定，抽出针芯并旋开端帽后，可见深红色血液回流。

2.3原位灌注：

方案1：

灌注1：套管针末端连接灌注泵并启动，先以含EGTA的D-Hank's液灌注，待门静脉膨胀时剪断门静脉并结扎近心端的下腔静脉，流速约为60r/min，30min。

灌注2：当冲出液体为无色时，换用0.4mg/ml Pronase E灌注，流速为30r/min，15min。当肝脏颜色由原来的暗红色变为土黄色即可停止灌注。

灌注3：0.16mg/mlⅣ型胶原酶液灌注，流速为30r/min，15min。当肝脏颜色由原来的暗红色变为土黄色即可停止灌注。

方案2：

灌注1：套管针末端连接灌注泵并启动，先注入0.3％抗凝剂，在灌注EGTA溶液，待肝脏膨胀时剪断门静脉并结扎近心端的下腔静脉，流速约为60r/min，20min左右。

灌注2：当冲出液体为无色时，肝脏颜色由原来的暗红色变为土黄色，换用0.5mg/mlⅣ型胶原酶灌注，流速为30r/min，15min。

方案3：

灌注1：套管针末端连接灌注泵并启动，在灌注含抗凝剂的EGTA溶液，待肝脏膨胀时剪断下腔静脉并结扎上腔静脉，流速约为60r/min，25min。期间间歇用镊子夹闭血管使肝脏充盈。

灌注2：冲出液体为无色时，肝脏颜色由原来的暗红色变为土黄色(肝脏出现裂纹)，换用0.8mg/mlⅣ型胶原酶灌注，流速为40r/min，15min。消化至肝脏失去弹性。期间间歇用镊子夹闭血管使肝脏充盈，便于消化细胞。

2.4体外消化并获取总细胞悬液：钝性分离肝脏于100mm培养皿中，若还有大块组织，用灭菌的镊子组织，移入50ml离心管，然后加入30ml消化分散液，封口膜封口，37℃、100r/min，振荡消化20-30min，直至消化液呈匀浆状，加入30ml左右预冷的无血清DMEM终止消化，枪头轻轻吹打，然后70um细胞筛过滤未消化组织块2遍，50ml离心管收集滤液，即肝脏细胞混悬液。

2.5KC和HSC的纯化、分离：

方案1：2.4步骤中所得细胞虑液，100rpm，4℃离心5min，上清重复2-3次；然后取上清，500rpm，4℃离心10min；取沉淀，加入40ml 17.6％碘克沙醇混匀沉淀后，取8根15ml离心管，每管加入5ml含细胞沉淀的17.6％碘克沙醇，后缓慢加入5ml 10％碘克沙醇，小心铺上2ml DMEM，1400rpm，4℃离心25min；最后取10％碘克沙醇与DMEM交界处的细胞环和取17.6％碘克沙醇与10％碘克沙醇处细胞环，分别于15ml离心管，加入DMEM重悬，1000r/min，离心5min，1-2次，取沉淀。整个离心操作步骤均在冰上进行。

方案2：2.4步骤中所得细胞虑液，200rpm，4℃离心5min，上清重复2-3次；然后取上清，1000rpm，4℃离心10min；取沉淀，加入40ml 17.6％碘克沙醇混匀沉淀后，取8根15ml离心管，每管加入5ml含细胞沉淀的17.6％碘克沙醇，后缓慢加入5ml 10％碘克沙醇，小心铺上2ml DMEM，1400rpm，4℃离心20min；最后取10％碘克沙醇与DMEM交界处的细胞环和17.6％碘克沙醇与10％碘克沙醇处细胞环，分别于15ml离心管，加入DMEM重悬，1000r/min，离心5min，1-2次，取沉淀。整个离心操作步骤均在冰上进行。

方案3：2.4步骤中所得细胞虑液，200rpm，4℃离心5min，上清重复2-3次；取上清，600rpm，4℃离心10min；取沉淀，加入40ml 17.6％碘克沙醇混匀沉淀后，取8根15ml离心管，每管加入5ml含细胞沉淀的17.6％碘克沙醇，后缓慢加入5ml10％碘克沙醇，小心铺上2mlDMEM，1400rpm，4℃离心25min；最后取10％碘克沙醇与DMEM交界处的细胞环和取17.6％碘克沙醇与10％碘克沙醇处细胞环，分别于15ml离心管，加入DMEM重悬，1000rpm/min，离心5min，1-2次，取沉淀。整个离心操作步骤均在冰上进行。

2.6细胞培养及形态观察：2.5步骤中所得沉淀用预热的含20％胎牛血清的完全培养基重悬，进行细胞计数及台盼蓝拒染，调整细胞浓度为1×10

2.7存活率检测：采用0.4％台盼蓝拒染及吉姆萨染色检测KC存活率，0.4％台盼蓝拒染检测HSC存活率，结果如图6所示。

2.8细胞鉴定：采用印度墨汁吞噬实验、CD68细胞免疫荧光实验鉴定KC，采用油红O染色实验、α-SMA细胞免疫荧光实验鉴定HSC，结果如图7-图8所示。

三、结论及分析

在原位Ⅳ型胶原酶消化基础上，还采用体外消化进一步破坏肝细胞，并联用密度梯度离心和差速贴壁法分离获得KC及HSC，在方案1中，为得到目的细胞环，原因是灌注时酶的浓度过低导致消化下来的细胞数量过少；方案2中，改进了灌注方法及提高了酶的浓度至0.5mg/ml，但最后所得细胞数量为2×10

以上已经对本发明创造的较佳实施例进行详细阐述，但本发明创造不限定于上述实施例，凡在本发明的精神和原则之内作出任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。

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