一种西番莲亚属植物根尖分生区染色体标本的制作方法

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及一种西番莲亚属植物根尖分生区染色体标本的制作方法。

背景技术

西番莲是金虎尾目(Malpighiales)西番莲科(Passifloraceae)西番莲属(Passiflora)多年生草质攀援性藤本植物，国内种植品种也称百香果。世界上有530多种西番莲属植物，是西番莲科中物种最丰富的属，其中大部分分布在美洲，包括哥伦比亚、巴西、厄瓜多尔和秘鲁，少数分布在东南亚、澳大利亚和新西兰等热带和亚热带地区，其中我国大约有20个种(其中7个为特有种，7个为引进种)。

关于西番莲属的分类，Feuillet等(2003)根据形态、系统发育、SSR和叶绿体基因组分析，将其划分为4个亚属(Astrophaea、Decaloba、Deidamiodes和Passiflora)。西番莲属不同种之间表现出核型多样性，不同倍性水平亚类之间存在不同的基本特征的染色体数目：如Decaloba亚属中x＝6(2n＝12、24和36)；Passiflora亚属中x＝9(2n＝18、36和72)和x＝10(2n＝20)；Astrophea、Deidamioides亚属中则为x＝12(2n＝24)。在西番莲属4个亚属中，Passiflora是最大的亚属，约有240种，因此一般被认为是典型的西番莲属，目前百香果主要栽培品种有紫色百香果(Passifloraedulis)及它的黄色变种(Passiflora edulisf.flavicarpa)，荔枝味百香果，木瓜百香果等都属于Passiflora亚属。西番莲属丰富的种质资源代表了其表型性状的多样性，可为遗传育种和资源开发提供了良好的材料。

目前制约西番莲产业发展的一大因素是无较好的替代品种出现，现有的主栽品种已经种植了几十年，品种退化和病虫害严重，亟需研发和创制新品种以替代现有品种。杂交育种是开发新品种的一个重要手段，尤其是种间杂交更可带来丰富的遗传资源，但是需要对双亲遗传背景进行深入的了解，对染色体的观察和核型分析可以深入了解资源的背景，为倍性育种、杂交育种亲本选配、物种进化、鉴定与分类等工作提供更丰富的种质资源和细胞学依据，为西番莲基因组在染色体上的定位创造了先决条件，同时有助于加快杂交育种和新品种创制的进程。染色体制片技术已被广泛应用于染色体的观察与核型分析。对于染色体较小，数目较多的植物，具备成熟的染色体制片技术至关重要。

近年来国内外西番莲属品种培育和创制工作发展较快，其中不乏多倍体资源以及观赏性的品种，具有优异的品种特性然而无法坐果；此外西番莲大多存在自交不亲和情况，无法结实纯系的种子。针对这些情况传统的种子萌发获取根尖观察染色体不可行，需要开发新的方法进行染色体观察，有助于对资源优异性状的开发和利用。

发明内容

本发明第一个方面是提供一种西番莲亚属植物水培促根培养液，其组分包括：水培营养液，吲哚丁酸2.0～4.0mg/L。

进一步，所述的水培营养液的组成为：大量元素、中微量元素。

进一步，大量元素的组成为：四水硝酸钙945mg/L、硝酸钾506mg/L、硝酸铵80mg/L、磷酸二氢钾136mg/L、硫酸镁493mg/L，微量元素的组成为：碘化钾0.83mg/l、硼酸6.2mg/L、硫酸锰22.3mg/L、硫酸锌8.6mg/L、钼酸钠0.25mg/L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L。

本发明的第二个方面是提供一种西番莲亚属植物水培促根培养方法，包括以下步骤：

选择健康的西番莲亚属植株当年生枝条，采用本发明第一个方面所述的水培促根培养液进行水培促根，培养条件为26℃，光照度4000～4500lux，水培促根培养基每3天更换一次。

进一步，所述的枝条含顶芽或1-2个节点，营养液水位以枝条插入营养液的长度3cm左右为准。

进一步，所述的西番莲亚属植物为紫色百香果(Passiflora edulis)、木瓜百香果(Passiflora alata)、Passiflora tenuifila、龙珠果(Passiflora foetida)和/或瑞香(Passiflora‘SoiFah’)百香果。

本发明的第三个方面是提供一种西番莲亚属植物根尖分生区染色体标本的制作方法，包括以下步骤：

(1)选择采用本发明第二个方面所述的方法对木瓜百香果枝条进行水培促根；待不定根长出后，选取根尖作为材料；

(2)剪取根尖，用纯净水将其冲洗干净后置于离心管中，秋水仙素预处理2～4h；

(3)将预处理后的材料使用纯净水冲洗3～5次；置于无水乙醇：冰醋酸＝3：1的卡诺氏固定液中固定24h；

(4)将根尖放入蒸馏水中浸泡3～5min，将根尖上残留的酒精彻底清除，而后用0.075mol/L KCl溶液浸泡30～40min；

(5)之后，将根尖用蒸馏水冲洗后，先用1mol/L的HCl浸泡解离5min，然后置于60℃的水浴锅中继续解离15～20min；

(6)采用品红溶液染色制片；

(7)将染色后的根尖置于载玻片上，剥去根冠，再切取1～2mm分生组织，滴加45％的冰醋酸，用镊子夹取盖玻片，使其一端先接触到载玻片，再慢慢轻放；然后轻轻敲击盖玻片，使材料分散均匀，之后将盖玻片压紧，用凡士林将盖玻片四周临时封住，即得。

进一步，所述步骤(1)中，选取根尖部分在上午10:00-10:30，选取长度1-2cm、分裂旺盛且粗壮的根尖部分。

进一步，所述步骤(2)中，所述的秋水仙素质量浓度为0.1％。

进一步，所述步骤(6)中，所用的品红溶液浓度为30％，加入体积以将根完全没住。

进一步，所述的西番莲亚属植物为紫色百香果(Passiflora edulis)、木瓜百香果(Passiflora alata)、Passiflora tenuifila、龙珠果(Passiflora foetida)和/或瑞香(Passiflora‘SoiFah’)百香果。

本发明的有益效果：

本发明所述的水培促根培养基及方法，培养约3～4周即可长出大量的不定根，而且不定根粗壮，生长状况良好。

采用本发明所示的水培促根方法培养木瓜百香果的枝条，可以获得大量分裂旺盛且粗壮的根尖，再采用本发明所述的制片方法制备的根尖分生区染色体标本，木瓜百香果和龙珠果的染色体分散良好，可以清晰的观察到处于细胞分裂中期分裂相的细胞，染色体形态清晰，便于后续进行染色体的观察和核型分析的研究。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1不同促根方法对台农百香果促根效果比较，左图是采用本方法水培促根后台农百香果枝条生根情况(左)，右图是以种子进行萌发的生根情况(右)。

图2为不同百香果品种采用不同促根方法生根情况，2-1为紫色百香果，左图为采用本发明的方法水培促根，中图为水培营养液促根，右图为吲哚丁酸促根；2-2为木瓜百香果果左图为本发明的方法水培促根，右图为吲哚丁酸促根；2-3为瑞香百香果，左图为本发明的方法水培促根，右图为吲哚丁酸促根。

图3为显微镜下木瓜百香果(Passiflora alata)的染色体状态图。

图4为不同处理的木瓜百香果染色体状态图，4-1为未采用解离前低渗处理的2个制片的染色图状态图，4-2采用ddH

图5为显微镜下木瓜百香果采用酶解法解离的2个制片的染色体图。

图6为龙珠果(Passiflora foetida)采用不同染液染色的染色体状态图；6-1中2个图片均采用20％品红染液，6-2中2个图片均采用吉氏染液，6-3中2个图片均采用结晶紫染液，6-4中2个图片采用30％品红染液。

图7为不同压片方法的紫色百香果染色体状态图，上图为无分色处理直接压片，中图为双蒸水分色后压片，下图为45％冰醋酸进行分色后压片。

图8为Passiflora tenuifila 2个不同根尖细胞的染色体状态图片。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种西番莲亚属植物水培促根培养基，其组分包括：水培营养液，吲哚丁酸2.0～4.0mg/L。其中水培营养液的组成为：大量元素和微量元素。使用的时候，其配制方法为：大量元素(四水硝酸钙945mg/L、硝酸钾506mg/L、硝酸铵80mg/L、磷酸二氢钾136mg/L、硫酸镁493mg/L)，微量元素(碘化钾0.83mg/l、硼酸6.2mg/L、硫酸锰22.3mg/L、硫酸锌8.6mg/L、钼酸钠0.25mg/L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L)。

实施例2

一种西番莲亚属植物水培促根培养方法，包括以下步骤：

选择健康的西番莲亚属植株当年生枝条，采用实施例1中制得的水培促根培养基进行水培促根，每个枝条含顶芽或1-2个节点，营养液水位以枝条插入营养液的长度3cm左右为准。培养条件为26℃，光照度4000～4500lux，水培促根培养基每3天更换一次，约3周后不定根长出。

用本实施例中方法进行水培促根，可诱导出大量的健壮的不定根，为根尖压片染色体观察提供大量的实验材料来源。

本实施例中采用紫色百香果(Passiflora edulis)、木瓜百香果(Passifloraalata)和瑞香(Passiflora‘SoiFah’)百香果为实验材料进行生根诱导，均可以诱导出大量的健壮不定根。紫色百香果为我国主栽品种，果皮完全成熟后为紫色，果肉橙黄色。木瓜百香果为果型大、果皮厚，果肉可鲜食，果皮可烹饪食用。而瑞香百香果为杂交品种，具有较好的抗逆性，然而本身不结实因而无种子。

实施例3

一种西番莲亚属植物根尖分生区染色体标本的制作方法，包括以下步骤：

(1)材料选取：选择健康的西番莲亚属植株当年生枝条进行水培促根，水培促根培养基配方为：水培营养液+吲哚丁酸2.0～4.0mg/L，培养条件为26℃，光照度4000～4500lux，水培促根培养基每3天更换一次，约3周后不定根长出。待根系伸长，选取长度1-2cm、分裂旺盛且粗壮的根尖。取材时间为上午10:00-10:30。

(2)材料预处理：剪取根尖，用纯净水将其冲洗干净后置于离心管中，0.1％的秋水仙素预处理2～4h。

(3)固定：将预处理后的材料使用纯净水冲洗3～5次，置于卡诺氏固定液(无水乙醇：冰醋酸＝3：1)中固定24h。

(4)解离前低渗处理：将根尖放入蒸馏水中浸泡3～5min，将根尖上残留的酒精彻底清除。而后用0.075mol/L KCl溶液进行解离前低渗30～40min，使水分通过细胞膜向细胞内渗入，使细胞膨胀，进而使细胞中本来已经分散的染色体更加分散。

(5)解离：将根尖用蒸馏水冲洗后，1mol/L冷HCl浸泡解离5min，然后置于60℃水浴锅中继续解离15～20min。

(6)染色：采用品红溶液染色制片；所用的品红溶液浓度为30％，加入体积以将根完全没住为准。

(7)压片：在平整的桌面上，用镊子取载玻片，用吸水纸和纱布将载玻片擦干净，放于桌面。将根尖置于载玻片上，剥去根冠，再切取1～2mm分生组织，滴加45％的冰醋酸，用镊子夹取盖玻片，将盖玻片擦干净，使其一端先接触到载玻片，然后再慢慢轻放，减少气泡产生。然后用左手手指拿吸水纸的一角压住盖玻片的一角，防止盖玻片的滑动，然后用右手拿尖嘴镊子的尖头部分轻轻敲击盖玻片，使材料分散均匀。后用吸水纸把多余的醋酸吸走。敲击的力度以不敲碎盖玻片为准。最后，将载玻片放于吸水纸上，然后将吸水纸折一下，要覆盖盖玻片，置于平整的桌面或玻璃板上，用大拇指将片子压紧，用凡士林将盖玻片四周临时封住，置于冰箱保存。

将制好的片子先在低倍镜下进行观察，发现分散良好、处于细胞分裂中期分裂相的细胞后，再逐渐转移到高倍镜镜下进行仔细观察，后用日本Nikon正置显微镜100倍油镜下观察并拍照保存。如图3所示。

采用本实施例所述的根尖分生区染色体标本的制作方法，可以用于制备西番莲亚属的植物根尖分生区染色体标本，例如西番莲亚属的木瓜百香果(Passiflora alata)、Passiflora tenuifila和龙珠果(Passiflora foetida)等，制备的染色体标本，细胞解离效果好，染色体分散，少折叠，形态清晰，着色均匀，利于观察。

一、不同促根方法对植株促根效果的比较

以台农百香果为实验材料，分别采用本发明所述的水培促根方法以及种子萌发生根的方法，比较不同促根方法效果的差异。其结果如图1所示。

其中，左图是台农百香果枝条生根情况，右图是以种子进行萌发的生根情况。从图1可以看出，采用水培促根法可以获得很多的不定根，而种子萌发仅有一条主根及零星侧根。

二、不同促根培养液对植株促根效果的比较

选择不同的促根培养基，以紫色百香果、木瓜百香果和瑞香百香果为实验材料，分别添加不同的促根培养液，采用本发明实施例2所述的促根方法，即培养条件为26℃，光照度4000～4500lux，水培促根培养液每3天更换一次。分别比较不同培养液的促根效果。其促根效果如表1和图1-2所示。

生根率(％)＝生根枝条数/实验枝条总数*100％

表1不同培养液促根效果比较

对比表1的数据和图2，以水培营养液和吲哚丁酸2.0～4.0mg/L的水培促根培养液进行促根，3个百香果品种均可以获得大量不定根，根系发达。吲哚丁酸的浓度降低(1.0mg/L)或者升高(5.0mg/L)，促根效果均明显降低。而单独水培营养液或者吲哚丁酸，不仅生根率有不同程度的降低，而且不定根数目较少。尤其是单独水培营养液，仅紫色百香果可诱导出根，木瓜百香果和瑞香百香果均无法生根。而且紫色百香果的生根部位仅集中于切口基部。单独吲哚丁酸诱导的根系较弱，且伸长缓慢。

三、制片条件的选择

木瓜百香果、龙珠果和紫色百香果是诱导出的根系比较多的品种，所以在制片条件选择的时候优先选择上述3个品种作为实验材料。

(1)解离前处理对于制片的影响

低渗是制片好坏的重要环节。解离前分别进行采用ddH

图3为采用低渗处理后木瓜百香果(Passiflora alata)根尖后，其中3个不同细胞的染色体状态图。可以看出，采用低渗处理，细胞解离效果好，染色体分散，少折叠，形态清晰，利于观察。

图4中，为不同方法处理的木瓜百香果根尖染色体状态图，其中每个处理选择2个制片拍照。

图4-1中的2个制片未采用解离前低渗处理，细胞多重叠，有胞浆背景，且染色体分散效果不好，多浓缩聚在一起，影响观察。

图4-2中的2个制片，均采用ddH

而本发明中，采用0.075mol/L氯化钾溶液进行低渗处理，细胞体积胀大、染色体松散开而便于观察分析(图3)。

(3)解离方法对制片的影响

解离的目的是用药液溶解细胞间质,使组织细胞相互分离开，解离充分是实验成功的必备条件。采用实施例3的方法制备木瓜百香果的染色体制片，解离方法分别采用1mol/L HCl酸解、2～3％纤维素酶+果胶酶(V:V＝1:1)酶解，比较不同解离方法对于制片效果的影响。图5为酶解方法制片其中的2个制片的染色体状态图片。

图5所示的2个制片，均采用酶解法解离，且经过对酶浓度(2～3％)、解离时间(20min-2h)进行多次对比试验，发现细胞膜仍受到严重破坏，染色体外溢，均难以观察到完整的细胞边界。

而图3中，采用本发明中的酸解法，细胞膜完整性较好，组织细胞较为分散，利于染色和观察。

(4)染色剂的选择对于制片的影响

采用不同的染色剂，包括30％品红、20％品红、吉氏染料、结晶紫等，以龙珠果(Passiflora foetida)为实验材料，分别进行染色，比较不同染色剂对于制片效果的影响。如图6所示(每个染色剂选择2个制片进行拍照比较)。

图6-1，20％品红：染色液渗透效果较差，染色较浅，部分未染上色；

图6-2，吉氏染料：背景蓝色，染色体着色不均匀，效果不佳；

图6-3，结晶紫：背景包括细胞均呈紫红色，染色体边缘染色深而内部染色浅的效果，且染色体凝缩折叠严重。

图6-4，采用本发明中的30％品红，染色液渗透效果好，染色体颜色深。

(5)冰醋酸处理对于制片的影响

采用45％冰醋酸、双蒸水浸泡分色处理再压片，与无分色处理直接压片进行对比，比较不同分色处理对于制片效果的影响。实验材料为紫色百香果。结果如图7所示。

如图7的上图所示，无分色处理直接压片，由于品红溶液均可与细胞质和细胞核发生作用进而染色，因此无分色处理的组织压片细胞质背景色过深，与染色体染后颜色差别不明显，不易进行染色体的观察。

用45％冰醋酸(图7下图)和双蒸水(图7中图)进行分色后压片，染色体下方及旁边的背景较浅，两者均有一定的分色效果，冰醋酸对染色体周边的背景分色效果更加显著，颜色区分十分明显。四、对于其他百香果品种的制片效果

除了上述实验中所述的木瓜百香果、龙珠果和紫色百香果，采用本发明所述的制片方法制备Passiflora tenuifila根尖染色体状态图，其中的2个制片的染色体状态如图8所示，细胞解离效果好，染色体分散，少折叠，形态清晰，利于观察。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。