基于低深度全基因组测序开发物种特异性分子标记的方法

技术领域

本发明涉及生物信息学与分子遗传育种技术领域，尤其涉及基于低深度全基因组测序开发物种特异性分子标记的方法。

背景技术

生物体的不同组织和不同发育阶段中，分子标记具有一致性，数量多，不受环境影响等特点。伴随着分子生物学的飞速发展，目前已有数十种DNA分子标记，在遗传育种、物种亲缘关系鉴定、群体遗传多样性分析、物种增殖放流评价等方面得到了广泛应用。根据分子标记的发展，可以将其分为三代，第一代以RFLP、AFLP和RAPD为代表；第二代以SSR标记和ISSR为代表；第三代分子标记为SNP、Indel标记等，这类标记的特点是数量多、范围广，便于高通量分析。SNP标记是一种基于核苷酸变异(包括插入、缺失、转换和颠换)分子标记，而Indel标记则是特指SNP标记中核苷酸插入缺失的一类标记。

鱼类是一类低等脊椎动物，在全球范围内广泛分布，目前已发现有约三万三千种。鱼类是水系生态系统中不可缺少的一部分，世界范围内分布广泛，品种繁多，仅根据外部形态特征对其进行精确识别有一定难度。近几年来，随着分子生物技术的不断发展，分子系统学也被广泛应用于鱼类系统学。采用分子生物学的方法开展鱼类物种种类鉴定，可以解决通过传统形态特征不能进行的鱼类物种种类鉴定的问题。基于分子生物学的方法开展鱼类物种种类鉴定，需要有物种特异性的分子标记，而寻找物种特异性标记则是一个费时、费力且繁琐的一项工作。本发明提供了一种基于低深度全基因组测序开发物种特异性分子标记的方法。

发明内容

本发明提出的基于低深度全基因组测序开发物种特异性分子标记的方法，解决了基于分子生物学的方法开展鱼类物种种类鉴定，需要有物种特异性的分子标记，而寻找物种特异性标记则是一个费时、费力且繁琐的一项工作的问题。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

基于低深度全基因组测序开发物种特异性分子标记的方法，包括以下步骤：

(1)全基因组测序

选取2种不同品种的物种，每个品种物种选取3个及以上个体，分别提取总基因组DNA并进行测序；

(2)物种差异性序列筛选

①对测序后原始数据，利用fastp或其他类似软件进行过滤，过滤掉包含未知字符“N”的数据；

②获得高质量的fastq测序数据后，利用BCR_LCP_GSA软件将fastq数据转换为ebwt格式，格式转换时间依据测序数据大小而有所差异，一般3小时左右即可转换完成(测序数据量大，则转化所需时间相应长)；

③格式转换后，利用ebwt2InDel软件获得物种差异性序列，分析获得物种差异性序列所需时间一般在2小时左右完成(测序数据量大，则分析所需时间相应延长)；

④基于获得的差异序列，利用primer3软件包设计InDel标记引物后，采用TouchDown PCR扩增程序对获得的InDel标记进行筛选；

(3)通过primer3软件设计引物

引物设计的参数是：退火温度：最小Tm为55℃，最大Tm为65℃；引物长度：最小长度为20，最大长度为30，引物GC含量：最小含量为40，最大含量为60，期望产物长度：80bp至160bp；

(4)TouchDown PCR扩增

采用Hotstart PCR Master Mix试剂盒对纯化的各品种物种基因组DNA进行TouchDown PCR扩增，然后通过DNA电泳采用3％浓度琼脂糖凝胶，且在常温、恒压100V下进行，最后凝胶成像。

优选的，所述步骤(1)中，在提取总基因组DNA，可采用苯酚-氯仿提取法或其他方法，在基因组DNA被定量后，用Covaris M220超声波破碎仪将DNA进行片段化，对片段化后的DNA片段进行纯化，用来构建测序文库，最后，对纯化的DNA片段利用Illumina或其他测序平台进行测序。

优选的，所述步骤(4)的扩增条件如下：

①94℃预变性3min；

②94℃30s，退火30s，72℃20s，

③重复步骤②10个循环，起始退火温度65℃，每个循环起始退火温度降低1℃；

④94℃30s，55℃退火30s，72℃20s，

⑤重复步骤④20个循环；

⑥72℃延伸5min，最后降温至4℃保存。

优选的，所述步骤(3)中退火温度：最适Tm为60℃；引物长度：最适长度为25；引物GC含量：最适含量为50。

优选的，所述步骤(2)的①步骤中fastp软件、BCR_LCP_GSA软件使用默认参数，ebwt2InDel软件中L参数设置为121，R参数设置为120，其他参数为默认。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提出了基于低深度全基因组测序开发物种特异性分子标记的方法，该方法不需要参考基因组，也不需要进行基因组组装，不仅适用于鱼类也适用于其他物种，该方法目的性强，基于ebwt2InDel软件获得物种差异性序列后，利用primer3软件设计InDel标记引物，该方法所需时间短，能快速高效获得用于物种鉴定的候选分子标记，除去后续PCR验证步骤，获得物种差异性序列只需5个小时左右。同时，该方法所需测序的数据量低，所需费用低，且该方法提高了物种特异性分子标记开发的效率,开发的物种特异性分子标记能应用于遗传学、增殖放流评估等方面的研究。

附图说明

图1为本发明实施例中SSR型InDel标记PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图。

图2为本发明实施例中InDel标记PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图。

图中：FJ:翘嘴鲌♀×三角鲂♂；ZJ：三角鲂♀×翘嘴鲌♂；SJ：三角鲂；QZ：翘嘴鲌；Marker：分子量标记。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1，基于低深度全基因组测序开发物种特异性分子标记的方法，包括以下步骤：

(1)全基因组测序

选取2种不同品种的鱼类，每个品种鱼类选取3个，分别提取总基因组DNA，在提取总基因组DNA，可采用苯酚-氯仿提取法或其他方法，在基因组DNA被定量后，用CovarisM220超声波破碎仪将DNA进行片段化，对片段化后的DNA片段进行纯化，用来构建测序文库，最后，对纯化的DNA片段利用Illumina或其他测序平台进行测序；

(2)物种差异性序列筛选

①对测序后原始数据，利用fastp或其他类似软件进行过滤，过滤掉包含未知字符“N”的数据，fastp软件、BCR_LCP_GSA软件使用默认参数，ebwt2InDel软件中L参数设置为121，R参数设置为120，其他参数为默认；

②获得高质量的fastq测序数据后，利用BCR_LCP_GSA软件将fastq数据转换为ebwt格式；

③格式转换后，利用ebwt2InDel软件获得物种差异性序列；

④基于获得的差异序列，利用primer3软件包设计InDel标记引物后，采用TouchDown PCR扩增程序对获得的InDel标记进行筛选；

(3)通过primer3软件设计引物

引物设计的参数是：退火温度：55℃；引物长度：20，最大长度为30，引物GC含量：40，期望产物长度：80bp；

(4)TouchDown PCR扩增

采用Hotstart PCR Master Mix试剂盒对纯化的各品种物种基因组DNA进行TouchDown PCR扩增，扩增条件如下：

①94℃预变性3min；

②94℃30s，退火30s，72℃20s，

③重复步骤②10个循环，起始退火温度65℃，每个循环起始退火温度降低1℃；

④94℃30s，55℃退火30s，72℃20s，

⑤重复步骤④20个循环；

⑥72℃延伸5min，最后降温至4℃保存。

然后通过DNA电泳采用3％浓度琼脂糖凝胶，且在常温、恒压100V下进行，最后凝胶成像。

实施例2，基于低深度全基因组测序开发物种特异性分子标记的方法，包括以下步骤：

(1)全基因组测序

选取2种不同品种的鱼类，每个品种鱼类选取4个，分别提取总基因组DNA，在提取总基因组DNA，可采用苯酚-氯仿提取法或其他方法，在基因组DNA被定量后，用CovarisM220超声波破碎仪将DNA进行片段化，对片段化后的DNA片段进行纯化，用来构建测序文库，最后，对纯化的DNA片段利用Illumina或其他测序平台进行测序；

(2)物种差异性序列筛选

①对测序后原始数据，利用fastp或其他类似软件进行过滤，过滤掉包含未知字符“N”的数据，fastp软件、BCR_LCP_GSA软件使用默认参数，ebwt2InDel软件中L参数设置为121，R参数设置为120，其他参数为默认；

②获得高质量的fastq测序数据后，利用BCR_LCP_GSA软件将fastq数据转换为ebwt格式；

③格式转换后，利用ebwt2InDel软件获得物种差异性序列；

④基于获得的差异序列，利用primer3软件包设计InDel标记引物后，采用TouchDown PCR扩增程序对获得的InDel标记进行筛选；

(3)通过primer3软件设计引物

引物设计的参数是：退火温度：60℃；引物长度：25，引物GC含量：50，期望产物长度：120bp；

(4)TouchDown PCR扩增

采用Hotstart PCR Master Mix试剂盒对纯化的各品种物种基因组DNA进行TouchDown PCR扩增，扩增条件如下：

①94℃预变性3min；

②94℃30s，退火30s，72℃20s，

③重复步骤②10个循环，起始退火温度65℃，每个循环起始退火温度降低1℃；

④94℃30s，55℃退火30s，72℃20s，

⑤重复步骤④20个循环；

⑥72℃延伸5min，最后降温至4℃保存。

然后通过DNA电泳采用3％浓度琼脂糖凝胶，且在常温、恒压100V下进行，最后凝胶成像。

实施例3，基于低深度全基因组测序开发物种特异性分子标记的方法，包括以下步骤：

(1)全基因组测序

选取2种不同品种的鱼类，每个品种鱼类选取5个，分别提取总基因组DNA，在提取总基因组DNA，可采用苯酚-氯仿提取法或其他方法，在基因组DNA被定量后，用CovarisM220超声波破碎仪将DNA进行片段化，对片段化后的DNA片段进行纯化，用来构建测序文库，最后，对纯化的DNA片段利用Illumina或其他测序平台进行测序；

(2)物种差异性序列筛选

①对测序后原始数据，利用fastp或其他类似软件进行过滤，过滤掉包含未知字符“N”的数据，fastp软件、BCR_LCP_GSA软件使用默认参数，ebwt2InDel软件中L参数设置为121，R参数设置为120，其他参数为默认；

②获得高质量的fastq测序数据后，利用BCR_LCP_GSA软件将fastq数据转换为ebwt格式；

③格式转换后，利用ebwt2InDel软件获得物种差异性序列；

④基于获得的差异序列，利用primer3软件包设计InDel标记引物后，采用TouchDown PCR扩增程序对获得的InDel标记进行筛选；

(3)通过primer3软件设计引物

引物设计的参数是：退火温度：60℃；引物长度：30；引物GC含量：60，期望产物长度：160bp；

(4)TouchDown PCR扩增

采用Hotstart PCR Master Mix试剂盒对纯化的各品种物种基因组DNA进行TouchDown PCR扩增，扩增条件如下：

①94℃预变性3min；

②94℃30s，退火30s，72℃20s，

③重复步骤②10个循环，起始退火温度65℃，每个循环起始退火温度降低1℃；

④94℃30s，55℃退火30s，72℃20s，

⑤重复步骤④20个循环；

⑥72℃延伸5min，最后降温至4℃保存。

然后通过DNA电泳采用3％浓度琼脂糖凝胶，且在常温、恒压100V下进行，最后凝胶成像。

实验结果：基于无参比对算法，利用ebwt2InDel软件包获得差异序列8469对，依据InDel标记中插入缺失碱基数从多到少条件，选择50对差异序列进行筛选验证，从中获得2个InDel标记可通过琼脂糖凝胶方法进行直接鉴定，其中1个为SSR型InDel标记。基于NCBI网站的BLAST程序在线比对发现，SSR型InDel标记的侧翼序列与鲤基因组的第000000136、000010225和000028867号scaffold序列片段具有较高一致性，序列一致性达到94.74％，但功能未知。另一个InDel标记BLAST搜索未获得相似序列

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。