一种生物矿化赋予骨支架生物活性及成骨性能的制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物矿化赋予骨支架生物活性及成骨性能的制备方法。

背景技术

近年来，左旋聚乳酸(PLLA)是一种具有代表性的可降解聚合物，因其原材料来源广泛，降解产物无毒性和良好的生物相容性等优点在骨修复领域受到了广泛的关注。此外，PLLA是首批美国食品与药品监督管理局(FDA)所批准的可降解医用材料。然而，PLLA本身存在缺乏生物活性，力学强度不足，与骨组织往往形成骨整合，而不能形成骨性结合，这极大地限制了它在骨修复领域的进一步应用。羟基磷灰石(HA)是骨骼的主要构成成分，钙磷比(Ca/P)为1.67，它具有加速骨再生，促进骨整合的能力，与人体硬组织、皮肤以及肌肉组织等都有良好的生物相容性，植入体内后能够与骨组织形成良好的骨键合。在基底材料表面制备HA涂层，可以通过释放钙离子和磷酸根，增强钙化，加速新骨生成，促进BMSC增殖并上调成骨分化基因的表达，赋予基底材料良好的生物相容性，成骨诱导和促进骨整合的功能。

生物矿化能在基底材料表面制备HA涂层，它是生物体产生不同功能无机物的过程，这些无机物在合成过程中受到生物体精密的调控，产生精细的微观结构，有着极为优异的力学性能。众所周知，自然界中的生物体，能够在大自然温和的条件下，对整个矿化反应过程实施高度精密的控制，实现能量、空间及原材料的充分合理利用，形成具有精美结构和优异性能的生物矿物材料，例如：牙齿、骨骼、娃藻、贝壳等。在整个生物矿化中，有机基质作为模板，调控无机矿物的形成。该方法的原理在于模拟在体液环境中于基底材料表面形成羟基磷灰石进而成骨的过程，通过将基底材料浸入模拟体液(SBF)的方式来实现。该方法中所用的SBF是人工配置的溶液，具有与体液相似的离子构成和浓度，用来模拟体液环境。生物矿化可以在温和的条件下进行HA沉积，对材料性能要求低，并且能够形成主要成分及微观结构均与人体骨骼类似的人工骨修复材料。

因此利用生物矿化可有效地赋予PLLA的生物活性，加速骨再生，促进骨整合。但如何通过有机基质调控无机物的矿化过程从而精确诱导HA的形成避免分散不均易脱落的难题仍亟需解决。

发明内容

针对PLLA作为骨支架材料缺乏生物活性和骨传导性，采用在PLLA表面形成HA层来诱导成骨，但传统的表面涂覆、接枝、等离子体改性等方法具有涂覆层容易剥落，接枝改性过程繁琐，和等离子体处理深度有限等不足的缺点，本发明用生物矿化来实现HA的涂层，并且创新性地利用PDA对PLLA进行包裹，PDA是一种常见的神经传递物质，普遍存在于动、植物体内，具有良好的生物相容性，其分子结构中含有氨基、儿茶酚基等活性官能团，也具有十分优异的粘附性能。随着人们对理想的骨修复材料的需求逐渐增大，有效提高骨修复材料的修复效果成为了生物医学领域的重大挑战，而改善骨修复材料与细胞、组织间的亲和力和粘附力则是解决这一问题的关键。PDA的发现为其指明了一条简单有效的路径。基于对PDA的结构及聚合机理的了解，对海洋贻贝能黏附在不同材质表面的特性进行模拟，通过PDA在碱性、有氧环境下的氧化自聚合，对不同基底材料仿生修饰上黏附性PDA。PDA通过自身超强的黏附性，可实现对基材表面的功能化修饰。因此多巴胺可通过自聚合反应在PLLA表面形成包裹的PDA，并利用PDA的邻苯二酷基团能有效的螯合SBF中的钙离子，从而促进HA的成核与结晶，进而在PLLA上形成尺寸形貌可控的均匀HA层。另外，利用PDA包裹层优异的亲水性、生物相容性，降低材料表面与水的接触角，提高材料表面的亲水性能，促进细胞在材料表面的粘附、扩展及增殖。。

为了实现上述目的，本发明提供了一种生物矿化赋予骨支架生物活性及成骨性能的制备方法，利用PDA包裹PLLA粉末，并通过生物矿化方式将包裹后的粉末浸泡在SBF中形成HA，然后将原位生长HA的PLLA粉末打印成型，赋予PLLA骨支架生物活性和骨传导性的方法；该方法首先利用多巴胺在碱性溶液(pH＝8.5)发生自聚合反应合成聚多巴胺包裹的PLLA(PLLA@PDA)纳米颗粒，然后利用SBF在PLLA@PDA纳米颗粒表面原位矿化生成HA层(PLLA@PDA-HA)，最后将该复合粉体经过选择性激光烧结得到PLLA@PDA-HA复合骨支架；

优选的方案，将多巴胺溶液与PLLA颗粒分散液搅拌混合，升温至60℃,加入Tris溶液，调节混合体系pH至8.5，进行恒温搅拌反应；反应完成后，固液分离，离心收集后干燥，即得PLLA@PDA粉末；在中性偏碱性环境中多巴胺易于沉积在PLLA颗粒表面，在PLLA颗粒表面生成规整的包覆层。随后，随后将PLLA@PDA粉末按预设的固液体积比置于装有1x的SBF溶液烧杯中，并在37℃的恒温水浴箱中浸泡一定时间，每天更换SBF溶液一次。最后将混合液过滤、离心、干燥后得到PLLA@PDA-HA复合粉末，所述复合粉体经过选择性激光烧结得到PLLA@PDA-HA复合骨支架。

需要注意的是，Tris溶液调节混合体系pH至8.5时，一次加入量不宜过大，否则溶液中局部pH剧烈增加。另外SBF溶液的量不宜过低，以确保提供充分的钙和磷酸根离子。

优选的方案，所述PLLA粉体的颗粒尺寸为40～60μm，熔点为175～185℃。

优选的方案，合成PLLA@PDA粉末的搅拌反应的时间为8～14h，粉末在SBF溶液里浸泡的时间为1-5天。

优选的方案，所述多巴胺溶液的浓度为1.5～3g/L。

优选的方案，液相混合过程中采用搅拌和超声的分散方式，机械搅拌的时间为20～40min，转速为800～1200r/min，温度为30～70℃；超声分散的时间为60～120min。

优选的方案，所述PLLA@PDA在SBF溶液里的浓度为0.5～1g/L。

较优选的方案，所述多巴胺溶液与所述PLLA分散液按体积比1～2:1～2混合。多巴胺与PLLA的比例最好是控制在本发明的优选范围内,已达到多巴胺充分包裹PLLA的目的。所述SBF溶液的量为5mL以上，以确保充分的钙磷沉积,形成为HA层。

较优选的方案，所述PLLA粉末的颗粒尺寸为40～60μm，熔点为175～185℃。

较优选的方案,所述选择性激光烧结的工艺条件为:激光功率为1～1.8W，扫描速度为100～200mm/min，扫描间距为1～2mm，光斑直径为0.3～1.0mm，粉床预热温度为150～165℃。

本发明提供了一种利用PDA包裹PLLA粉末，并通过生物矿化方式将包裹后的粉末浸泡在SBF中形成HA层，增强PLLA骨支架生物活性和骨传导性的方法，包括以下主要步骤：

(1)将PLLA粉末分散在去离子水中，质量浓度为0.5～1g/L，使用功率为500～1000W的超声波超声20～40min，得到PLLA颗粒的水悬浮液体系；

(2)配制一定量2g/L的PDA盐酸盐水溶液,取100mL溶液与50mL上述得到的PLLA的水溶液混合，室温下搅拌10～30min，升温，待反应液温度升至40～60℃时，加入一定量的Tris溶液，调节反应液pH值约为8.5,搅拌反应10～14h，最终得到均一的溶液，然后高速离心洗涤、干燥，获得PDA包裹的PLLA颗粒(PLLA@PDA)；

(3)利用氯化钠，碳酸氢钠，氯化钾，三水磷酸氢二钾,六水氯化镁，氯化钙，硫酸钠，三羟甲基胺烷，盐酸以及pH标准溶液，分别配制不同倍速的SBF溶液，取一定量的PLLA@PDA粉末按预设的固液体积比浸泡在配好的SBF溶液中，并在37℃的恒温水浴箱中放置一定时间，每天更换SBF溶液一次；

(4)将浸泡后的粉末用去离子水清洗后离心，转速为3000～6000r/min，然后进行固液分离收集粉末，在电热鼓风干燥箱中干燥后得到PLLA@PDA-HA粉末，主要工艺参数为:干燥温度为60℃，保温时间为24h；

(5)将复合粉末置于选择性激光烧结系统中，根据三维模型进行层层烧结，烧结完成后去除未烧结模型，即得到PLLA@PDA-HA骨支架，选择性激光烧结的工艺参数：激光功率为1～3W，扫描速度为100-200mm/s，扫描间距为0.5～2.0mm，光斑直径为0.3～0.5mm，粉层厚度为0.1～0.2mm，粉床预热温度为140～160℃。

本发明利用聚多巴胺PDA包裹左旋聚乳酸PLLA颗粒，并通过仿生矿化的方式在PLLA表面生成羟基磷灰石HA，并且通过调节浸泡液SBF溶液的浓度和浸泡时长调控羟基磷灰石层的形貌和厚度，从而赋予左旋聚乳酸PLLA优异的生物活性和骨传导性来制备骨支架的方法，该方法的优点及积极效果：

(1)利用多巴胺在碱性条件下自聚合反应机制，在PLLA表面包裹了一层具有强粘附性能的PDA。随后利用PDA的邻苯二酷基团能有效的螯合SBF中的钙离子，从而促进HA的成核与结晶，形成细小而均匀的磷灰石晶核，使得HA涂层与PLLA之间结合紧密。

(2)PDA含有大量的儿茶酚官能团，具有超强的粘附性能，并且PDA具有良好的生物相容性与优异的亲水性，能够促进细胞的信号转导，加快细胞在骨支架上增殖与分化。

(3)HA纳米颗粒在组分上与人骨的无机矿化组成相似，与人体骨的钙磷比相同，且与人体硬组织、皮肤以及肌肉组织等都有良好的生物相容性，植入体内后能够与骨组织形成良好的骨键合。在PLLA表面原位矿化形成HA涂层，可有效地赋予复合样品的生物活性和骨传导性。

(4)HA纳米颗粒可作为增强相提高PLLA的力学性能。更为重要的是，聚多巴胺诱导HA纳米颗粒在PLLA表面原位矿化的方法可有效改善HA纳米颗粒在聚合物基体中的团聚，进而强化力学性能。

附图说明：

图1为实施例1制得的样品细胞培养1,3,5天后的细胞活死染色的荧光图，其中绿色和红色分别代表活细胞和死细胞。显然，所有PLLA@PDA-HA支架上的细胞数量随着培养时间的增加而增加。培养5天后，支架中几乎没有死细胞，这证明支架表现出非细胞毒性。

图2为实施例1制得的样品细胞培养12,14,16天后的茜素红染色图。矿化结节是成骨细胞分化的标志物和成熟，也是主要的形态表现成骨细胞具有成骨功能。通过茜素红染色评估矿化结节，因为茜素红可以与钙离子相互作用形成红色。这染色图像如图2所示，可以发现，在PLLA@PDA-HA支架上培养的细胞的矿化结节随着培养时间的增加，染色颜色的深度随之明显增加。因此，PLLA@PDA-HA有成骨分化的功能。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式作进一步描述，但本发明之内容并不局限于此。

实施例1：

将PLLA粉末分散在去离子水中，质量浓度为0.5g/L，使用功率为500W的超声波超声20min，得到PLLA的水悬浮液；配制一定量2g/L的PDA盐酸盐水溶液,取100mL溶液与50mL上述得到的PLLA水溶液混合，室温下搅拌50min，升温，待反应液温度升至40℃时，逐滴加入一定量Tris溶液，调节反应液pH值约为8.5，搅拌反应12h，最终得到均一的溶液，然后高速离心洗涤、干燥得到PDA包裹的PLLA复合粉末(PLLA@PDA)；

利用氯化钠，碳酸氢钠，氯化钾，三水磷酸氢二钾六水氯化镁，氯化钙，硫酸钠，三羟甲基胺烷，盐酸以及pH标准溶液，配制1.5x的SBF溶液，利用电子天平称取0.2克的PLLA@PDA粉末按预设的固液体积比10％浸泡在配好的SBF溶液中，并在37℃的恒温水浴箱中放置1天，每天更换SBF溶液一次；

将浸泡后的粉末用去离子水清洗后离心，转速为3000～6000r/min，然后进行固液分离收集粉末，在电热鼓风干燥箱中干燥后得到PLLA@PDA-HA粉末，主要工艺参数为：干燥温度为60℃，保温时间为24h；

将复合粉末置于选择性激光烧结系统中，根据三维模型进行层层烧结，烧结完成后去除未烧结模型，即得到PLLA@PDA-HA骨支架，选择性激光烧结的工艺参数：激光功率为1.8W，扫描速度为120mm/s，扫描间距为1mm，光斑直径为0.3mm，粉层厚度为0.1mm，粉床预热温度为150℃；

经矿化性能测试发现，PLLA@PDA-HA样品相比PLLA样品表现出优异的矿化能力，形成了少量的HA层；

经力学性能测试发现，PLLA样品的压缩强度和模量分别为25.2MPa，2.4GPa；PLLA@PDA-HA样品的压缩强度和模量分别为36.8MPa，3.5GPa；

经细胞活性测试发现，PLLA@PDA-HA样品上的细胞在培养7天后，其粘附在样品的形貌、细胞增殖速率和细胞分化能力明显优于培养在PLLA样品上的细胞；

Micro-CT检测和骨组织的Van-Gieson染色说明PLLA@PDA-HA样品相比PLLA样品表现出更好的诱导成骨能力。

实施例2：

将PLLA粉末分散在去离子水中，质量浓度为0.5g/L，使用功率为500W的超声波超声20min，得到PLLA的水悬浮液；配制一定量2g/L的PDA盐酸盐水溶液，取100mL溶液与50mL上述得到的PLLA水溶液混合，室温下搅拌50min，升温，待反应液温度升至40℃时，逐滴加入一定量Tris溶液，调节反应液pH值约为8.5，搅拌反应12h，最终得到均一的溶液，然后高速离心洗涤、干燥得到PDA包裹的PLLA复合粉末(PLLA@PDA)；

利用氯化钠，碳酸氢钠，氯化钾，三水磷酸氢二钾六水氯化镁，氯化钙，硫酸钠，三羟甲基胺烷，盐酸以及pH标准溶液，配制2x的SBF溶液，利用电子天平称取0.2克的PLLA@PDA粉末按预设的固液体积比10％浸泡在配好的SBF溶液中，并在37℃的恒温水浴箱中放置1天，每天更换SBF溶液一次；

将浸泡后的粉末用去离子水清洗后离心，转速为3000～6000r/min，然后进行固液分离收集粉末，在电热鼓风干燥箱中干燥后得到PLLA@PDA-HA粉末，主要工艺参数为:干燥温度为60℃，保温时间为24h；

将复合粉末置于选择性激光烧结系统中，根据三维模型进行层层烧结，烧结完成后去除未烧结模型，即得到PLLA@PDA-HA骨支架，选择性激光烧结的工艺参数：激光功率为1.8W，扫描速度为120mm/s，扫描间距为1mm，光斑直径为0.3mm，粉层厚度为0.1mm，粉床预热温度为150℃；

经矿化性能测试发现，PLLA@PDA-HA样品相比PLLA样品表现出优异的矿化能力，形成了部分HA层；

经力学性能测试发现，PLLA@PDA-HA样品的压缩强度和模量分别为38.8MPa，3.6GPa；

经细胞活性测试发现，PLLA@PDA-HA样品上的细胞在培养7天后，其粘附在样品的形貌、细胞增殖速率和细胞分化能力明显优于培养在PLLA样品上的细胞；

Micro-CT检测和骨组织的Van-Gieson染色说明PLLA@PDA-HA样品相比PLLA样品表现出更好的诱导成骨能力。

实施例3：

除配制2.5x的SBF溶液，其他实验步骤除与上述实施例1一致。

经矿化性能测试发现，PLLA@PDA-HA样品相比PLLA样品表现出优异的矿化能力，形成了部分HA层；

经力学性能测试发现，PLLA@PDA-HA样品的压缩强度和模量分别为40.3MPa，3.9GPa；

经细胞活性测试发现，PLLA@PDA-HA样品上的细胞在培养7天后，其粘附在样品的形貌、细胞增殖速率和细胞分化能力明显优于培养在PLLA样品上的细胞；

Micro-CT检测和骨组织的Van-Gieson染色说明PLLA@PDA-HA样品相比PLLA样品表现出更好的诱导成骨能力。

实施例4：

除配制3x的SBF溶液,其他实验步骤除与上述实施例1一致。

经矿化性能测试发现，PLLA@PDA-HA样品相比PLLA样品表现出优异的矿化能力，形成了较多的HA层；

经力学性能测试发现，PLLA@PDA-HA样品的压缩强度和模量分别为42.3MPa，4.1GPa；

经细胞活性测试发现，PLLA@PDA-HA样品上的细胞在培养7天后，其粘附在样品的形貌、细胞增殖速率和细胞分化能力明显优于培养在PLLA样品上的细胞。

Micro-CT检测和骨组织的Van-Gieson染色说明PLLA@PDA-HA样品相比PLLA样品表现出更好的诱导成骨能力。

对比例1：

除浸泡时间改为3天,其他实验步骤除与实施例1一致。

经矿化性能测试发现，PLLA@PDA-HA样品相比PLLA表现出优异的矿化能力，形成了较多的HA层。

经力学性能测试发现，PLLA@PDA-HA样品的压缩强度和模量分别为38.3MPa，3.4GPa，相比实施例1压缩强度和模量分别提高45.0％。36.8MPa，3.5GPa；

经细胞活性测试发现，PLLA@PDA-HA样品上的细胞在培养7天后，其粘附在样品的形貌、细胞增殖速率和细胞分化能力明显优于培养在PLLA样品上的细胞。

Micro-CT检测和骨组织的Van-Gieson染色说明PLLA@PDA-HA样品相比PLLA样品表现出更好的诱导成骨能力。

对比例2：

除浸泡时间改为5天,其他实验步骤除与实施例1一致。

经矿化性能测试发现，PLLA@PDA-HA样品相比PLLA表现出优异的矿化能力，形成了较致密的HA层。

经力学性能测试发现，PLLA@PDA-HA样品的压缩强度和模量分别为42.3MPa，4.1GPa，相比实施例2压缩强度和模量分别提高45.0％。36.8MPa，3.5GPa；

经细胞活性测试发现，PLLA@PDA-HA样品上的细胞在培养7天后，其粘附在样品的形貌、细胞增殖速率和细胞分化能力明显优于培养在PLLA样品上的细胞。

Micro-CT检测和骨组织的Van-Gieson染色说明PLLA@PDA-HA样品相比PLLA样品表现出更好的诱导成骨能力。

对比例3：

除浸泡时间改为3天,其他实验步骤除与实施例2一致。

经矿化性能测试发现，PLLA@PDA-HA样品相比PLLA表现出优异的矿化能力，形成了较致密的HA层。

经力学性能测试发现，PLLA@PDA-HA样品的压缩强度和模量分别为42.3MPa，4.1GPa，相比实施例2压缩强度和模量分别提高45.0％。

经细胞活性测试发现，PLLA@PDA-HA样品上的细胞在培养7天后，其粘附在样品的形貌、细胞增殖速率和细胞分化能力明显优于培养在PLLA样品上的细胞。

Micro-CT检测和骨组织的Van-Gieson染色说明PLLA@PDA-HA样品相比PLLA样品表现出更好的诱导成骨能力。

对比例4：

除浸泡时间改为5天,其他实验步骤除与实施例2一致。

经矿化性能测试发现，PLLA@PDA-HA样品相比PLLA表现出优异的矿化能力，形成了致密的HA层。

经力学性能测试发现，PLLA@PDA-HA样品的压缩强度和模量分别为42.3MPa，4.1GPa，相比实施例2压缩强度和模量分别提高45.0％。

经细胞活性测试发现，PLLA@PDA-HA样品上的细胞在培养7天后，其粘附在样品的形貌、细胞增殖速率和细胞分化能力明显优于培养在PLLA样品上的细胞。

Micro-CT检测和骨组织的Van-Gieson染色说明PLLA@PDA-HA样品相比PLLA样品表现出更好的诱导成骨能力。

对比例5：

除浸泡时间改为3天,其他实验步骤除与实施例3一致。

经矿化性能测试发现，PLLA@PDA-HA样品相比PLLA表现出优异的矿化能力，形成了较致密均匀的HA层。

经力学性能测试发现，PLLA@PDA-HA样品的压缩强度和模量分别为42.3MPa，4.1GPa。

经细胞活性测试发现，PLLA@PDA-HA样品上的细胞在培养7天后，其粘附在样品的形貌、细胞增殖速率和细胞分化能力明显优于培养在PLLA样品上的细胞。

Micro-CT检测和骨组织的Van-Gieson染色说明PLLA@PDA-HA样品相比PLLA样品表现出更好的诱导成骨能力。

对比例6：

除浸泡时间改为5天,其他实验步骤除与实施例3一致。

经矿化性能测试发现，PLLA@PDA-HA样品相比PLLA表现出优异的矿化能力，形成了大量致密而均匀的HA层。

经力学性能测试发现，PLLA@PDA-HA样品的压缩强度和模量分别为42.3MPa，4.1GPa。

经细胞活性测试发现，PLLA@PDA-HA样品上的细胞在培养7天后，其粘附在样品的形貌、细胞增殖速率和细胞分化能力明显优于培养在PLLA样品上的细胞。

Micro-CT检测和骨组织的Van-Gieson染色说明PLLA@PDA-HA样品相比PLLA样品表现出更好的诱导成骨能力。