通过去除叶酸受体蛋白来重新定义家畜奶以减少妊娠和孤独症患者的叶酸受体自身免疫障碍

技术领域

本发明涉及不含叶酸受体(FR)的奶的用途。奶中存在的叶酸受体可以诱导抗人叶酸受体的自身抗体的形成，其可以引起叶酸敏感性异常，诸如出生缺陷(例如，神经管缺陷，即NTD)、不孕症、自发性流产、雄性不育、体外受精失败、神经障碍、神经发育延迟以及神经精神疾病，诸如脑叶酸缺乏或孤独症谱系障碍。本发明涉及产生奶(来自牛、山羊和其它用于生产供人类消费的奶的家畜)，其中通过提取去除叶酸受体或从工程化动物中产生叶酸受体，其中沉默或抑制叶酸受体在乳腺中的表达，从而防止生产和分泌至奶中。

背景技术

本发明一般涉及不含叶酸受体(FRF)的奶和奶制品的生产。暴露于非人奶或含有非人叶酸受体的奶制品可以产生抗人叶酸受体/叶酸结合蛋白(FR/FBP)的自身抗体，其可以阻断叶酸盐或叶酸从母亲转运到胎儿和婴儿大脑中(Rothenberg et al,2004；Ramaekers et al 2005)。

叶酸对于正常胚胎发育是必需的，因为它参与合成高度增殖的胚胎细胞所需的核酸和氨基酸的一碳代谢(Lucock,Mal.Genet.Metab.71:121(2000))。母体营养已经将叶酸摄入与NTD的预防联系起来(Hibbard and Smithells,Obstet.Gynaecol.Br.Commonwealth71:529(1964)；Hibbard and Smithells,Lancet l,1254(1965)；Smithall et al.,Arch.Dis.Child 51:944(1976))，并且在妊娠期间补充叶酸是目前的常见做法。然而，许多NTD或其它出生异常的病例发生在未表现出临床叶酸缺乏迹象的母亲中，这促使研究人员去鉴定损害细胞代谢或叶酸摄取的其它原因。虽然已经鉴定了许多遗传原因，但这些基因仅占出生缺陷的一小部分(van der Put et al.,Exp.Biol.Med.(Maywood),226:243(2001))。

在现有专利公开(US 7,846,672)中，Dr.Edward Quadros描述了叶酸敏感性障碍的发现，诸如不孕症、自发性流产、体外受精失败或出生缺陷，该叶酸敏感性障碍是由于抗叶酸受体的自身抗体干扰了叶酸的摄取。另外，它们描述了检测这些叶酸受体的自身抗体的试验。

随后的研究表明，超过70％的患有孤独症谱系障碍(ASD)的儿童的FR抗体呈阳性(Frye et al.,Mol.Psych.18:369-381,(2013))。这些抗体可以阻断叶酸转运至大脑。值得注意的是，我们显示了这些FR抗体与来自牛奶的FR强烈反应(Ramaekers et al.2009)。牛奶含有大量(1-3ug/ml)叶酸受体α[FR]，其属于涉及叶酸转运的一组叶酸结合蛋白[FBP]。因为人和牛FR在结构上相似，所以分子拟态可能解释了交叉反应性。

许多报告显示了患有ASD的儿童比未受ASD影响的比较组更可能用奶瓶喂养或提前断奶。这表明提前引入牛或非人哺乳动物奶会增加ASD和相关神经缺陷的风险。在早期发育期间摄入常规牛奶已经涉及促成或引起孤独症和其它神经缺陷。应当相信，这与叶酸代谢的破坏有关，因为叶酸是胎儿和婴儿发育期间必需的营养物。为了引入更多的膳食叶酸，已经引入了若干“叶酸增强的”奶制品，尽管它们的益处还没有得到证明。

Dr.Edward Quadros最近发表的工作提供了明确的证据，证明叶酸受体自身抗体普遍存在于诊断为孤独症谱系障碍的儿童、他们正常的兄弟姐妹和父母中(Ramaekers etal.,Mol Psych.18:270-271(2013)；Frye et al.,Mol Psysch.18:369-381,(2013))。在患有ASD并且还表达FR自身抗体的儿童中使用高剂量亚叶酸治疗的干预策略已被证明对学习缺陷和行为改善是有益的(Frye et al.,Mol.Psych.23:247-256,(2018))。正在进行进一步的多中心临床试验。

尽管高剂量亚叶酸为有认知缺陷和FR抗体的儿童提供了治疗性治疗，但它不能消除引发抗FR的自身抗体形成的损害。在FR抗体阳性的儿童中，不含奶的饮食降低了抗体滴度(Ramaekers et al.2009)，但是该饮食极具限制性并且难以遵守。

孤独症谱系障碍是影响沟通、社会交往和行为的发育障碍。ASD的症状通常在生命的头两年后是明显的，其特征在于：与他人沟通和交往困难；很少感兴趣和行为重复；伤及人在学校、工作和其它生活领域正常工作的能力的症状。孤独症是一种“谱系”，因为人们经历的症状类型和严重程度有很大的变化。CDC估算在美国，59个个体中就有1个(约1-2％)受ASD影响。虽然在中国的比率是完全记录的，但估算100个儿童中就有1个可能受到影响(Wang et al.Int J Biol Sci.2018；14(7):717-725)。在世界的大部分地区，该比率在1/55至1/200之间变化。

尽管遗传和环境因素已被认为与ASD相关，但还不知道ASD的病因。

食物过敏在患有ASD的儿童中更普遍，其中11.25％具有过敏症，而在约200,000名儿童的研究中为4.25％。还更频繁地报道了在儿童中的自身免疫状况。新的“脆弱的肠道”假说描述了一些肠道吸收受损的儿童可能如何产生针对其叶酸受体的自身抗体，并且这可能导致ASD的症状。叶酸是胎儿和新生儿神经发育所必需的，最近已在ASD患者中鉴定出了叶酸代谢的破坏。

图1A示出了正常健壮的肠道。蛋白质和单糖的健康消化发生在小肠中，使营养物容易吸收。纤维和未消化的蛋白质由细菌消耗。血液不与肠腔相互作用，防止了免疫细胞和食物抗原分子之间的任何相互作用。

图1B示出了脆弱的肠道。患有ASD的儿童表现出消化能力下降。肠道内膜的炎症和恶化阻碍了蛋白质和糖的正常消化。炎症导致血液与肠直接接触，进而允许肠中未消化的蛋白质直接进入血流和/或暴露于GALT(肠相关淋巴组织)和MALT(粘膜相关淋巴组织)。这允许不需要地暴露于免疫组织内的抗原蛋白，以激发免疫应答。

脆弱的肠道可能会产生针对在牛奶中分泌的牛奶蛋白(包括叶酸受体)(1-2ug/ml)的自身抗体。从患有ASD的儿童中分离的抗叶酸受体抗体显示出与牛奶中的牛叶酸受体有强烈的交叉反应。当儿童食用不含奶的饮食时，抗体浓度显著降低。不含奶很难遵守。

叶酸是大脑发育期间的许多过程所需的。图2示出了叶酸代谢，其在ASD患者中通常是异常的。患有ASD的儿童中的70％具有阻断叶酸受体并且阻碍细胞中叶酸摄取的自身抗体(Frye,R.E.et al.Cerebral folate receptor autoantibodies in autismspectrum disorder.Mol Psych,2013)。妊娠期期间的孕鼠和断奶期间的幼仔暴露于叶酸受体抗体会引起严重的行为缺陷(Sequiera,J.M.et al.Plos one,2016)。

叶酸缺乏症可以用叶酸的还原形式亚叶酸来纠正，亚叶酸可以经由过脉络丛进入大脑，而不依赖于叶酸受体。叶酸缺乏症可以用高剂量亚叶酸来纠正，亚叶酸不修复损伤，但是可以恢复脑叶酸以治疗ASD的症状。叶酸缺乏症可以通过恢复大脑叶酸来纠正，其在ASD儿童的语言和社会交往方面产生临床改善。

本发明旨在解决叶酸受体自身免疫障碍的病因，并且预防其病理性后果。

发明内容

本申请提供了从哺乳动物来源生产不含叶酸受体(FRF)的奶的试验和方法。该方法和系统部分地在以下描述中阐述，并且部分地将从描述中显而易见，或可以通过实践方法、设备和系统来学习。该方法和系统的优点将通过所附权利要求中特别指出的要素和组合来实现和获得。应当理解，前面的一般性描述和下面的详细描述都仅仅是示例性和说明性的，而不是对所要求保护的方法和系统的限制。

附图说明

在附图中，在本发明的若干优选实施方案中，相同的元件由相同的附图标记表示。

图1A是示出正常健壮的肠道的示意图。

图1B是示出脆弱的肠道的示意图。

图2是示出叶酸代谢的示意图。

图3是示出不含叶酸受体(FRF)的奶产生牛并且降低ASD比率的系统的示意图。

图4是牛成纤维细胞系统中敲低叶酸受体的示意图。

图5是细胞核移植产生转基因牛系统的示意图。

图6是示出群组扩展和奶分析系统的示意图。

图7是列出待测文库中shRNA的表。

具体实施方式

从以下结合附图阅读的示例性实施方案的详细描述中，本发明的前述以及其它特征和优点是显而易见的。详细描述和附图仅仅是对本发明的说明而不是限制，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

现在将参照附图描述本发明的实施方案，其中相同的数字始终反映相同的元件。本申请给出的描述中使用的术语不旨在以任何限制性或约束性的方式来解释，仅因为其与本发明的某些具体实施方案的详细描述结合使用。此外，本发明的实施方案可以包括若干新特征，其中没有单个特征单独负责其所需属性或对于实践本申请所述的发明是必要的。术语近端和远端在本申请中用于表示本申请所述仪器的部件的特定端部。近端是指当使用仪器时，仪器的端部更靠近仪器的操作者。远端是指远离操作者并且朝向患者和/或植入物的手术区域延伸的部件的端部。

在描述本发明的上下文中使用的术语“一个”、“一种”和“该”以及类似的指示物将解释为涵盖单数和复数，除非本申请另有说明或与上下文明显矛盾。还将进一步理解，术语“包括(comprises、comprising、includes和/或including)”在本申请中使用时指定所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件的存在，但不排除一个或多个其它特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或其组合的存在或添加。

除非本申请另有说明，否则本申请中数值范围的列举仅旨在用作单独提及落在范围内的每个单独值的速记方法，并且每个单独值并入本说明书中，如同其在本申请中单独列举一样。当伴随数值时，词语“约”将解释为表示与所述数值的偏差多达并且包括10％。本申请提供的任何和所有实施例或示例性术语(“例如”或“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对本发明的范围构成限制，除非另有声明。本说明书中的语言不应解释为表明任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必要的。

对“一个实施方案”、“实施方案”、“示例实施方案”、“各种实施方案”等的引用可以表明如此描述的本发明的实施方案可以包括特定特征、结构或特性，但并非每个实施方案都必须包括该特定特征、结构或特性。此外，短语“在一个实施方案中”或“在示例性实施方案中”的重复使用不一定是指相同的实施方案，尽管它们可以指相同的实施方案。

如本申请所用，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的或易于从已知方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。除非另有明确说明，否则决不旨在将本申请阐述的任何方法或方面解释为要求以特定顺序执行其步骤。因此，在方法权利要求没有在权利要求或说明书中具体陈述步骤将限制为特定顺序的情况下，在任何方面决不旨在推断顺序。这对于任何可能的未表达的解释基础均成立，包括关于步骤或操作流程的安排的逻辑问题、衍生自语法组织或标点符号的普通含义，或在本说明书中描述的方面的数量或类型。

除非另有说明，本发明的实践采用本领域技术人员熟知的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术。参见Sambrook,Fritsch and Maniatis,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,2nd edition(1989)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel,et al.eds.,(1987))；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press,Inc.):PCR 2:A PRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson,B.D.Hames and G.R.Taylor eds.(1995)),Harlow and Lane,eds.(1988)ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL,and ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney,ed.(1987))。

一个实施方案是设计用于从现有奶或奶制品中去除叶酸受体的试验。不含叶酸受体(“FRF”)的奶可以进一步用于产生由构成本发明一部分的FRF奶加工的产品，其衍生自散装奶源(即来自多于一种动物的奶)并且包括但不限于：散装奶；用于制作奶酪的散装奶，无论奶在制作奶酪之前是否经过巴氏消毒、灭菌或其它减少微生物种群的处理；奶粉、奶固体；酪蛋白、酪蛋白酸盐和酪蛋白水解产物；巴氏消毒、灭菌、防腐的奶，包括微滤奶、UHT奶；低脂奶；改良或增强型奶；冰淇淋或其它冷冻的基于乳制甜食；发酵奶制品，诸如酸奶或凝乳；奶酪，包括全脂、部分脱脂以及脱脂的加工奶酪；奶乳清；通过添加奶制品(诸如汤)富集的食品；已除去潜在过敏原分子的奶；甜食，诸如巧克力；碳酸化奶制品，包括添加磷酸盐和/或柠檬酸盐的那些；婴儿配方，其可以包含全脂、部分脱脂或脱脂奶以及许多额外的补充剂；液体或粉状饮料混合物，以及酪乳和酪乳粉。

在本发明的该方面是设计用于从任何奶制品中去除FR的试验。方法包括但不限于尺寸排阻色谱、糖基磷脂酰肌醇(GPI)捕获柱亲和色谱、叶酸受体结合抗体亲和柱色谱、使用附着于FR结合抗体的蛋白酶的叶酸受体的特异性消化、用以去除FR的奶制品的分馏，以及使用特异性结合奶中叶酸受体的配体的亲和色谱。

牛奶蛋白的尺寸排阻色谱或分馏：FR蛋白的38kDa尺寸可以允许通过选择性地排除38kDa FR蛋白或包括38kDa FR蛋白的膜或多种膜对奶进行超滤，从而耗尽FR蛋白奶。该相同的原理可以应用于使用尺寸排阻和尺寸包含柱(诸如Sephadex 100或Sephacryl S-200)来耗尽FR奶。

叶酸受体结合抗体亲和柱色谱：可以将针对牛、山羊或其它动物叶酸受体产生的抗体(多克隆或单克隆)固定在惰性固体基质(诸如琼脂糖或Sepharose)上，并且与奶混合以从奶中捕获FR抗原，从而选择性从奶中去除FR抗原。可以将针对来自LSBio的牛FOLR1/叶酸受体α的山羊多克隆抗体缀合至柱色谱。

除非另有说明，如本申请所用，术语“叶酸受体”、“FR”或“FOLR1”是指任何天然牛或山羊FOLR1。术语“FR”包括“全长”、未加工的FR以及由细胞内加工产生的任何形式的FR。该术语还包括天然存在的FR变体，例如，剪接变体、等位基因变体和同种型。本申请所述的FR蛋白可以从多种来源分离出来，诸如从人体组织类型或从另一来源分离，或通过重组或合成方法制备。靶向来自牛、大鼠、山羊和人的叶酸受体的蛋白序列和Blast标识号的抗体如下：

转录物ID：FOLR1-203 ENST00000393679.5

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转录物ID：Folr1-202 ENSRNOT00000079675.1

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NCBI BLAST

登录号：AAB05827

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登录号AAI57812

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登录号AGA95980

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靶向山羊FR蛋白序列的抗体包括靶向SEQ ID NO：8的那些：mpwkltplllflgwmtsvcn artrtdllnv cmdakhhkae pgpedklhnq ctpwkknacc sarvsqelhk dtsslynftwdhcgkmepac qrhfiqdncl yecspnlgpw iqevnqkwrk erflnvplck edcqswwedc rtshtcksnwhrgwdwtsgs nkcpngttcr tfeayfptpaalceglwshs yklsnysrgs grciqmwfdp algnpneevarfyasaltae awpqgirplslclalmlslw lhd

术语“抗体”是指通过免疫球蛋白分子可变区内的至少一个抗原识别位点识别并特异性结合靶标的免疫球蛋白分子，靶标诸如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述物质的组合。如本申请所用，术语“抗体”包括完整多克隆抗体、完整单克隆抗体、抗体片段(诸如Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段)、单链Fv(scFv)突变体、多特异性抗体(诸如由至少两种完整抗体产生的双特异性抗体)、嵌合抗体、牛抗体、山羊抗体、包含抗体的抗原决定部分的融合蛋白，以及包含抗原识别位点的任何其它经修饰的免疫球蛋白分子，只要抗体展示出所需生物活性即可。抗体可以是5大类免疫球蛋白中的任一种：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其亚类(同种型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)，基于它们的重链恒定区的同一性，分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类型的免疫球蛋白具有不同的和众所周知的亚基结构和三维构型。抗体可以是裸露的或与其它分子(诸如毒素类、放射性同位素等)缀合。

术语“结合FR的抗体”是指能够以足够的亲和力结合FR的抗体，使得该抗体可用作靶向FR的过滤剂或结合剂。抗FR抗体与不相关的非FR蛋白的结合程度小于例如，通过放射免疫测定(RIA)测量的抗体与FR结合的约10％。在某些实施方案中，结合FR的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM的解离常数(Kd)。

“单克隆抗体”是指参与单个抗原决定簇或表位的高度特异性识别和结合的同质抗体群。这与通常包括针对不同抗原决定簇的不同抗体的多克隆抗体相反。术语“单克隆抗体”包括完整和全长单克隆抗体，以及抗体片段(诸如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、单链(scFv)突变体、包含抗体部分的融合蛋白，以及包含抗原识别位点的任何其它经修饰的免疫球蛋白分子。此外，“单克隆抗体”是指以多种方式制备的此类抗体，包括但不限于通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达以及转基因动物。

使用附着于FR结合抗体的蛋白酶特异性消化叶酸受体。还可以将蛋白酶(诸如胰蛋白酶或羧肽酶)附着于FR特异性抗体上，并且使用它来选择性消化FR蛋白，从而使其抗原性降低。

如本申请所用，术语“蛋白酶(protease、proteinase)”是指具有分解其它蛋白质的能力的酶蛋白质。蛋白酶具有进行“蛋白水解”的能力，其通过水解肽键开始蛋白质分解代谢，该肽键将形成蛋白质的肽或多肽链中的氨基酸连接在一起。蛋白酶作为蛋白质消化酶的这种活性称为“蛋白水解活性”。存在许多众所周知的用于测量蛋白水解活性的程序(参见例如，Kalisz,“Microbial Proteinases,”In:Fiechter(ed.),Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology,(1988))。例如，蛋白水解活性可以通过分析相应蛋白酶水解市售底物的能力的比较试验来确定。可用于分析蛋白酶或蛋白水解活性的示例性底物包括但不限于二甲基酪蛋白(Sigma C-9801)、牛胶原蛋白(Sigma C-9879)、牛弹性蛋白(Sigma E-1625)以及牛角蛋白(ICN Biomedical 902111)。利用这些底物的比色测定是本领域众所周知的(参见例如，WO 99/34011和美国专利第6,376,450号，其两者通过引用并入本申请)。pNA试验(参见例如，Del Mar et al.,Anal.Biochem.99:316-320)也发现用于确定梯度洗脱期间收集的级分的活性酶浓度。该试验测量了当酶水解可溶性合成底物琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺(suc-AAPF-pNA)时，释放对硝基苯胺的速率。水解反应产生黄色的速率在分光光度计上在410nm处测量，并且与活性酶浓度成比例。另外，280纳米(nm)处的吸光度测量值可以用于确定总蛋白质浓度。活性酶/总蛋白的比值给出了酶纯度。

使用特异性结合奶中叶酸受体的配体的亲和色谱。配体(诸如叶酸)以高亲和力(Kd约100pM)结合FR，因此将叶酸固定在惰性基质(诸如琼脂糖或Sepharose)上并与含有apo受体的奶混合将允许受体结合叶酸，然后可以从奶中去除。

如本申请所用的“叶酸”是指叶酸、叶酸类似物或另一叶酸受体结合分子。可以使用的叶酸类似物包括亚叶酸、蝶酰聚谷氨酸(pteropolyglutamic acid)以及叶酸受体结合蝶啶，诸如四氢蝶呤、二氢叶酸、四氢叶酸及其脱氮和二脱氮类似物。术语“脱氮”和“二脱氮”类似物是指在天然存在的叶酸结构中碳原子取代一个或两个氮原子的本领域公认的类似物。例如，脱氮类似物包括1-脱氮、3-脱氮、5-脱氮、8-脱氮以及10-脱氮类似物。二脱氮类似物包括例如1,5二脱氮、5,10-二脱氮、8,10-二脱氮以及5,8-二脱氮类似物。前述叶酸类似物通常称为“叶酸”，反映了它们结合叶酸受体的能力。其它叶酸受体结合类似物包括氨基蝶呤、氨甲蝶呤(甲氨蝶呤)、N10-甲基叶酸、2-脱氨基-羟基叶酸、脱氮类似物(诸如1-脱氮甲氨蝶呤或3-脱氮甲氨蝶呤)，以及3’,5’-二氯-4-氨基-4-脱氧-N10-甲基蝶酰谷氨酸(二氯甲氨蝶呤)。

“高亲和力”可以是约Kd＝10

FRF奶的验证：

1.功能性FR的3H叶酸结合试验。

奶样品将与放射性叶酸一起温育30min，随后使用葡聚糖包被的炭将蛋白结合的叶酸从游离叶酸中分离。该方法足够灵敏以检测结合的叶酸的皮克(picogram)，并且将提供奶中功能性叶酸受体的测量。

2.奶中可能存在一些非功能性FR抗原。这将通过用于检测FR抗原的基于连续ELISA的试验来测量。

对于该试验，ELISA板组将涂覆有FR抗体。一组将与已知量的FR抗原一起温育，以产生标准曲线。另一组将与不同量的FRF奶一起温育。该第一次温育可以是持续数小时至过夜。我们将向两组中加入用3H叶酸饱和的FR抗原，然后温育20min。试验的原理是基于随着第一次温育中抗原浓度的增加，与板中的抗体结合的3H叶酸减少。FRF奶中的抗原也将遵循相同的原则，并且允许我们确定FRF奶中是否仍然存在抗原的任何无功能片段。

3.奶的Western印迹检测FR抗原。

不含FR的奶的验证如下：

1.功能性FR的3H叶酸结合试验。

将奶样品与放射性叶酸一起温育30min，随后使用葡聚糖包被的炭将蛋白结合的叶酸从游离叶酸中分离。该方法足够灵敏以检测结合的叶酸的皮克(picogram)，并且提供奶中功能性叶酸受体的测量。

2.奶中可能存在一些非功能性FR抗原。这将通过用于检测FR抗原的基于连续ELISA的试验来测量。

对于该试验，ELISA板组涂覆有FR抗体。一组与已知量的FR抗原一起温育，以产生标准曲线。另一组与不同量的FRF奶一起温育。该第一次温育可以是约数小时至约24小时。向两组中加入用3H叶酸饱和的FR抗原，然后温育约20min。试验的原理是基于随着第一次温育中抗原浓度的增加，与板中的抗体结合的3H叶酸减少。FRF奶中的抗原也遵循相同的原则，以确定FRF奶中是否仍然存在抗原的任何无功能片段。

3.奶的Western印迹检测FR抗原。

使用抗FR的抗体进行Western印迹分析。对于这些实验，样品在具有或不具有20mMDTT的1×SDS-PAGE加样缓冲液(Invitrogen)中温育，煮沸10min，并且在4-12％梯度SDS-PAGE凝胶上电泳。将蛋白质转移至PVDF膜上，并且如上所述探测印迹。使用Benchmark

在其它实施方案中，FR的水平通过放射免疫测定、免疫荧光测定、免疫沉淀、平衡透析、免疫扩散、电化学发光(ECL)免疫测定、免疫组织化学、荧光激活细胞分选法(FACS)或其它ELISA试验来确定。

在另一实施方案中是工程化生产FRF奶的牛和山羊的方法。使用基因工程方法引入RNAi触发物以特异性沉默乳腺中牛叶酸受体的表达，可以通过对这些遗传修饰的牛的后代进行挤奶来获得牛FRF奶制品。该实施方案包括RNAi方法，其包括：鉴定靶向牛叶酸受体的多个shRNA；创建多个乳房特异性shRNA表达构建体；使用转导方法将多个乳房特异性shRNA表达构建体插入到多个牛成纤维细胞中；使用成纤维细胞的体细胞移植来产生牛；以及验证牛生产的奶中叶酸受体的耗尽。另一实施方案是RNAi方法，其包括：鉴定靶向牛叶酸受体的多个shRNA；创建多个shRNA表达构建体；使用CRISPR将多个shRNA表达构建体插入到牛成纤维细胞中的乳房特异性基因中；使用成纤维细胞的体细胞移植来产生牛；以及验证牛生产的奶耗尽了叶酸受体。另一实施方案是RNAi方法，其包括：鉴定靶向牛叶酸受体的多个shRNA；创建多个shRNA表达构建体；使用CRISPR以及原核注射到牛胚胎中来插入多个shRNA表达构建体，以产生转基因牛；以及验证由转基因牛生产的奶中叶酸受体的耗尽。人源化方法的另一个实施方案包括：使用CRISPR敲除牛受体，并且用人叶酸受体替换牛受体；靶向牛成纤维细胞，然后使用体细胞核移植或将多种CRISPR试剂原核注射到多个牛胚胎中；以及验证牛生产的奶表达人叶酸受体，并且不是抗原性的。

在另一实施方案中是用叶酸的形式(这些包括叶酸、DL亚叶酸，L-叶酸或甲基叶酸盐)补充FRF奶以补偿与叶酸受体结合的天然叶酸的去除的方法。

在技术的另一实施方案中，可以通过重组技术和/或叶酸受体基因的选择性失活与适当干预以维持叶酸代谢和从胚胎发育至成年阶段的后代的生存力的组合来生产缺乏叶酸受体的家畜。

在一个实施方案中，图3示出了通过基因工程家畜产生不含叶酸受体的奶的系统100，并且包括产生靶向叶酸受体的shRNA 110，shRNA的核转染120，有限稀释培养130，鉴定阳性单克隆140，以及进行核移植到牛中150。已经生产出人源化牛以反映人的母奶，并且被普遍接受用于人类消费。虽然已经描述了牛，但是可以使用其它哺乳动物，诸如鼠、猿、人、农场动物、比赛用动物和宠物。也包括在体内获得或体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代。

靶向叶酸受体的shRNA将针对牛(Bos taurus)叶酸受体1(FOLR1)作图，并且mRNANCBI参考序列：NM_001206532.1，GenBank Graphics>NM_001206532.1，牛叶酸受体1(FOLR1)，mRNA，

CCACTAAGCCCTTCTGTCCCCTAGAGTGAGGCAAGGGGGACTGCAGAGCAGAACAGAAGCCTGAGCCAGA

CGAACAGCCAGCATTCCTCCCAGGAAATTGGTTCTTCAGAGACAGGCATGGCCTGGAAGATCACACCACT

GCTGTGCCTTTTAGTGTGTGTGGCTGCTGTGGGGGCAGCCCGGCCCGGGACTCAGCTTCTCAACGTCTGC

ATGAATGCCAGGTACCATAAGGAAAAACCAGGTCCCGAGGACAAGTTACATGGACAGTGCAGCCCTTGGA

AAAAGAATGCCTGCTGCTTTGTCAACACCAGCATAGAAGCCCATAAGGATATTTCCAGCCTGTACAGATT

CGACTGGGACCACTGCGGCAAGATGGAGCCTGCATGCAAGCGCCACTTTATTCAGGACACCTGTCTCTAC

GAGTGCTCACCTAATCTGGGGCCCTGGATCCGGGAGGTGAATCAGAGCTGGCGCAAAGAACGGATCCTGA

ATGTGCCCCTCTGCAAAGAGGACTGTCAGAGCTGGTGGGAAGACTGCCGCACCTCCTACACCTGCAAGAG

CAACTGGCACAGGGGCTGGGACTGGACCTCAGGGTACAACCAGTGCCCAGTGAAAGCTGCCTGCCACCGC

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GGTGGCGAGATTCTATGCTGAGAGCATGAATGGGGCTGGGCTCCATGAGGCCTGGCCTCTGCGTTGCGGC

CTGCTCTTATTGTTACTCTGGCTGCTCAGTTGAGCTCCTATTATTTTTTGACACCTGGAAATCCCTGCCC

CGTTAAGCTCCACAGTCAGTTTGTTCCTTGGTGGAAACTGTTTGAATAAAAAGTCAATCACCCTAAAAAA

AAAAAAAAAA

在一个实施方案中，图4示出了牛成纤维细胞系统200中的敲低叶酸受体。第一步是鉴定大规模shRNA文库210中的shRNA，然后经由传感器试验220验证shRNA，其发现有效力且特异性沉默叶酸受体的shRNA。第三步是证实牛成纤维细胞中的shRNA敲低230。第四步是克隆shRNA的串联载体240。在一个实施方案中，构建体是乳房特异性启动子-shRNA-shRNA-shRNA。最后一步是将串联载体构建体插入到牛成纤维细胞中250。

为了验证预测的shRNA 210的效力，可以使用基于功能性荧光的报告试验222。基于功能性荧光的报告试验222所需的材料包括但不限于：LPE-shRNA、含有shRNA-靶位点的gBlock、基于GFP的报告载体、ERC鸡细胞系、Phoenix-E细胞系、辅助质粒：VSV-G、Gag-Pol辅助质粒(Eco或Ampho辅助质粒)、转染试剂、细胞培养试剂(DMEM、FBS、胰蛋白酶)、细胞培养板、荧光激活细胞分选仪(FACS)管。图7示出了待测文库中shRNA的列表。

在一个实施方案中，gBlock是长度高达约750bp的双链DNA片段(可通过IDT获得)，并且基于功能性荧光的报告试验222包括确定每个预测的shRNA的约21bp的过客链(passenger strand)；查找目的基因的完整mRNA序列并标记预测的shRNA的过客链，对于重叠的靶位点选择整个重叠区域；检查以下基序的接头序列：CTCGAG(Xho1)、GAATTC(EcoR1)、AATAAA和ATTAAA(聚A信号)；以及在接头的5’末端添加Xho1限制性位点，在接头的3’末端添加EcoR1限制性位点，并且在接头的每一侧添加至少6个随机碱基以获得最终“gBlock”。

在一个实施方案中，gBlock克隆包括使用约35ng消化的gBlock插入片段(约500bp)+约150ng消化的CIP’d载体(约6448bp)建立连接。在一个实施方案中，稳定的报告细胞系生成包括以下各项：

第0天：将Plat-GP细胞以70％融合状态铺在10cm培养板上用于转染。

第1天：用10ug序列验证的gBlocks+VSVG对先前铺板的Plat-GP细胞进行转染(这是为了保持稳定的细胞系

第2天：将用于感染的ERC鸡细胞铺在6孔板上。

第3天：收获病毒，并且在6孔板中感染ERC－用1ug/mL dox以1:1感染(感染程度越高越好，因为我们需要高表达dTomato报告子)。

第3天-第5天：孵育2-3天。

第6天：检查GFP阳性细胞，并将其扩展到10cm板上。

第6天-第14天：继续选择3-4天。将细胞从6孔培养板扩展到10cm培养板，继续neo+dox选择。再重复两轮该选择过程(直至95％的细胞为GFP阳性)。

第15天：每10cm板冷冻3瓶报告细胞系。

在一个实施方案中，LPE-shRNA病毒生产包含以下各项：

第0天：将Phoenix-E细胞铺在10cm培养板上。计划具有足够的70％融合状态的细胞用于被转染的shRNA的数目。

第1天：使用10ug LPE-shRNA+Gag-Pol辅助质粒进行转染。确保包括适当的对照shRNA。

第2天：铺板含有shRNA特异性靶位点的ERC-报告细胞系。

第3天：收获病毒，并且以2种病毒稀释度(1:8和1:15)感染稳定的报告细胞系，以实现单拷贝感染(5-20％mKate阳性细胞)。孵育细胞2天。

第5天：使用Guava仪器确定感染百分比(％mKate)。将shRNA感染的报道细胞再继续孵育4天。

第8天：使用LSRII仪器进行FACS(将需要黄绿色激光)。确定GFP相对于LPE-Ren-713对照的敲低百分比。

在一个实施方案中，用于dTomato荧光测定的流式细胞术包括以下各项：通过将1.5ml胰蛋白酶加入到含有细胞的10cm板中来胰蛋白酶化细胞；2min后，将细胞重新悬浮于生长培养基中；将细胞转移到15ml Falcon管中，在3000g下旋转5min；除去上清液；用5ml冷PBS+2％FBS洗涤细胞；将细胞在3000g下旋转5min；除去上清液，并且重新悬浮于PBS+2％FBS中至所期望的细胞浓度；使细胞通过40μm细胞过滤器盖，以防止喷嘴/仪器堵塞；以及将细胞保持在冰上直至分选。

在一个实施方案中，图5示出了产生转基因牛系统300的核移植。产生转基因牛系统300的核移植包括使用乳房特异性启动子310和基因编辑来敲入。在一个实施方案中，可以在牛成纤维细胞320中使用乳房特异性启动子310。在一个实施方案中，产生转基因牛系统的核移植330可以使用CRISPR基因编辑以在乳房特异性基因内敲入。在Kwon DJ、Lee YM、Hwang IS、Park CK、Yang BK、Cheong HT中公开了在一个实施方案中可以使用的用于体细胞核移植技术以产生牛340的方法。控制核重塑类型后体细胞核移植牛胚胎中的微管分布。J Vet Sci.2010；11(2):93-101.另一种方法可以是转基因，由此将DNA插入到原核中并随机整合。特异性地在乳腺中沉默克隆350中的叶酸受体表达可以减少或消除奶中的该抗原。牛可能需要补充高剂量的亚叶酸。

为了限制shRNA在泌乳乳腺中的表达，可以用鼠乳清酸性蛋白(WAP)启动子代替体外使用的组成型启动子。

在PCT申请系列号PCT/US2016/051992中描述的诱导型CRISPR/Cas9和RNAi方法100(通过引用以其整体并入本申请)是在相同生物系统(或生物体或动物模型)中顺序地和/或组合使用的特定基因编辑事件(经由CRISPR/Cas9、锌指、TALEN等)和RNA干扰的新颖组合。

为了敲低牛中的叶酸受体，进行了Jabed A、Wagner S、McCracken J、Wells DN、Laible G中的步骤。奶牛中的靶向microRNA表达指导了不含β-乳球蛋白的高酪蛋白奶的生产。在一个实施方案中可以使用Proc Natl Acad Sci U S A.2012；109(42):16811-6。用shRNA表达盒转染供体细胞系(牛胎儿成纤维细胞)，该供体细胞系先前已验证用于核移植(NT)。对两个扩展的细胞克隆进行核型分析，需要具有正常的染色体数目。通过Southern印迹分析确定两种转基因细胞系的转基因拷贝数，一种约为30，另一种超过200。

细胞系312/3和克隆胚胎向受体的移植应导致妊娠。妊娠中的一种可以终止以恢复胎儿并获得再生细胞，从而保存独特的遗传特征并且提供未来选择。在剩余的妊娠中，一种导致产生了活的雌性小牛。

为了获得奶并且评估miRNA介导的叶酸受体表达的敲低，我们将转基因小牛通过激素诱导进入泌乳期。通过SDS-凝胶电泳和考马斯蓝染色对奶样品的分析表明，来自shRNAcalf的奶样品均不含有可检测到的叶酸受体水平。相反，在所有WT对照(包括初乳以及天然和诱导的奶样品)中，叶酸受体应易于检测为主要的牛奶蛋白。通过Western印迹对叶酸受体水平的更灵敏的分析可以证实高效的敲低，因为来自转基因小牛的所有奶样品都缺乏任何可检测到的叶酸受体。为了进一步定量叶酸受体水平并且确定叶酸受体敲低可能对牛奶蛋白组成的任何影响，可以通过HPLC定量奶样品的所有主要牛奶蛋白。与考马斯蓝染色和Western结果一致，HPLC分析不应在转基因小牛奶样品中检测到任何叶酸受体抗原，并且证实了叶酸受体的全面敲低。叶酸受体抗原的缺乏可能会对其它牛奶蛋白的水平具有强烈的补偿作用。与天然和诱导的WT样品相比，由转基因小牛生产的奶中的所有其它主要牛奶蛋白可以大大增加，特别是酪蛋白。

一般而言，图6示出了组群扩展和奶分析系统400。

可以使用体内受精以增加牛组群大小。在靠近农场的实验室进行奶的分析组成测试。

动物福利评估：在中国农业大学产生的所有转基因动物都有健康和活跃的生活。转基因和非转基因动物之间不应观察到身体差异，尽管可能存在一些异常(无尾)。

FRF牛将仅在乳腺中表达RNA，并且它不应在其体内积累。它不应影响动物的生物系统和健康。将测试来自动物系统的分泌物。

来自先前产生的牛的转基因奶对年轻牛的健康和抗病能力具有积极影响。

实验设计：

这些实施例的目的是从市售牛奶开始生产缺乏叶酸受体α(FRα)的奶。为此目的，使用蛋白质纯化技术从牛奶中选择性去除FRα蛋白，而不改变奶的基本组成，并且不向最终产品中加入任何外来化学品或物质。开创性的方法将使用亲和色谱原理从奶中选择性去除FRα。

该实施例通过以下方式完成：1)从牛奶中纯化FR；2)通过免疫新西兰白兔产生针对奶FRα的多克隆抗血清；3)通过亲和色谱纯化针对FRα的特异性抗体；4)制备含有与惰性固体基质共价连接的FRα抗体的亲和基质；5)使用FRα抗体亲和基质从A2奶中捕获FRα，从而使产品不含FRα蛋白。

具有共价固定的叶酸的亲和基质的制备。

首先5-10个碳的接头/间隔臂将附接至叶酸的末端谷氨酸残基上，随后该间隔臂的末端将附接至活化的Sepharose 4B珠上。将广泛洗涤基质，并且测试任何配体泄漏，然后用于从奶中捕获和纯化FRα。可能需要大约2-4次纯化来获得可以最终用于免疫目的的纯均质产物。将通过SDS-Page分析测试纯化的FRα，以监测蛋白质的纯度。

免疫10只兔子将需要约10-20mg蛋白质。

兔的免疫和抗血清生产可以在商业设施中进行。抗血清的所有测试和FRα特异性IgG的纯化如下所示。

用纯化的FRα抗原免疫四只兔。在3次加强免疫后进行出血测试。通过由抗血清直接免疫沉淀3H叶酸结合的FR抗原来确定抗体滴度。

原料奶(未巴氏消毒)每ml平均含有约5-10ug FRα。如先前确定的，每毫升抗血清可以定量地结合并且从奶中去除约10ug FR抗原。基于抗体滴度，约1ml的抗血清可以去除1ml奶中的所有FRα蛋白。如果需要额外去除，则每1ml奶可以使用多于或少于1ml的抗血清。

在这些初步实验中获得了概念验证。为此，来自兔抗血清的约100至约200mg的总IgG将与蛋白A基质结合。该蛋白A-IgG兔抗血清基质将与约10ml牛奶一起温育，并且在不同时间点测试奶以确定去除奶中所有FR所需的最小时间。

该实施例将表明策略是否将成功地产生不含FR的奶。

对于该实施例，需要约500至约1000mg的纯FRα来纯化抗FRα的抗体。

FRα抗体将经由5-10个碳的接头共价附接至活化的Sepharose基质上。

实施例5：

待耗尽FRα的奶将通过基质，这将导致捕获奶中的FR。如果在第一次通过时未从奶中去除所有FR，则可能需要第二次通过或第三次通过基质。目标是在最终奶制品中无可检测到的FRα水平。

单克隆抗体可以使用杂交瘤方法制备，诸如Kohler and Milstein(1975)Nature256:495所述的方法。使用杂交瘤方法，如上所述免疫小鼠、仓鼠或其它合适的宿主动物，以诱导淋巴细胞产生将特异性结合免疫抗原的抗体。淋巴细胞也可以在体外免疫。免疫后，分离淋巴细胞，并且使用例如聚乙二醇与合适的骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞，然后可以从未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞中将其挑选出来。通过免疫沉淀、免疫印迹或通过体外结合试验(例如放射免疫测定(MA)来确定产生特异性针对所选抗原的单克隆抗体的杂交瘤；然后，可以使用标准方法(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles andPractice,Academic Press,1986)在体外培养中或在动物体内作为腹水肿瘤来传播酶联免疫吸附试验(ELISA)。然后可以如上述多克隆抗体所述从培养基或腹水中纯化单克隆抗体。

可替代地，也可以使用如美国专利第4,816,567号中描述的重组DNA方法来制备单克隆抗体。编码单克隆抗体的多核苷酸从成熟B细胞或杂交瘤细胞中分离，诸如通过RT-PCR，使用特异性扩增编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸引物，并且使用常规程序来确定它们的序列。然后将编码重链和轻链的分离的多核苷酸克隆到合适的表达载体中，当将其转染到宿主细胞(诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)时，单克隆抗体由宿主细胞产生。此外，所需物种的重组单克隆抗体或其片段可以从表达所需物种的CDR的噬菌体展示文库中分离，如所述(McCaffertyet al.,1990,Nature,348:552-554；Clackson et al.,1991,Nature,352:624-628；以及Marks et al.,1991,J.Mol.Biol.,222:581-597)。

可以使用重组DNA技术以多种不同的方式进一步修饰编码单克隆抗体的多核苷酸，以产生替代的抗体。在一些实施方案中，例如小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定结构域可以被1)例如抗体的那些区域取代以产生嵌合抗体，或2)非免疫球蛋白多肽取代以产生融合抗体。在一些实施方案中，截短或去除恒定区以产生单克隆抗体的所需抗体片段。可变区的定点或高密度突变可以用于优化单克隆抗体的特异性、亲和性等。

本发明还包括特异性识别任何动物FR的双特异性抗体。双特异性抗体是能够特异性识别和结合至少两种不同表位的抗体。不同的表位可以在相同的分子内(例如相同的叶酸受体1)或在不同的分子上，使得例如抗体可以特异性地识别和结合叶酸受体1以及例如1)白细胞上的效应分子，诸如T细胞受体(例如CD3)或Fc受体(例如CD64、CD32或CD16)，或2)如下文详细描述的细胞毒性剂。

示例性双特异性抗体可以结合两种不同的表位，其中至少一种源自本发明的多肽。可替代地，免疫球蛋白分子的抗抗原臂可以与结合白细胞上的触发分子(诸如T细胞受体分子(例如CD2、CD3、CD28或B7))或IgG的Fc受体的臂结合，以便将细胞防御机制集中于表达特定抗原的细胞。双特异性抗体还可以用于将细胞毒性剂导向表达特定抗原的细胞。这些抗体具有抗原结合臂以及结合细胞毒性剂或放射性核素螯合剂(诸如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA)的臂。用于制备双特异性抗体的技术是本领域常用的(Millstein et al.,1983,Nature 305:537-539；Brennan et al.,1985,Science 229:81；Suresh et al,1986,Methods in Enzymol.121:120；Traunecker et al.,1991,EMBO J.10:3655-3659；Shalabyet al.,1992,J.Exp.Med.175:217-225；Kostelny et al.,1992,J.Immunol.148:1547-1553；Gruber et al.,1994,J.Immunol.152:5368；以及美国专利第5,731,168号)。还设想了具有多于两个化合价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体(Tutt et al.,J.Immunol.147:60(1991)).因此，在某些实施方案中，针对FR的抗体是多特异性的。

提出先前的实施例，以便向本领域普通技术人员提供如何制备和评估本申请要求保护的化合物、组成、制品、装置和/或方法的完整公开和描述，并且旨在仅是本发明的示例，而不旨在限制发明人视为其发明的范围。然而，根据本发明，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变，并且仍然获得相同或相似的结果。

已努力确保关于数字(例如，数量、温度等)的准确性，但应考虑一些误差和偏差。除非另有说明，份为重量份，温度为℃或为环境温度，并且压力为大气压或接近大气压。

Dow,L.E.et al.A pipeline for the generation of shRNA transgenicmice.Nat Protoc 7,374-393,doi:10.1038/nprot.2011.446nprot.2011.446[pii](2012)。

Zuber,J.et al.Toolkit for evaluating genes required for proliferationand survival using tetracycline-regulated RNAi.Nat Biotechnol 29,79-83,doi:nbt.1720[pii]10.1038/nbt.1720(2011)。

Zuber,J.et al.Toolkit for evaluating genes required for proliferationand survival using tetracycline-regulated RNAi.Nat Biotechnol 29,79-83,doi:nbt.1720[pii]10.1038/nbt.1720(2011)。

Fellmann,C.et al.Functional Identification of Optimized RNAi TriggersUsing a Massively Parallel Sensor Assay.Mol Cell 41,733-746,doi:S1097-2765(11)00091-8[pii]10.1016/j.molcel.2011.02.008(2011)。

本说明书中提及的所有出版物和专利申请通过引用并入本申请，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被明确且单独地表明通过引物并入。

虽然已经结合各种实施方案描述了本发明，但应当理解，本发明能够进一步修改。本申请旨在涵盖本发明的任何变化、用途或改编，该变化、用途或改编总体上遵循本发明的原则，并且包括在本发明所属领域内的已知和惯例范围内对本发明的脱离。

序列表

<110> Miritaur, LLC

<120> Redefining livestock milk by removing folate receptor proteintodecrease folate receptor autoimmune disorder in pregnancy andautism

<130> MIS-101-PCT

<140> n/a

<141> 2021-01-21

<150> 62/964,343

<151> 2020-01-22

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 257

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ala Gln Arg Met Thr Thr Gln Leu Leu Leu Leu Leu Val Trp Val

1 5 10 15

Ala Val Val Gly Glu Ala Gln Thr Arg Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu

20 25 30

Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly

35 40 45

Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln Cys Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala

50 55 60

Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr

65 70 75 80

Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys

85 90 95

Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn

100 105 110

Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg

115 120 125

Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu

130 135 140

Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp

145 150 155 160

Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys Cys Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln

165 170 175

Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile

180 185 190

Trp Thr His Ser Tyr Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg

195 200 205

Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu

210 215 220

Val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala Met Ser Gly Ala Gly Pro Trp Ala

225 230 235 240

Ala Trp Pro Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Leu Leu Trp Leu Leu

245 250 255

Ser

<210> 2

<211> 255

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 2

Met Ala His Leu Met Ala Gly Gln Trp Leu Leu Leu Leu Met Trp Met

1 5 10 15

Ala Glu Cys Ala Gln Ser Arg Ala Thr Arg Ala Arg Thr Glu Leu Leu

20 25 30

Asn Val Cys Met Asp Ala Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu

35 40 45

Asp Lys Leu His Asp Gln Cys Ser Pro Trp Lys Thr Asn Ala Cys Cys

50 55 60

Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu Ala His Lys Asp Ile Ser Tyr Leu Tyr

65 70 75 80

Arg Phe Asn Trp Asn His Cys Gly Thr Met Thr Pro Glu Cys Lys Arg

85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

Asp Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Val Leu Trp Trp Glu Asp Cys

130 135 140

Lys Ser Ser Phe Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp Asn Trp

145 150 155 160

Thr Ser Gly His Asn Glu Cys Pro Val Gly Ala Ser Cys His Pro Phe

165 170 175

Thr Phe Tyr Phe Pro Thr Pro Ala Val Leu Cys Glu Lys Ile Trp Ser

180 185 190

His Ser Tyr Lys Leu Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile

195 200 205

Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala

210 215 220

Arg Phe Tyr Ala Glu Val Met Ser Gly Ala Gly Leu Arg Glu Ala Trp

225 230 235 240

Leu Leu Val Cys Ser Leu Ser Leu Val Leu Phe Trp Val Leu Ser

245 250 255

<210> 3

<211> 251

<212> PRT

<213> Capra hircus

<400> 3

Met Ala Trp Lys Ile Thr Pro Leu Leu Cys Leu Leu Val Cys Val Ala

1 5 10 15

Ala Val Gly Ala Ala Arg Pro Arg Thr Gln Leu Leu Asn Val Cys Met

20 25 30

Asn Ala Arg Tyr His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His

35 40 45

Gly Gln Cys Ser Pro Trp Lys Asn Asn Ala Cys Cys Phe Val Asn Thr

50 55 60

Ser Ile Glu Ala His Lys Asp Ile Ser Ser Leu Tyr Arg Phe Asp Trp

65 70 75 80

Asp His Cys Gly Lys Met Glu Pro Ala Cys Lys Arg His Phe Ile Gln

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100 105 110

Glu Val Asn Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Ile Leu Asn Val Pro Leu

115 120 125

Cys Lys Glu Asp Cys Glu Ser Trp Trp Glu Asp Cys Arg Thr Ser Tyr

130 135 140

Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Arg Gly Trp Asp Trp Thr Ser Gly Tyr

145 150 155 160

Asn Gln Cys Pro Val Lys Val Ala Cys His Arg Phe Asp Phe Tyr Phe

165 170 175

Pro Thr Pro Ala Ala Leu Cys Asn Glu Ile Trp Ser His Ser Tyr Arg

180 185 190

Ala Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe

195 200 205

Asp Pro Val Leu Gly Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala

210 215 220

Glu Ser Met Asn Gly Ala Gly Leu His Glu Ala Trp Pro Leu Arg Phe

225 230 235 240

Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp Leu Leu Ser

245 250

<210> 4

<211> 251

<212> PRT

<213> Bos taurus

<400> 4

Met Ala Trp Lys Ile Thr Pro Leu Leu Cys Leu Leu Val Cys Val Ala

1 5 10 15

Ala Val Gly Ala Ala Arg Pro Gly Thr Gln Leu Leu Asn Val Cys Met

20 25 30

Asn Ala Arg Tyr His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His

35 40 45

Gly Gln Cys Ser Pro Trp Lys Lys Asn Ala Cys Cys Phe Val Asn Thr

50 55 60

Ser Ile Glu Ala His Lys Asp Ile Ser Ser Leu Tyr Arg Phe Asp Trp

65 70 75 80

Asp His Cys Gly Lys Met Glu Pro Ala Cys Lys Arg His Phe Ile Gln

85 90 95

Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn Leu Gly Pro Trp Ile Arg

100 105 110

Glu Val Asn Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Ile Leu Asn Val Pro Leu

115 120 125

Cys Lys Glu Asp Cys Gln Ser Trp Trp Glu Asp Cys Arg Thr Ser Tyr

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Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Arg Gly Trp Asp Trp Thr Ser Gly Tyr

145 150 155 160

Asn Gln Cys Pro Val Lys Ala Ala Cys His Arg Phe Asp Phe Tyr Phe

165 170 175

Pro Thr Pro Ala Ala Leu Cys Asn Glu Ile Trp Ser His Ser Tyr Lys

180 185 190

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195 200 205

Asp Pro Ile Leu Asp Asn Pro Asn Glu Glu Val Ala Arg Phe Tyr Ala

210 215 220

Glu Ser Met Asn Gly Ala Gly Leu His Glu Ala Trp Pro Leu Arg Cys

225 230 235 240

Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp Leu Leu Ser

245 250

<210> 5

<211> 257

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Met Ala Gln Arg Met Thr Thr Gln Leu Leu Leu Leu Leu Val Trp Val

1 5 10 15

Ala Val Val Gly Glu Ala Gln Thr Arg Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu

20 25 30

Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly

35 40 45

Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln Cys Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala

50 55 60

Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr

65 70 75 80

Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys

85 90 95

Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn

100 105 110

Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg

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Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu

130 135 140

Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp

145 150 155 160

Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys Cys Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln

165 170 175

Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile

180 185 190

Trp Thr His Ser Tyr Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg

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Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu

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Val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala Met Ser Gly Ala Gly Pro Trp Ala

225 230 235 240

Ala Trp Pro Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Leu Leu Trp Leu Leu

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Ser

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<211> 203

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

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20 25 30

Asn Val Cys Met Asp Ala Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly Pro Glu

35 40 45

Asp Lys Leu His Asp Gln Cys Ser Pro Trp Lys Thr Asn Ala Cys Cys

50 55 60

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Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg Ile Leu

115 120 125

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Thr Ser Gly His Asn Glu Cys Pro Val Gly Ala Ser Cys His Pro Phe

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<212> PRT

<213> Capra hircus

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<212> PRT

<213> Capra hircus

<400> 8

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1 5 10 15

Ser Val Cys Asn Ala Arg Thr Arg Thr Asp Leu Leu Asn Val Cys Met

20 25 30

Asp Ala Lys His His Lys Ala Glu Pro Gly Pro Glu Asp Lys Leu His

35 40 45

Asn Gln Cys Thr Pro Trp Lys Lys Asn Ala Cys Cys Ser Ala Arg Val

50 55 60

Ser Gln Glu Leu His Lys Asp Thr Ser Ser Leu Tyr Asn Phe Thr Trp

65 70 75 80

Asp His Cys Gly Lys Met Glu Pro Ala Cys Gln Arg His Phe Ile Gln

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100 105 110

Glu Val Asn Gln Lys Trp Arg Lys Glu Arg Phe Leu Asn Val Pro Leu

115 120 125

Cys Lys Glu Asp Cys Gln Ser Trp Trp Glu Asp Cys Arg Thr Ser His

130 135 140

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145 150 155 160

Asn Lys Cys Pro Asn Gly Thr Thr Cys Arg Thr Phe Glu Ala Tyr Phe

165 170 175

Pro Thr Pro Ala Ala Leu Cys Glu Gly Leu Trp Ser His Ser Tyr Lys

180 185 190

Leu Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg Cys Ile Gln Met Trp Phe

195 200 205

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210 215 220

Ser Ala Leu Thr Ala Glu Ala Trp Pro Gln Gly Ile Arg Pro Leu Ser

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<212> DNA

<213> Bos taurus

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cggcccggga ctcagcttct caacgtctgc atgaatgcca ggtaccataa ggaaaaacca 240

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gtcaacacca gcatagaagc ccataaggat atttccagcc tgtacagatt cgactgggac 360

cactgcggca agatggagcc tgcatgcaag cgccacttta ttcaggacac ctgtctctac 420

gagtgctcac ctaatctggg gccctggatc cgggaggtga atcagagctg gcgcaaagaa 480

cggatcctga atgtgcccct ctgcaaagag gactgtcaga gctggtggga agactgccgc 540

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cagtgcccag tgaaagctgc ctgccaccgc ttcgacttct acttcccgac gcctgctgct 660

ctgtgcaatg aaatctggag tcactcctac aaagccagca actacagtcg tggcagcggc 720

cgctgcattc agatgtggtt cgaccccatc ctggacaacc ccaacgagga ggtggcgaga 780

ttctatgctg agagcatgaa tggggctggg ctccatgagg cctggcctct gcgttgcggc 840

ctgctcttat tgttactctg gctgctcagt tgagctccta ttattttttg acacctggaa 900

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