一种牛血红蛋白的纯化方法、牛血红蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及血液制品分离纯化技术领域，特别是涉及一种牛血红蛋白的纯化方法，由该纯化方法得到的牛血红蛋白，及该牛血红蛋白的应用。

背景技术

血红蛋白氧载体(Hemoglobin-based oxygen carriers，HBOCs)因具有良好的生物相容性、安全性和稳定性以及类似于天然红细胞的携氧/释氧能力，逐渐成为目前血液代用品的主要研究方向。HBOCs主要以人或动物的血红蛋白为基础，经聚合、修饰或包裹获得。其中牛血红蛋白来源广泛，质量稳定可控，与人血红蛋白同源性在85％以上，因而是制备HBOCs的首选原料。目前，只有Biopure公司生产的戊二醛聚合牛血红蛋白(HBOC-201)在南非、俄罗斯上市，是目前唯一在国际上被批准临床应用于人的HBOCs产品。国内凯正公司生产的聚乙二醇牛血红蛋白偶联物PEG-bHb于2019年作为兽用新药获生产批文。

携氧/释氧能力是评价HBOCs产品性能的关键指标，P

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的缺陷，第一方面，提供一种牛血红蛋白的纯化方法，该方法在纯化过程中基本不影响牛血红蛋白的携氧/释氧能力，纯化得到的牛血红蛋白与天然牛血红蛋白或人血红蛋白的P

该纯化方法包括对牛红细胞依次进行的溶血、微滤、阴离子层析、超滤等步骤。

所述溶血步骤具体为：在冰浴下向红细胞中边通氮气边加入溶血剂，搅拌静置后得到血红蛋白液；优选的，所述溶血剂为磷酸盐溶液。

所述微滤步骤具体为：将溶血步骤得到的血红蛋白液离心，取上清液，用滤膜进行微滤，收集微滤后的微滤液；优选依次使用0.45μm和0.22μm的滤膜进行微滤；更优选的，所述滤膜为PVDF滤膜。

所述阴离子层析步骤具体为：先将微滤步骤得到的微滤液的pH调节至8.0，再用平衡缓冲液A平衡层析柱，上样，然后用平衡缓冲液A淋洗层析柱至紫外检测基线平稳，加入洗脱缓冲液B进行梯度洗脱，收集牛血红蛋白峰的洗脱液作为层析液。

梯度洗脱中线性增加洗脱缓冲液B的量由0％至100％，使得层析柱中平衡缓冲液A的量由100％至0％线性减少，层析柱中平衡缓冲液A与洗脱缓冲液B的总量为100％。

所述洗脱缓冲液B为20mM Tris-HCl+(0.15-0.5)M NaCl，pH为8.0；平衡缓冲液A为20mM Tris-HCl，pH为8.0。

所述超滤步骤具体为：用截留分子量30kDa的PES超滤膜和超滤缓冲液在冰浴和氮气气氛下对阴离子层析得到的层析液进行超滤，至超滤液中血红蛋白浓度达到10g/dL停止超滤，收集的超滤液作为纯化后的牛血红蛋白产品；优选所述超滤缓冲液为PBS缓冲液和P

第二方面，本发明提供上述纯化方法得到的牛血红蛋白产品，其纯度为99％以上(优选99.8％以上)，P

其在-80℃储存5个月的过程中P

第三方面，本发明提供上述纯化方法纯化得到的或上述牛血红蛋白产品在制备红细胞携氧/释氧功能评价装置校验用标准品中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明方法采用低渗溶血、微滤、阴离子层析、超滤等步骤从新鲜牛血中纯化得到牛血红蛋白。本发明方法中的低渗溶血步骤可减少细胞膜碎片的产生，降低细胞膜中磷脂引发血栓的不良风险；阴离子层析和超滤步骤均可以高度纯化牛血红蛋白，降低其他杂质蛋白潜在的副作用，也为得到生产HBOCs所需的安全、品质好的牛血红蛋白原料打下基础。该方法纯化得到的牛血红蛋白P

将该方法纯化得到的携氧/释氧能力稳定的牛血红蛋白应用于HBOCs的制备中，由于原料品质好，有利于获得携氧/释氧能力稳定的HBOCs产品。该方法纯化得到的牛血红蛋白中MetHb含量低于1％，表明牛血红蛋白的氧化程度低，说明纯化过程基本没有对血红蛋白造成氧化损伤，安全性高，用氧化损伤小的牛血红蛋白也有利于获得安全、有效的HBOCs产品。

附图说明

图1为经不同溶血剂处理后血红蛋白携氧/释氧能力的柱状图；

图2为经不同溶血剂处理后血红蛋白液台盼蓝染色显微镜照片；

图3为不同离心条件处理后上清液台盼蓝染色显微镜照片；

图4为不同离心条件处理后血红蛋白携氧/释氧能力的柱状图；

图5为经不同材质微滤后微滤液台盼蓝染色显微镜照片；

图6为经不同材质微滤后血红蛋白携氧/释氧能力的柱状图；

图7为不同条件层析后层析液的氧解离变化曲线；

图8为不同条件层析后血红蛋白携氧/释氧能力的柱状图；

图9为血红蛋白层析液的图谱；

图10为超滤浓缩处理后血红蛋白的纯度照片；

图11为用不同缓冲液超滤浓缩处理后超滤液的紫外-可见光扫描光谱；

图12为用不同缓冲液超滤浓缩后血红蛋白携氧/释氧能力的柱状图；

图13为用超滤液保存血红蛋白5个月后血红蛋白携氧/释氧能力的曲线图。

具体实施方式

评价血红蛋白纯化方法的效果，通常仅考虑血红蛋白的回收率和纯化后血红蛋白的纯度，而未考虑纯化过程对血红蛋白的携氧/释氧能力是否造成影响。发明人研究发现不仅牛血红蛋白原料的携氧/释氧能力会影响HBOCs产品的携氧/释氧能力，牛血红蛋白的纯化过程也因影响了血红蛋白的携氧/释氧能力而间接影响HBOCs产品的携氧/释氧能力，这可能是由于纯化步骤破坏了牛血红蛋白的结构和功能导致的。为了获得具有稳定携氧/释氧能力的HBOCs产品，发明人以牛血红蛋白为研究对象，依托于Blood OX-2018红细胞携氧/释氧功能评价装置(购自北京软隆生物技术有限公司)，深入研究了纯化过程中可能影响血红蛋白携氧/释氧能力的各项因素后，确定了一种牛血红蛋白的纯化方法，该方法纯化后的各批次牛血红蛋白具有稳定的携氧/释氧能力，且与天然牛血红蛋白或人血红蛋白十分接近，为进一步制成适用于输入体内的HBOCs产品提供了应用基础。

研究中发明人意识到血红蛋白的P

此外，血红蛋白的P

本发明提供的牛血红蛋白的纯化方法，是将牛红细胞依次经过溶血、微滤、阴离子层析和超滤浓缩等步骤，最终得到牛血红蛋白的过程。

本发明提供的纯化方法中，溶血、微滤、阴离子层析、超滤等步骤的确定均是通过实验评价了其对血红蛋白携氧/释氧能力的具体影响后确定的。其中，

溶血剂的晶体渗透压是影响溶血效果的关键因素。红细胞膜富含磷脂，主要成分为磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰丝氨酸(PS)。其中磷脂酰丝氨酸是凝血酶原的激活剂，可促进红细胞凝集，粘附于血管内皮形成血栓。因此，在纯化的血红蛋白中残留过多红细胞膜，其中的磷脂酰丝氨酸会造成HBOCs输注后的血凝现象。不同晶体渗透压的溶血剂造成红细胞膜破碎的程度不同，直接关系HBOCs输注的安全性。因此，本发明比较了H

影响微滤效果的关键因素主要是微滤膜的材质。PVDF(聚偏氟乙烯)和PES(聚醚砜)滤膜都被广泛用于蛋白的分离和粗提纯，本发明发现这两中滤膜虽然对微滤后牛血红蛋白的携氧/释氧能力并无明显影响，对血常规、血气相关参数也无显著差异的影响。但PVDF滤膜具有较好的化学稳定性，可耐高温、强酸、强碱和各种有机溶剂，更为重要的是，使用PVDF微滤液比PES微滤液得到的血红蛋白P

阴离子层析条件温和，不影响蛋白功能，被广泛用于血红蛋白的纯化。本发明发现层析过程中的溶液pH和洗脱液盐浓度直接关系纯化后牛血红蛋白的携氧/释氧能力。与原料牛血相比，由条件3、条件4(参见实验三中的条件3、条件4)得到的层析液中血红蛋白的P

超滤的目的是更换保存液和浓缩牛血红蛋白，选用的缓冲液对后续牛血红蛋白储存过程中的携氧/释氧能力有着重要影响。本发明使用PBS、P

综合以上结果分析，本发明纯化方法确定了溶血剂选用PB溶液，微滤选用PVDF材质滤膜，层析条件筛选为平衡缓冲液A为20mM Tris-HCl，pH8.0；洗脱缓冲液B为20mM Tris-HCl+(0.15-0.5)M NaCl，pH8.0)，超滤选用PBS缓冲液。用该方法纯化得到的牛血红蛋白P

本发明的纯化方法具体包括以下步骤：

a).牛血的采集与洗涤

使用一次性采血袋采集牛颈部静脉血，于4℃，4000g离心10min，弃上清液和白膜层。下层红细胞层用1.5倍体积的1.6wt％氯化钠溶液离心洗涤一次，用1.5倍体积的等渗氯化钠溶液离心洗涤3次，沉淀即为红细胞。

b).溶血

向红细胞中通入氮气，冰浴下25min内匀速加入5倍于红细胞体积的PB(pH＝7.4，含65.0mmol/L NaCl，1.1mmol/L KH

c).离心

取粗血红蛋白液在4℃，8500-12000g条件下离心35-60min，得到上清液；

d).微滤

取上清液依次经0.45μm、0.22μm的PVDF滤膜(购自浙江SORFA硕华生物科技公司)微滤，收集微滤液；0.45μm孔径的滤膜可预先除去大体积的杂质，避免堵塞后续的0.22μm孔径的滤膜，以提高0.22μm孔径滤膜的微滤效率。

e).阴离子层析

选用HiTrap Q Sepharose XL 5ml预装柱，依托PPS蛋白纯化系统，采取线性梯度洗脱方式进一步纯化微滤液。

用5倍柱体积的平衡缓冲液A(20mmol/L Tris-HCl，pH＝8.0)平衡层析柱，流速5ml/min。以2ml/min流速将1ml浓度为5.0g/dL的微滤液加样至层析柱内，再用平衡缓冲液A以流速5ml/min淋洗层析柱直至紫外检测基线平稳。10min内以流速5ml/min加入洗脱缓冲液B(洗脱缓冲液B的加入量由0％呈线性增加至100％，对应的平衡缓冲液A由100％呈线性降至0％，整个梯度洗脱的过程中，保持洗脱缓冲液B+平衡洗脱液A的总占比为100％；洗脱缓冲液B为20mmol/L Tris-HCl+(0.15-0.5)mol/L NaCl，pH＝8.0)进行梯度洗脱，待洗脱峰出现开始收集牛血红蛋白层析液。

f).超滤

在0-4℃的冰浴条件下，选用截留分子量30kDa的PES超滤膜，使用PBS(pH＝7.4，含136.8mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10.1mmol/L Na

实施例

按上述方法对牛血进行纯化，并对方法中的一些参数做了调整(见表1)，然后用实验一-实验六验证所得牛血红蛋白的各项指标。

表1用不同参数的方法纯化牛血

统计学分析：采用SPSS 22.0统计学软件，计量资料以“均数±标准差

实验一、溶血剂的影响

1、P

牛全血于4℃，4000g离心10min，弃上清液和白膜层。下层红细胞层用1.5倍体积的1.6wt％氯化钠溶液离心洗涤一次，再用1.5倍体积的等渗氯化钠溶液离心洗涤3次，弃上清，沉淀即为红细胞，向红细胞中加入5倍体积的H

图1结果显示，与原料牛全血相比，本发明的步骤(b)中溶血剂选用H

根据图1的结果计算出H

表2两种溶血剂与原料牛血P

2、血常规

分别使用ABL90血气分析仪、兽用五分类血常规仪对不同血红蛋白液进行检测，两种溶血剂处理后的血红蛋白液的血常规检测结果如表3所示。

表3两种溶血剂血常规参数

表3的结果显示，相比使用H

3、台盼蓝染色

台盼蓝是细胞活性染料，常用于检测细胞膜完整性。本实验用台盼蓝对血红蛋白液进行染色，在光学显微镜下可观测到不同血红蛋白液中细胞膜碎片的数量及大小。具体操作为：用去离子水将血红蛋白液中的血红蛋白稀释至浓度为2g/dl，与0.4％台盼蓝染色液以体积比9：1的比例混合，室温静置3min后，置于光学显微镜下观察并记录结果。

台盼蓝染色镜下观察如图2所示，图2的a幅和b幅为使用PB溶血剂溶血后分别放大100倍和400下倍的照片；c幅和d幅为使用H

PB溶血剂组镜下可见明显溶胀后的牛血红细胞，体积比正常红细胞略大，直径在10μm左右，基本无细胞膜碎片，这是因为PB溶血剂是通过溶胀作用使红细胞膜出现孔洞，血红蛋白得以从孔洞中释放出来，从而留下比较完整的红细胞膜，留下的红细胞膜容易通过离心等步骤除去。而H

实验二、离心的影响

1、血常规

PB溶血剂组的血红蛋白液分别经4℃，12000g，35min或4℃，8500g，60min离心，离心后取上清液去除沉淀，分别使用红细胞携氧/释氧能力功能评价装置、兽用五分类血常规仪对上清液进行检测。

血常规结果显示，两种离心条件得到的上清液中RBC数值均低于1×10

2、台盼蓝染色

台盼蓝染色过程同实验一，结果如图3所示，图3的a幅和b幅为使用4℃，12000g离心35min后上清液分别放大40倍和100下倍的照片；c幅和d幅为使用4℃，8500g离心60min后上清液分别放大40倍和100下倍的照片。

图3显示，使用两种离心条件均可除去血红蛋白液中大部分的细胞膜碎片。

3、P

具体操作同实验一，结果如图4和表4所示。

表4两种离心条件的上清液与原料牛血P

图4显示，原料牛血与两种上清液P

实验三、滤膜的影响

1、血常规

4℃，8500g下离心60min得到的上清液分别经0.45μm、0.22μm孔径的PES或PVDF滤膜微滤(即：先使用0.45μm的PES滤膜微滤，再使用0.22μm的PES滤膜微滤；或先使用0.45μm的PVDF滤膜微滤，再使用0.22μm的PVDF滤膜微滤)，得到微滤液，再分别使用红细胞携氧/释氧能力功能评价装置、ABL90血气分析仪、兽用五分类血常规仪对不同微滤液进行检测。

血常规的结果显示，微滤前上清液中RBC数值为0.60±0.04×10

2、台盼蓝染色

台盼蓝染色过程同实验一，结果如图5所示，图5的a幅和b幅为使用0.22μmPVDF滤膜微滤后分别放大40倍和100下倍的照片；c幅和d幅为使用0.22μmPES滤膜微滤后分别放大40倍和100下倍的照片。

图5显示，使用两种微滤膜均可除去上清液中的细胞膜碎片。

3、五波长法测定MetHb含量

使用五波长法(见Benesch RE,Benesch R,Yung S.Equations for thespectrophotometric analysis of hemoglobin mixtures.Anal Biochem.1973Sep；55(1):245-8.)测定微滤液的MetHb含量。

MetHb为高铁血红蛋白，含量越高说明被氧化变性的牛血红蛋白量越大。本实验测得两种微滤液的MetHb含量均为0％，说明两种微滤膜均不会导致牛血红蛋白被氧化变性，滤膜材质对血红蛋白的化学性质基本无影响。

4、P

具体操作同实验一，结果如图6和表5所示。

表5两种滤膜的微滤液与原料牛血P

图6显示，与原料牛血相比，两种微滤液的P

实验三、层析的影响

本发明发现层析过程中平衡液缓冲液A的pH和洗脱缓冲液B的盐浓度直接关系血红蛋白的纯度和回收率，是层析过程的重点参数。

1、P

对表1所列4种层析条件下纯化所得的层析液进行携氧/释氧能力分析，4种层析条件分别为：

条件1：平衡缓冲液A为20mM Tris-HCl，pH7.8，洗脱缓冲液B为20mmol/L Tris-HCl+0.5mol/L NaCl，pH＝7.8；

条件2：平衡缓冲液A为20mM Tris-HCl，pH8.0，洗脱缓冲液B为20mmol/L Tris-HCl+0.15mol/L NaCl，pH＝7.8；

条件3：平衡缓冲液A为20mM Tris-HCl，pH8.0，洗脱缓冲液B为20mmol/L Tris-HCl+0.5mol/L NaCl，pH＝8.0；

条件4：平衡缓冲液A为20mM Tris-HCl，pH8.0，洗脱缓冲液B为20mmol/L Tris-HCl+0.15mol/L NaCl，pH＝8.0；

4种条件下层析液的氧解离曲线、P

表6四种条件下层析液与原料牛血P

图7显示，经过层析后的牛血红蛋白氧解离曲线发生左移，但不同层析液条件平移幅度不同。图8进一步显示，相比原料牛血，条件1、条件2层析液P

表6显示，条件3和4层析液P

实验四、超滤浓缩的影响

经条件4层析后的层析液，分别用PBS、TBS、P

1、五波长法测定MetHb含量

使用五波长法(同实验二)测定超滤液的MetHb含量。

PBS、TBS、P

2、蛋白纯度

三种缓冲液分别进行SDS-PAGE电泳，蛋白上样量10μg，用考马斯亮蓝染色，用灰度扫描仪测定纯度，结果见图10。图10中M表示蛋白Marker；1表示P

图10显示，用PBS、TBS、P

3、紫外-可见光扫描光谱

用全自动紫外-可见光扫描仪对超滤液进行连续检测，波长区间300nm-700nm，结果见图11。

图11显示，超滤液中牛血红蛋白在415nm、541nm和576nm存在特征吸收峰，其中在415nm附近的峰为Soret带，表征血红蛋白四级结构的信息；在541和576nm附近的两个峰分别为β带和α带，表征血红蛋白亚基及血红素口袋(血红素口袋是指血红蛋白三级结构中两个α螺旋之间形成的一段无规则卷曲的球状分子。球状分子表面为亲水侧链，内部为疏水侧链，形成一个口袋，血红素位于口袋内，称为血红素口袋)的相关信息，该结果表明三种缓冲液中血红蛋白结构相似，缓冲液对血红蛋白的结构基本无影响。

4、P

具体操作同实验一，结果如图12和表7所示。

表7三种缓冲液超滤浓缩牛血红蛋白与原料牛血P

图12和表7显示，三种缓冲液超滤浓缩得到的牛血红蛋白和原料牛血之间P

5、长时间稳定性

将超滤液(含PBS缓冲液+牛血红蛋白)冻存于-80℃条件下5个月，每个月随机抽取两份样品，每份样品重复检测3次携氧/释氧能力，结果如图13所示。

利用SPSS统计学分析软件，以时间为X轴，P

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。