用于预测实体癌患者在术前辅助治疗后复发和/或死亡风险的方法

技术领域

本发明属于医学领域，特别是肿瘤学和免疫学领域。

背景技术

结直肠癌是世界上第三大最常见的癌症，发病率不断增加，尤其是在年轻人中(1)。国际指南推荐在局部晚期直肠癌(LARC)中进行新辅助放化疗(nCRT)，然后进行根治性手术(2，3)。肿瘤复发和患者的生存受到新辅助治疗(nT)应答质量的强烈影响(4–6)。LARC患者管理的最新进展表明，可以想象在临床和影像学特征与nT完全应答相符的患者中避免直肠截肢(保护策略；例如观察和等待)(7，8)的情况。这些患者经历了可接受的结果，但是，其中约25％的患者会出现早期肿瘤再生(9)。目前没有分子标记来预测对nCRT的应答，以及指导治疗决策(3)，例如在无反应患者中优化或修改nT以及更好地选择适合保护策略的患者。

电离辐射具有启动/加强适应性T细胞介导的免疫应答的能力，其在局部肿瘤消退和远端肿瘤(distant tumor)抑制和排斥(即远位效应)的机制中发挥作用(10–12)。这表明在nT之前肿瘤位点的自然免疫反应的质量和强度可能会影响对nT的应答程度并提供应答的预测标记。肿瘤位点的自然免疫应答进一步与各种癌症中的良好预后相关(13)，包括仅通过手术治疗的结直肠癌(14，15)。数字病理学和图像分析中的最新进展已经允许将免疫评估转化为临床相关应用(16)。使用这些技术，已经开发出第一个标准化的基于免疫的结肠癌检测方法，称为“免疫评分”(IS；即肿瘤及其浸润边缘中CD3+和CD8+T细胞密度的组合)。它在I-III期结肠癌中的稳健性和预后表现已通过一项国际验证研究(17)得到巩固。因此，IS提供了对肿瘤位点自然免疫应答的可靠评估。

直肠癌中的初步研究表明，肿瘤的自然免疫应答可以通过活检进行评估(18–20)，其是治疗前唯一可用的样本材料。在nT之前的初始活检(IS

发明内容

本发明由权利要求限定。特别地，本发明涉及用于预测实体癌患者在术前辅助治疗后复发和/或死亡风险的方法。

具体实施方式

发明人表明，对癌症活检样本进行的活检-适应性免疫评分(IS

定义：

如本文所用，术语“肿瘤”是指所有肿瘤细胞生长和增殖，无论是恶性或良性，以及所有癌前和癌变的细胞和组织。

如本文所用，术语“癌症”是指或描述哺乳动物中典型地以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。本文使用的术语“癌症”包括癌(carcinomas)(例如，原位癌、浸润性癌、转移性癌)和恶化前病症、与其原始组织无关的新形态变化。术语“癌症”不限于感染组织或细胞聚集的任何阶段、等级、组织形态学特征、侵袭性、攻击性或恶性肿瘤。特别地，包括0期癌症、I期癌症、II期癌症、III期癌症、IV期癌症、I级癌症、II级癌症、III级癌症、恶性癌症和原发性癌。

如本文所用，术语“原发性癌症”是指体内的原始或最初的肿瘤。来自原发性肿瘤的癌细胞可扩散到身体的其他部位并形成新的或继发性肿瘤(即转移)。

如本文所用，术语“局部晚期癌症”是指癌症已经从它在器官组织中开始的地方扩散到附近的组织或淋巴结，但没有扩散到身体的其他部位。

如本文所用，术语“转移性癌症”是指已经从它最初开始的地方扩散到身体的另一个地方，并且具体地扩散到淋巴结的癌症。

如本文所用，术语“结直肠癌”包括公认的医学定义，该定义将结直肠癌定义为以小肠以下的肠道细胞癌为特征的医学病症((即大肠(结肠)，包括盲肠、升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠和直肠)。此外，如本文所用，术语“结直肠癌”还进一步包括以十二指肠和小肠(空肠和回肠)细胞癌为特征的医学病症。如本文所用，术语“微卫星不稳定结直肠癌”是指以微卫星不稳定性为特征的结直肠癌。

如本文所用，术语“微卫星不稳定性”或“MSI”具有其一般含义，且被定义为短重复DNA序列(或“微卫星”)的插入-缺失突变的积累是具有DNA错配修复(MMR)缺陷的癌细胞的特征。包括MLH1、MSH2、MSH6和PMS2在内的几种MMR基因中的任何一种失活都能导致MSI。最初，MSI被证明与Lynch综合征(LS)患者的MMR基因中的种系缺陷相关，其中>90％的结直肠癌(CRC)患者表现出MSI。后来认识到，MSI也发生在约12％的散发性CRC中，这些CRC发生在缺乏种系MMR突变的患者中，并且这些患者中的MSI是由于启动子甲基化诱导的MLH1基因表达沉默。CRC中MSI状态的确定涉及本领域熟知的常规方法。

如本文所用，术语“复发”是指癌症的复发，局部的(例如，在治疗之前它曾经在的地方)或远端的(例如，转移)。

如本文所用，术语“风险”在本发明的上下文中涉及事件将在特定时间段内发生的概率，并且可以表示受试者的“绝对”风险或“相对”风险。绝对风险可以参考相关时间组的实际观察后测量，或参考统计上有效的历史组中得出的指数值来测量，所述有效的历史组遵循相关的时间段。相对风险是指受试者的绝对风险与低风险组的绝对风险或平均人群风险的比率，这可因临床风险因素的评估方式而异。几率比(Odds ratio)，即给定测试结果的阳性事件与阴性事件的比例，也经常用于无转换(几率根据公式p/(l-p)，其中p是事件的概率，(1-p)是无事件的概率)。在本发明的上下文中，“风险评估”或“风险的评估”涵盖预测事件或疾病状态可能发生的概率、几率或可能性、事件或从一个事件的转换疾病状态到另一个的发生率。风险评估还可以包括对未来临床参数、传统实验室风险因素值或其他复发指数的预测，以相对于先前测量的人群的绝对或相对术语。本发明的方法可用于对转化风险进行连续或分类测量，从而诊断和定义被定义为处于转化风险中的受试者类别的风险范围。

如本文所用，术语“复发时间”或“TTR”是指以年为单位的时间，以年为单位将第二原发性癌症的第一次复发检查作为第一事件或没有复发证据的死亡时间。

如本文所用，术语“生存时间”包括“无进展生存”、“无死亡生存”和“总生存”。

如本文所用，本发明上下文中的术语“无进展生存期”或“PFS”是指治疗期间和之后的时间长度，在此期间，根据治疗医师或研究者的评估，患者的疾病不会变得更糟，即无进展。如技术人员将领会的，如果与类似的对照组的平均无进展生存时间相比，患者经历更长的疾病无进展的时间长度，则患者的无进展生存期得到改善或增强。

如本文所用，术语“无病生存期”或“DFS”具有其在本领域中的一般含义并且被定义为从随机分组到肿瘤复发或死亡的时间，并且它典型地用于辅助治疗环境中。该术语也称为“无复发生存”。

本发明上下文中的术语“总生存期”或“OS”是指患者组内患者的平均生存期。如本领域技术人员将理解的，如果患者属于与另一患者亚组相比具有统计学上显著更长的平均生存时间的患者亚组，则患者的总体生存率得到改善或提高。总生存期的改善在一个或多个患者亚组中可能很明显，但当将患者群体作为一个整体进行分析时则不明显。

如本文所用，表述“短生存时间”表示受试者的生存时间将低于在受试者的一般人群中观察到的中值(或均值)。当受试者的生存时间较短时，意味着受试者将“预后不良”。相反，表述“长生存时间”表示受试者的生存时间将高于在一般受试者群体中观察到的中值(或均值)。当受试者的生存时间长时，意味着受试者将有“预后良好”。

如本文所用，术语“治疗”指抗肿瘤剂，和/或抗血管剂，和/或抗间质剂，和/或免疫刺激剂或抑制剂，和/或血细胞增殖剂，和/或放疗，和/或热疗，和/或用于癌症治疗的低温疗法的顺序施用或同时施用。这些施用可以以辅助和/或新辅助模式进行。此类方案的组成可能因每种单一药剂的剂量、施加时间范围和定义治疗窗口的给药频率而异。目前正在研究各种药物和/或物理方法的各种组合，以及各种时间表。

如本文所用，术语“术前辅助治疗”或“新辅助治疗”是指由一组治疗组成的术前治疗方案，这些治疗可包括例如化疗、放疗、靶向治疗、激素治疗和/或免疫治疗，其旨在缩小原发性肿瘤，从而使局部治疗(例如手术)的破坏性更小或更有效，或者能够保留手术或能够保留器官。

如本文所用，术语“化疗”具有其在本领域中的一般含义并且是指包括向患者施用化学治疗剂的治疗。

如本文所用，术语“化学治疗剂”是指例如对恶性细胞和组织具有选择破坏性或选择毒性的化合物(即药物)或变为对恶性细胞和组织具有选择破坏性或选择毒性的化合物(即前药)。

如本文所用，术语“免疫治疗”具有其在本领域中的一般含义并且是指在于施用免疫原性试剂，即能够诱导、增强、抑制或以其他方式改变免疫应答的试剂的治疗。在一些实施方案中，免疫治疗在于给患者施用至少一种免疫检查点抑制剂。

如本文所用，术语“免疫检查点抑制剂”具有其在本领域中的一般含义并且指抑制免疫抑制检查点蛋白的功能的任何化合物。如本文所用，术语“免疫检查点蛋白”具有其在本领域中的一般含义并且是指由T细胞表达的分子，其打开信号(刺激性检查点分子)或关闭信号(抑制性检查点分子)。免疫检查点分子在本领域中被认为构成类似于CTLA-4和PD-1依赖性途径的免疫检查点途径(参见例如Pardoll,2012.Nature Rev Cancer 12:252-264；Mellman等人，2011.Nature 480:480-489)。抑制性检查点分子的实例包括A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、CD277、IDO、KIR、PD-1、LAG-3、TIM-3和VISTA。抑制包括功能降低和完全封锁。优选的免疫检查点抑制剂是特异性识别免疫检查点蛋白的抗体。许多免疫检查点抑制剂是已知的，并且与这些已知的免疫检查点蛋白抑制剂类似，在(临近)将来可能会开发出替代的免疫检查点抑制剂。免疫检查点抑制剂包括多肽、抗体、核酸分子和小分子。免疫检查点抑制剂的实例包括PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、PD-L2拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、VISTA拮抗剂、TIM-3拮抗剂、LAG-3拮抗剂、IDO拮抗剂、KIR2D拮抗剂、A2AR拮抗剂、B7-H3拮抗剂、B7-H4拮抗剂和BTLA拮抗剂。

如本文所用，术语“放疗”具有其在本领域中的一般含义并且是指利用电离辐射的治疗。电离辐射会沉积能量，其通过破坏细胞的遗传物质来伤害或破坏正在治疗的区域(目标组织)中的细胞，使这些细胞无法继续生长。一种常用的放疗涉及光子，例如X射线。根据它们拥有的能量大小，射线可用于破坏身体表面或身体深处的癌细胞。X射线束的能量越高，X射线进入目标组织的深度就越深。直线加速器和电子感应加速器会产生能量越来越大的X射线。使用机器将辐射(例如X射线)聚焦在癌症位点称为外部照射放射治疗。伽马射线是放疗中使用的另一种形式的光子。伽马射线是自发产生的，因为某些元素(如镭、铀和钴60)在分解或衰变时会释放辐射。在一些实施方案中，放疗是外部放疗。外部放疗的实例包括但不限于常规外部照射放疗；三维适形放疗(3D-CRT)，从不同方向发射整形光束以紧密贴合肿瘤的形状；调强放疗(IMRT)，例如螺旋断层放疗，其使辐射束成形以紧密贴合肿瘤的形状，并且还根据肿瘤的形状改变辐射剂量；适形质子束放射治疗；图像引导放疗(IGRT)，其结合扫描和放射技术，提供肿瘤的实时图像以指导放疗；术中放疗(IORT)，其在手术过程中将辐射直接照射到肿瘤；立体定向放射外科手术，其可在单次治疗中向小肿瘤区域提供大而精确的辐射剂量；超分割放疗，例如，连续超分割加速放疗(CHART)，其中每天对受试者进行一次以上的放疗治疗(分次)；和大分割放疗，其中每次放疗的剂量较大，但放疗次数较少。

如本文所用，术语“大分割放疗”具有其在本领域中的一般含义并且是指其中将辐射的总剂量分成大剂量并且治疗少于每天一次的放疗。

在一些实施方案中，术语“接触放疗”具有其在本领域中的一般含义并且是指放疗，其中辐射(例如低能X射线治疗)是用一种装置进行的，该装置包括旨在用于接触待治疗的组织的涂药器。典型地，接触放疗涉及Papillon技术(Sun Myint A,Stewart A,Mills J,et al.Treatment:the role of contact X-ray brachytherapy(Papillon)in themanagement of early rectal cancer.Colorectal Dis.2019；21Suppl1:45-52)。

如本文所用，术语“靶向治疗”是指靶向参与肿瘤发展或致癌信号转导的特定类别蛋白质的治疗。例如，针对血管内皮生长因子的酪氨酸激酶抑制剂已用于治疗癌症。

如本文所用，术语“激素治疗”或“荷尔蒙治疗”是指包括减少、阻断或抑制可促进癌症生长的激素作用的治疗。如本文所用，术语“激素治疗剂”是指抗雄激素(包括甾体抗雄激素和非甾体抗雄激素)、雌激素、促黄体激素释放激素(LHRH)激动剂和LHRH拮抗剂，以及激素消融治疗。

如本文所用，术语“手术”适用于为去除癌组织而进行的手术方法，包括乳房切除术、肿块切除术、淋巴结切除术、前哨淋巴结切除术。特别地，术语“根治性手术”也称为“根治性切除术”，是一种比“保守性手术”范围更广的手术，且旨在切除肿瘤及其任何转移瘤，以达到治疗目的。

如本文所用，术语“辅助治疗”是指在患有具有转移风险和/或可能转移的癌症的患者中作为额外治疗给予的任何类型的癌症治疗，通常在手术切除原发性肿瘤之后。这种辅助治疗的目的是改善预后，辅助治疗包括放疗和治疗，优选全身治疗，如激素治疗、化疗、免疫治疗和单克隆抗体治疗。

如本文所用，术语“应答”是指实现应答的患者，即癌症被根除、减少或改善的患者。因此，患者有资格成为“应答者”。根据本发明，应答者具有客观应答，因此该术语不涵盖具有稳定癌症以致疾病在术前辅助治疗后没有进展的患者。“无应答者”或“难治性”患者包括在术前辅助治疗后癌症未显示减少或改善的患者。根据本发明，术语“无应答者”还包括癌症稳定的患者。

如本文所用，术语“临床应答”是指通过本领域熟知的任何临床方法评估的对术前辅助治疗的应答。例如，可以评估临床应答，其中可以将系统干预后的肿瘤大小与通过生物标志物的成像和/或量化测量的初始大小和尺寸进行比较。因此，特别地，临床应答是指术前辅助治疗开始后肿瘤质量和/或体积的变化和/或术前辅助治疗后远端转移时间或死亡时间的延长。可以以定量方式或定性方式记录应答，例如“无变化”(NC)、“部分缓解”(PR)、“完全缓解”(CR)或其他定性标准。临床应答的评估可以在术前辅助治疗开始后的早期进行，例如在几小时、几天、几周之后，或优选在几个月之后。应答评估的典型终点是术前辅助治疗结束时。这典型地是指在术前辅助治疗开始后三个月。

如本文所用，术语“免疫细胞”是指在免疫应答中起作用的细胞。免疫细胞是造血来源的，且包括淋巴细胞，如B细胞和T细胞；自然杀伤细胞；骨髓细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。

如本文所用，术语“免疫应答”包括导致肿瘤细胞对人体的选择性损伤、破坏或消除的先天性和适应性免疫应答。示例性免疫应答包括T细胞应答，例如细胞因子的产生和细胞毒性。此外，术语免疫应答包括受T细胞活化间接影响的免疫应答，例如抗体产生(体液应答)和细胞因子应答细胞(例如巨噬细胞)的活化。

如本文所用，术语“生物标志物”具有其在本领域中的一般含义并且是指在样品中可检测到的任何分子。这样的分子可以包括肽/蛋白质或核酸及其衍生物。

如本文所用，术语“免疫标志物”包括指示癌症患者针对肿瘤的免疫应答状态的任何可检测、可测量和可量化的参数。在本说明书中，各种目标免疫标志物的每一个的名称均指相应基因的国际公认名称，如国际公认的基因序列和蛋白质序列数据库中所见，包括来自HUGO基因命名委员会的数据库。在本说明书中，各种目标免疫标志物中的每一个的名称也可以参考国际公认的相应基因的名称，如在国际公认的基因序列和蛋白质序列数据库Genbank中找到的。通过这些国际公认的序列数据库，本领域技术人员可以检索到与本文描述的每个目标免疫标志物对应的核酸和氨基酸序列。免疫标志物包括在肿瘤位点的来自免疫系统细胞的存在、数量或密度。免疫标志物还包括由在肿瘤位点的免疫系统细胞特异性产生的蛋白质的存在或数量。免疫标志物还包括任何生物材料的存在或数量，这些生物材料指示在肿瘤位点与宿主的特定免疫应答的产生相关的基因的表达水平。因此，免疫标志物包括从基因组DNA转录的信使RNA(mRNA)的存在或数量，这些信使RNA编码由免疫系统的细胞在肿瘤位点特异性产生的蛋白质。因此，免疫标志物包括由来自免疫系统的细胞特异性表达的表面抗原，包括B淋巴细胞、T淋巴细胞、单核细胞/巨噬细胞树突状细胞、NK细胞、NKT细胞和NK-DC细胞，它们在肿瘤内组织聚集，或者编码所述表面抗原的mRNA。示例性地，用作免疫标志物的目标表面抗原包括由T细胞或T细胞亚群表达的CD3、CD4、CD8和CD45RO。例如，如果CD3抗原的表达或其mRNA的表达用作免疫标志物，则在根据本发明的方法的步骤a)中对该免疫标志物的量化指示患者的适应性免疫应答涉及所有T淋巴细胞和NKT细胞水平。例如，如果CD8抗原的表达或其mRNA的表达用作免疫标志物，则在根据本发明的方法的步骤a)中对该免疫标志物的量化指示患者的适应性免疫应答涉及细胞毒性T淋巴细胞水平。例如，如果CD45RO抗原的表达或其mRNA的表达用作免疫标志物，则在根据本发明的方法的步骤a)中对该免疫标志物的量化指示患者的适应性免疫应答涉及记忆T淋巴细胞或记忆效应T淋巴细胞水平。然而示例性地，用作免疫标志物的蛋白质还包括由来自免疫系统的细胞特异性产生的溶细胞蛋白，如穿孔素、颗粒溶素和颗粒酶-B。

如本文所用，表述“代表适应性免疫应答的基因”是指由细胞表达的任何基因，所述细胞是肿瘤中适应性免疫应答的参与者或有助于肿瘤中适应性免疫应答的稳定。适应性免疫应答，也称为“获得性免疫应答”，包括T细胞亚型的抗原依赖性刺激、B细胞活化和抗体产生。例如适应性免疫应答的细胞包括但不限于细胞毒性T细胞、T记忆T细胞、Th1和Th2细胞、活化的巨噬细胞和活化的树突细胞、NK细胞和NKT细胞。

如本文所用，表述“免疫抑制应答的代表基因”是指由作为肿瘤中免疫抑制应答的参与者或有助于肿瘤中免疫抑制应答的解决的细胞表达的任何基因。例如，免疫抑制应答包括

-抗原依赖性刺激T细胞亚型的共同抑制：基因CD276、CTLA4、PDCD1、CD274、TIM-3或VTCN1(B7H4)，

-巨噬细胞和树突状细胞的失活以及NK细胞的失活：基因TSLP、CD1A或VEGFA

-癌症干细胞标志物、分化和/或肿瘤发生的表达：PROM1、IHH。

-在肿瘤环境中产生的免疫抑制蛋白的表达：基因PF4、REN、VEGFA。

例如免疫抑制应答的细胞包括未成熟的树突细胞(CD1A)、调节性T细胞(Treg细胞)和表达IL17A基因的Th17细胞。

如本文所用，术语“样品”是指为了实施本发明的方法而从受试者获得的任何样品。在一些实施方案中，样品是体液(例如血液样品)、细胞群或组织。这种体液的实例包括血液、唾液、眼泪、精液、阴道分泌物、脓液、粘液、尿液和粪便。

如本文所用，术语“血液样本”是指全血样本、血清样本和血浆样本。血样可通过本领域已知的方法获得，包括静脉穿刺或指尖穿刺。可以通过本领域已知的离心方法获得血清和血浆样品。在进行测定之前，可以用合适的缓冲液稀释样品。

如本文所用，术语“肿瘤活检样本”是指由在患者的原发性肿瘤中进行的活检，或在远离患者的原发性肿瘤的转移性样本中进行的活检而产生的肿瘤样本。例如，在受结直肠癌影响的患者的肠道中进行的内窥镜活检。

如本文所用，术语“参数”是指在执行根据本发明的方法时评估的任何特征。如本文所用，术语“参数值”是指与参数关联的值(例如，数字)。

如本文所用，术语“分数”是指通过组合数学算法或公式中的一个或多个参数得出的数值。组合参数可以通过，例如将每个表达水平与定义和指定的系数相乘再将乘积相加以产生分数来完成。分数可以由评分系统来确定，可以是连续评分系统或非连续评分系统。

如本文所用，术语“评分系统”是指任何使用商定的数值量表作为估计反应程度(即免疫应答或临床应答)的方法。

如本文所用，术语“自动评分系统”是指评分系统部分或全部由机器(例如计算机)控制和执行，从而限制人工输入。

如本文所用，术语“连续评分系统”是指其中输入的一个或多个变量是连续的评分系统。术语“连续”表示变量可以取其最小值和最大值之间的任何值。在一些实施方案中，输入到连续评分系统中的值是变量的实际大小。在一些实施方案中，输入到连续评分系统中的值是变量的绝对值。在一些实施方案中，输入到连续评分系统中的值是变量的标准化值。相反，术语“非连续评分系统”或“二元评分系统”将每个变量分配到一个预先确定的“区间(bin)”(例如，“高”、“中”或“低”)。例如，如果被评估的变量是CD3+T细胞的密度，则在连续评分系统中，输入到函数中的值是CD3+T细胞的密度，而在非连续评分系统中，密度值是首先分析以确定它属于“高密度”、“中密度”还是“低密度”。因此，考虑两个样本，第一个具有1000个CD3+细胞/mm

如本文所用，术语“TNM分类”具有其在本领域中的一般含义并且是指由国际癌症控制联盟(UICC)发布的分类。UICC TNM分类是国际公认的癌症分期标准。UICC TNM分类是一个基于解剖学的系统，它记录了肿瘤的原发性和区域性淋巴结范围以及它们是否存在转移。TNM的每个单独方面都称为一个类别。T类描述原发肿瘤的范围Ta、T0、Tis、T1、T2、T3、T4、Tx N类。N类描述区域淋巴结转移的有无和范围N0、N1、N2、N3、Nx M类。M类描述有无远端转移M0、M1、Mx。原位癌归类为0期；通常局限于起源器官的肿瘤根据程度分期为I或II，局部广泛扩散到区域淋巴结的肿瘤分期为III，远端转移的肿瘤分期为IV期。为了表明临床或病理分类已在术前辅助治疗后确定，TNM分类包括前缀“y”，其中yc表示临床分类，yp表示病理分类。在初始多模式治疗期间或之后进行分类的情况下，cTNM或pTNM类由“y”前缀标识。因此，ycTNM或ypTNM对每次检查时实际存在的肿瘤范围进行分类。下面说明了“y”前缀的使用。患者出现直肠肿瘤。术前影像显示肿瘤延伸至直肠周围脂肪。有1个肿大的直肠周围淋巴结，没有远端转移的证据。患者接受术前化放疗。手术前，临床和影像学检查均未发现肿瘤，达到临床完全缓解。进行手术后，病理报告显示残留肿瘤侵入粘膜下层。16个淋巴结无肿瘤迹象，但1个淋巴结含有粘蛋白湖。对于该患者，TNM分类为

任何治疗前：cT3N1M0

新辅助治疗后：ycT0N0M0

手术后：ypT1N0M0

如本文所用，术语“免疫评分”是指如实施例中所述在获自患者的肿瘤活检样品中测定的CD3+和CD8+T细胞密度的组合。Immunoscore

如本文所用，术语“百分位数”具有其在本领域中的一般含义并且是指在统计中使用的指示一组观察值中给定百分比的观察值低于该值的测量。例如，第20个百分位数是一个值(或分数)，低于该值可发现20％的观察值。等效地，80％的观测值位于第20个百分位数以上。术语百分位和相关术语百分位等级通常用于报告常模参考测试的分数。例如，如果分数位于第86个百分位，其中86是百分位排名，则它等于低于该值的86％的观察值(仔细对比第86个百分位，这意味着分数位于或低于可能发现86％的观察值的值——每个分数都在第100个百分位)。第25个百分位数也称为第一个四分位数(Q1)，第50个百分位数称为中位数或第二个四分位数(Q2)，第75个百分位数称为第三个四分位数(Q3)。通常，百分位数和四分位数是特定类型的分位数。

如本文所用，术语“算术平均值”具有其在本领域中的一般含义并且是指通过将两个或多个数字或变量相加然后除以数字或变量的数量而得到的量。

如本文所用，术语“中值”具有其在本领域中的一般含义并且是指将数据样本、总体或概率分布的较高一半与较低一半分开的值。对于数据集，它可能被认为是“中间”值。

如本文所用，术语“组合”或“组合的”被定义为可能选择的一定数量的参数，以及使用数学公式或算法将这些参数排列到特定组中。

如本文所用，术语“循环肿瘤DNA”或“ctDNA”具有本领域的一般含义，是指来自癌细胞并在血流中发现的DNA。

如本文所用，术语“射线照相术”是指利用穿透辐射的记录技术，其包括高能辐射，例如X射线、γ射线、β射线和快电子。

如本文所用，术语“超声成像”是指采用声波(例如，频率大于或等于20,000Hz)来产生患者身体的内部结构的实时图像(或“超声图”)的医学成像模态。在一些实施方案中，患者身体的内部结构可以是不透光的。术语“超声成像(ultrasound imaging)”、“超声检查(sonography)”和“声学成像(acoustic imaging)”在本文中可以互换使用。如本文所用，术语“三维”超声可指在三个维度上有效且准确的超声图像。三维超声模态的实例可以包括对比增强超声(“CEUS”)成像。

如本文所用，术语“磁共振成像”或“MRI”，也称为磁共振断层扫描(MRT)，涉及放射学中最常使用的医学成像技术，以可视化身体的结构和功能。它提供了身体在任何平面上的详细图像。MRI使用非电离辐射，但使用强大的磁场来排列体内水中氢原子的核磁化(通常)。射频场用于系统地改变这种磁化的排列，导致氢原子核产生扫描仪可检测到的旋转磁场。这个信号可以被额外的磁场操纵，以建立足够的信息来构建身体的图像。当受试者躺在扫描仪中时，动物体内水分子中大量存在的氢原子核(即质子)被强主磁场排列。然后，以射频振荡并垂直于主场的第二个电磁场产生脉冲，将一部分质子推离主场。然后，这些质子漂移回与主场排列，同时发出可检测的射频信号。由于身体不同组织(例如，脂肪VS肌肉)中的质子以不同的速度重新排列，因此可以揭示身体的不同结构。

如本文所用，术语“闪烁扫描术”是指一种记录技术，其中通过使用放射性同位素获得具有辐射源的身体的二维图像。将放射性化学物质注射到患者体内，然后将其集中在目标细胞或目标器官中。通过在身体上放置一个感测放射性的相机，可以创建目标细胞或目标器官的图像。粒子可以通过合适的装置检测，例如伽马照相机、正电子发射断层扫描(PET)机、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)机等。

如本文所用，术语“正电子发射断层扫描成像”或“PET成像”在本文中用于指使用PET捕获图像，特别是活体的图像。应当理解，该术语包括作为该技术的结果接收到的动态图像和静止图像。“正电子发射断层扫描”(PET)是一种核医学成像技术，可生成人体功能过程的三维图像或图片。PET扫描仪检测由正电子发射放射性核素(示踪剂)间接发射的成对伽马射线，该核素通过生物活性分子被引入体内。然后，通过计算机分析重建体内3维空间中示踪剂浓度的图像。

如本文所用，术语“计算机断层扫描”或“CT”是指采用断层扫描的医学成像方法，其中数字几何处理用于从围绕单个旋转轴拍摄的大量二维X射线图像生成物体内部的三维图像。本文使用的术语是非排他性的，包括基于CT的方法和组合方法，例如PET/CT。

如本文所用，术语“算法”是采用一个或多个连续参数并计算输出值(有时称为“指标”或“指标值”)的任何数学方程、算法、分析或程序化过程或统计技术。”

如本文所用，术语“数字病理学”是病理学的一个子领域，其侧重于基于数字化标本载玻片生成的信息的数据管理。应当理解，这样的图像将具有表示组织特征的图像中的特征，例如形状和颜色以及纹理。这些特征可以通过使用基于计算机的技术以定量形式提取。

本发明的方法：

本发明涉及预测实体癌患者在术前辅助治疗后复发和/或死亡风险的方法，其包括评估至少两个参数的步骤，其中第一个参数是在术前辅助治疗前确定的免疫应答且第二个参数是在所述术前辅助治疗后确定的临床应答，并且其中所述参数的组合指示复发和/或死亡的风险。

在一些实施方案中，本发明的方法特别适用于预测复发时间。

在一些实施方案中，本发明的方法特别适用于预测患者的生存时间。特别地，本发明的方法特别适用于预测癌症患者的总生存期(OS)、无进展生存期(PFS)和/或无病生存期(DFS)的持续时间。更特别地，本发明的方法特别适用于预测无病生存期。

癌症：

典型地，接受上述方法的患者可患有选自下组的实体癌：肾上腺皮质癌、肛门癌、胆管癌(例如外周癌、远端胆管癌、肝内胆管癌)、膀胱癌、骨癌(例如成骨细胞瘤、骨软骨瘤、血管瘤、软骨粘液样纤维瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、骨巨细胞瘤、脊索瘤、多发性骨髓瘤)、脑和中枢神经系统癌症(例如脑膜瘤、胞质细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、胶质瘤、髓母细胞瘤、神经节胶质瘤、神经鞘瘤、生殖细胞瘤、颅咽管瘤)、乳腺癌(如导管原位癌、浸润性导管癌、浸润性小叶癌、小叶原位癌、男性乳房发育症)、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌(如子宫内膜腺癌、腺棘皮瘤、乳头状浆液性腺癌、透明细胞癌)、食道癌、胆囊癌(粘液腺癌、小细胞癌)、消化道类癌(如绒毛膜癌、绒毛膜腺瘤)、卡波氏肉瘤、肾癌(如肾细胞癌)、喉癌和下咽癌、肝癌(如血管瘤、肝腺瘤、局灶性结节性增生、肝细胞癌)、肺癌(如小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、间皮瘤、浆细胞瘤、鼻腔和鼻窦癌(如感觉神经母细胞瘤、中线肉芽肿)、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔和口咽癌、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤(如胚胎性横纹肌肉瘤、肺泡状横纹肌肉瘤、多形性横纹肌肉瘤)、唾液腺癌、皮肤癌(如黑色素瘤、非黑色素瘤皮肤癌)、胃癌、睾丸癌癌症(例如精原细胞瘤、非精原细胞瘤生殖细胞癌)、胸腺癌、甲状腺癌(例如滤泡癌瘤、间变性癌、低分化癌、甲状腺髓样癌)、阴道癌、外阴癌和子宫癌(例如子宫平滑肌肉瘤)。

在一些实施方案中，患者患有原发性癌症。在一些实施方案中，患者患有局部晚期癌症。在一些实施方案中，患者患有II期TNM癌症。在一些实施方案中，患者患有III期TNM癌症。

在一些实施方案中，患者患有转移性癌症。在一些实施方案中，患者患有IV期TNM癌症。

在一些实施方案中，患者患有食道癌、直肠癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、头颈癌或肝癌。

在一些实施方案中，患者患有结直肠癌并且更具体地患有直肠癌。在一些实施方案中，患者患有局部晚期直肠癌。

术前辅助治疗：

在一些实施方案中，术前辅助治疗包括放疗、化疗、靶向治疗、激素治疗、免疫治疗或其组合。在一些实施方案中，术前辅助治疗包括放疗和化疗的组合。

可用于术前辅助靶向治疗的靶标的非限制性实例选自HER1/EGFR抑制剂(EGFRvIII、磷酸化(p-)EGFR、EGFR:Shc、泛素化(u-)EGFR、p-EGFRvIII)；ErbB2(p-ErbB2、p95HER2(截短的ErbB2)、p-p95HER2、ErbB2:Shc、ErbB2:PI3K、ErbB2:EGFR、ErbB2:ErbB3、ErbB2:ErbB4)；ErbB3(p-ErbB3、截短的ErbB3、ErbB3：PI3K、p-ErbB3：PI3K、ErbB3：Shc)；ErbB4(p-ErbB4、ErbB4:Shc)；c-MET(pc-MET、截短的c-MET、c-Met：HGF复合物)；AKT1(p-AKT1)；AKT2(p-AKT2)；AKT3(p-AKT3)；PTEN(p-PTEN)；P70S6K(p-P70S6K)；MEK(p-MEK)；ERK1(p-ERK1)；ERK2(p-ERK2)；PDK1(p-PDK1)；PDK2(p-PDK2)；SGK3(p-SGK3)；4E-BP1(p-4E-BP1)；PIK3R1(p-PIK3R1)；c-KIT(PC-KIT)；ER(p-ER)；IGF-1R(p-IGF-1R、IGF-1R：IRS、IRS：PI3K、p-IRS、IGF-1R：PI3K)；INSR(p-INSR)；FLT3(p-FLT3)；HGFR1(p-HGFR1)；HGFR2(p-HGFR2)；RET(p-RET)；PDGFRA(p-PDGFRA)；PDGFRB(p-PDGFRB)；VEGFR1(p-VEGFR1、VEGFR1：PLCγ、VEGFR1：Src)；VEGFR2(p-VEGFR2、VEGFR2：PLCγ、VEGFR2：Src、VEGFR2：硫酸肝素、VEGFR2：VE-钙粘蛋白)；VEGFR3(p-VEGFR3)；FGFR1(p-FGFR1)；FGFR2(p-FGFR2)；FGFR3(p-FGFR3)；FGFR4(p-FGFR4)；TIE1(p-TIE1)；TIE2(p-TIE2)；EPHA(p-EPHA)；EPHB(p-EPHB)；GSK-3β(p-GSK-3β)；NFKB(p-NFKB)、IKB(p-IKB、p-P65:IKB)；BAD(p-BAD，BAD:14-3-3)；mTOR(p-mTOR)；Rsk-1(p-Rsk-1)；Jnk(p-Jnk)；P38(p-P38)；STAT1(p-STAT1)；STAT3(p-STAT3)；FAK(p-FAK)；RB(p-RB)；Ki67；p53(p-p53)；CREB(p-CREB)；c-Jun(p-c-Jun)；c-Src(p-c-Src)；桩蛋白(paxillin)(p-桩蛋白)；GRB2(p-GRB2)、Shc(p-Shc)、Ras(p-Ras)、GAB1(p-GAB1)、SHP2(p-SHP2)、GRB2(p-GRB2)、CRKL(p-CRKL)、PLCγ(p-PLCγ)、PKC(例如、p-PKCα、p-PKCβ、p-PKCδ)、内收蛋白(adducin)(p-内收蛋白)、RB1(p-RB1)和PYK2(p-PYK2)。

此类抑制剂的实例包括有机小分子HER2酪氨酸激酶抑制剂，例如可从Takeda获得的TAK165；CP-724,714，ErbB2受体酪氨酸激酶的口服选择性抑制剂(Pfizer和OSI)；双HER抑制剂，例如EKB-569(可从Wyeth获得)，它优先结合EGFR但同时抑制HER2和EGFR过表达细胞；GW72016(可从Glaxo获得)，一种口服HER2和EGFR酪氨酸激酶抑制剂；PKI-166(可从Novartis获得)；泛HER抑制剂，如卡纳替尼(CI-1033；Pharmacia)；非选择性HER抑制剂，例如甲磺酸伊马替尼(Gleevec

示例性激素治疗剂包括但不限于醋酸环丙孕酮、阿比特龙、非那雄胺、氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、乙基己烯雌酚(DES)、醋酸甲地孕酮、磷雌酚、磷酸艾莫司汀、亮丙瑞林、曲普瑞林、戈舍瑞林、组瑞林、布舍瑞林、阿巴瑞克和地加瑞克。

在一些实施方案中，术前辅助放疗是接触放疗。

可用于术前辅助化疗的化疗药物包括但不限于烷化剂，如噻替哌、环磷酰胺；烷基磺酸盐，如白消安、亚普消和匹泊消；氮丙啶类，如苯并多巴、碳醌、甲苯多巴和脲多巴；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，包括六甲糖胺、三亚乙基三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基三聚氰胺；番荔枝内酯(尤其是泡番荔枝辛和布拉它辛酮)；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓抑素；卡利抑素；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；隐藻素(特别是隐藻素1和隐藻素8)；海兔毒素；多卡霉素(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；刺五加素；胰抑素；匍枝珊瑚醇；海绵抑素；氮芥类，如苯丁酸氮芥、氯萘嗪、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氮芥、美法仑、诺维比欣、苯内酯、泼尼莫司汀、曲磷酰胺、尿嘧啶芥；亚硝基脲类，例如卡莫司汀、氯脲佐菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷尼司汀；抗生素，如烯二炔类抗生素(例如，加利车霉素，尤其是卡利霉素丙种和卡利霉素欧米伽；动力霉素，包括动力霉素A；双膦酸盐，如氯膦酸盐；埃斯帕霉素；以及新制癌菌素生色团和相关的色素蛋白烯二炔抗生素生色团、阿克拉霉素、放线菌素、authrarnycin、重氮乙酰丝氨酸、博来霉素类、放线菌素C、carabicin、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、更生霉素、道诺红菌素、二乙氧醋酰阿霉素、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉-多柔比星、蓝吗啉-多柔比星、2-吡咯烷-多柔比星和脱氧多柔比星)、阿霉素表柔比星、依柔比星、伊达比星、马赛洛霉素、丝裂霉素(如丝裂霉素C)、麦考酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培普霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、克拉霉素、罗柔比星、链黑霉素、链佐佐星、结核菌素、乌苯美司、津诺他丁、佐美替比星；抗代谢剂，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如蝶呤、甲氨蝶呤、蝶呤、三甲蝶呤；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫氨普林、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、多西氟尿苷、依西他滨、氟尿苷；雄激素，如二甲睾酮、丙酸屈膜斯酮、表硫甾烷醇、环戊缩环硫雄烷、睾内酯；抗肾上腺药，如氨基鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，如泡沫亚麻酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；贝曲舒；比生群；依达曲沙；脱发胺(defofamine)；去甲秋水仙；地亚醌；艾尔福亚胺；醋酸椭圆铵；埃坡霉素；依托糖；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；洛尼定宁；美登木素生物碱，如美登素和安丝菌素；米妥瓜酮；米托蒽醌；莫匹丹莫；硝氮碱；喷司他丁；菲纳梅特；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK多糖复合物)；雷佐生；根瘤菌素；西唑呋喃；螺锗；特努阿佐尼酸；三亚醌；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、维拉库林A、罗瑞丁A和安古定)；氨基甲酸乙酯；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；米托布罗糖醇；米托乳醇；匹泊布满；加胞嘧啶；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉醇类，例如紫杉醇和多西他赛；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂配位络合物，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺凡特隆；替尼泊苷；依达曲酯；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，如视黄酸；卡培他滨；和任何上述的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

可用于术前辅助免疫治疗的免疫检查点抑制剂实例包括抗CTLA4抗体、抗PD1抗体、抗PDL1抗体、抗PDL2抗体、抗TIM-3抗体、抗LAG3抗体、抗IDO1抗体抗体、抗TIGIT抗体、抗B7H3抗体、抗B7H4抗体、抗BTLA抗体和抗B7H6抗体。

抗CTLA-4抗体的实例描述于美国专利号：5,811,097；5,811,097；5,855,887；6,051,227；6,207,157；6,682,736；6,984,720；和7,605,238。一种抗CDLA-4抗体是西木单抗(ticilimumab，CP-675,206)。在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体是普利姆玛(也称为10D1，MDX-D010)，一种结合CTLA-4的全人单克隆IgG抗体。

PD-1和PD-L1抗体的实例描述于美国专利号7,488,802；7,943,743；8,008,449；8,168,757；8,217,149和PCT公布的专利申请号：WO03042402、WO2008156712、WO2010089411、WO2010036959、WO2011066342、WO2011159877、WO2011082400和WO2011161699。在一些实施方案中，PD-1阻断剂包括抗PD-L1抗体。在某些其他实施方案中，PD-1阻断剂包括抗PD-1抗体和类似的结合蛋白，例如纳武利尤单抗(MDX1106、BMS936558、ONO4538)，一种通过其配体PD-Ll和PD-L2结合并阻断PD-1激活的全人IgG4抗体；兰博利珠单抗(MK-3475或SCH900475)，一种针对PD-1的人源化单克隆IgG4抗体；CT-011，一种结合PD-1的人源化抗体；AMP-224是B7-DC的融合蛋白；抗体Fc部分；用于PD-L1(B7-H1)封锁的BMS-936559(MDX-1105-01)。

其他免疫检查点抑制剂包括淋巴细胞激活基因3(LAG-3)抑制剂，例如IMP321，一种可溶性Ig融合蛋白((Brignone et al.,2007,J.Immunol.179:4202-4211)。

其他免疫检查点抑制剂包括B7抑制剂，例如B7-H3和B7-H4抑制剂。特别是抗B7-H3抗体MGA271(Loo et al.,2012,Clin.Cancer Res.July 15(18)3834)。

其他免疫检查点抑制剂包括TIM3(T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3)抑制剂(Fourcade et al.,2010,J.Exp.Med.207:2175-86and Sakuishi et al.,2010,J.Exp.Med.207:2187-94)。例如，抑制剂可以抑制TIM-3的表达或活性，调节或阻断TIM-3信号通路和/或阻断TIM-3与半乳糖凝集素9的结合。对TIM-3具有特异性的抗体是本领域众所周知的，并且典型地是在WO2011155607、WO2013006490和WO2010117057中描述的那些。

在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂，优选IDO1抑制剂。IDO抑制剂的实例描述于WO2014150677中。IDO抑制剂的实例包括但不限于1-甲基-色氨酸(IMT)、β-(3-苯并呋喃基)-丙氨酸、β-(3-苯并(b)噻吩基)-丙氨酸)、6-硝基色氨酸、6-氟色氨酸、4-甲基色氨酸、5-甲基色氨酸、6-甲基色氨酸、5-甲氧基色氨酸、5-羟基色氨酸、吲哚3-甲醇、3,3'-二吲哚基甲烷、表没食子儿茶素没食子酸酯、5-溴-4-氯-吲哚酚、1,3-二乙酸酯、9-乙烯基咔唑、阿西美辛、5-溴色氨酸、5-溴吲哚酚二乙酸酯、3-氨基萘甲酸、吡咯烷二硫代氨基甲酸酯、4-苯基咪唑芸苔素衍生物、乙内酰硫脲衍生物、β-咔啉衍生物或芸苔素衍生物。优选地，IDO抑制剂选自1-甲基-色氨酸、β-(3-苯并呋喃基)-丙氨酸、6-硝基-L-色氨酸、3-氨基-萘甲酸和β-[3-苯并(b)噻吩基]-丙氨酸或其衍生物或前药。

在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗TIGIT(T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域)抗体。

在术前辅助治疗前评估免疫应答：

在一些实施方案中，通过量化在术前辅助化疗之前从患者获得的活检肿瘤样品中确定的至少一种免疫标志物来评估免疫应答。因此，在一些实施方案中，该方法包括量化从患者获得的肿瘤活检样品中的至少一种免疫标志物的步骤。

在一些实施方案中，肿瘤活检样本来自原发性肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤活检样本来自转移。

在一些实施方案中，肿瘤活检样品涵盖从肿瘤中取出的组织块或切片，用于进一步量化一种或多种免疫标志物，特别是通过组织学或免疫组织化学方法、通过流式细胞术方法和通过基因或蛋白质表达方法分析，包括基因组和蛋白质组分析。当然，可以对肿瘤活检样品进行各种众所周知的收集后制备和储存技术(例如，固定、储存、冷冻等)。样品可以是新鲜的、冷冻的、固定的(例如福尔马林固定的)或包埋的(例如石蜡包埋的)。典型地，肿瘤活检样本固定在福尔马林中并包埋在刚性固定剂中，例如石蜡(蜡)或环氧树脂，将其置于模具中，然后硬化以产生易于切割的块。然后，可以使用切片机制备材料的薄片，将其放置在载玻片上并提供给例如免疫组织化学(使用IHC自动化设备，例如BenchMark

在所述实施方案中，免疫标志物的量化典型地通过下文描述的免疫组织化学(IHC)来进行。在所述实施方案中，免疫适应性响应标志物的量化典型地通过确定至少一种基因的表达水平来进行。

在一些实施方案中，标志物包括来自免疫系统的细胞的存在或数量或密度。在一些实施方案中，标志物包括来自免疫系统的细胞特异性产生的蛋白质的存在或蛋白质的量。在一些实施方案中，标志物包括任何生物材料的存在或量，其指示与宿主的特定免疫应答的产生相关的基因水平。因此，在一些实施方案中，标志物包括从基因组DNA转录的信使RNA(mRNA)的存在或量，所述信使RNA编码由来自免疫系统的细胞特异性产生的蛋白质。在一些实施方案中，标志物包括由来自免疫系统的细胞特异性表达的表面抗原，包括由B淋巴细胞、T淋巴细胞、单核细胞/巨噬细胞树突状细胞、NK细胞、NKT细胞和NK-DC细胞，或可选地编码用于所述表面抗原的mRNA。

当用多于一种免疫标志物执行本发明的方法时，在步骤a)中定量的不同免疫标志物的数量通常少于100种不同的标志物，并且在大多数实施方案中少于50种不同的标志物。使用本发明的方法，用于获得准确和可靠的预后所必需的不同免疫标志物的数量可根据定量技术的类型而显著变化。示例性地，当本发明的方法通过目标蛋白质标志物的原位免疫组织化学检测进行时，可以发现少量免疫标志物的组合具有高统计显着性。示例性地，如实施例中所公开的，仅用一种标志物或两种标志物的组合获得了高统计显著性。进一步示例性地，当本发明的方法通过目标基因标记的基因表达分析进行时，也发现少量免疫标记具有高统计显著性。不希望受任何特定理论的束缚，发明人认为，当通过使用用于免疫标志物定量的基因表达分析，以及通过使用十种不同的免疫标志物的组合，更优选十五种不同的免疫标志物的组合，最优选二十种不同的免疫标志物，或更多来执行本发明的方法时，达到了高统计相关性(P值低于10

典型地是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50种不同的可以量化免疫标志物的组合，优选2、3、4、5、6、7、8、9或10种免疫标志物的组合，更优选2、3、4、5或6种免疫标志物的组合。

许多专利申请已经描述了大量指示免疫应答状态的免疫标志物，其可用于本发明的方法。典型地，可以使用WO2015007625、WO2014023706、WO2014009535、WO2013186374、WO2013107907、WO2013107900、WO2012095448、WO2012072750、WO2012095448、WO2012072750和WO2007045996中描述的免疫标志物(全部通过引用并入)。

在一些实施方案中，指示免疫应答状态的免疫标志物是WO2007045996中描述的那些。

在一些实施方案中，可以使用的免疫标志物是来自免疫系统的细胞的细胞密度。在一些实施方案中，免疫标志物包括CD3+细胞密度、CD8+细胞密度、CD45RO+细胞密度、GZM-B+细胞密度、CD103+细胞密度和/或B细胞密度。更优选地，免疫标志物包括CD3+细胞密度和CD8+细胞密度、CD3+细胞密度和CD45RO+细胞密度、CD3+细胞密度GZM-B+细胞密度、CD8+细胞密度和CD45RO+细胞密度、CD8+细胞密度和GZM-B+细胞密度；CD45RO+细胞的密度和GZM-B+细胞的密度或CD3+细胞的密度和CD103+细胞的密度。

在一些实施方案中，确定肿瘤活检样本中的CD3+细胞密度和CD8+细胞密度。

在一些实施方案中，还可以测量B细胞的密度(参见WO2013107900和WO2013107907)。在一些实施方案中，还可以测量DC细胞的密度(参见WO2013107907)。

典型地，WO2013186374中公开的方法可用于量化肿瘤样品中的免疫细胞。

在一些实施方案中，指示免疫应答状态的免疫标志物可包括WO2007045996的表9中列出的一种或多种基因或相应蛋白质的表达水平，它们是：18s、ACE、ACTB、AGTR1、AGTR2、APC、APOA1、ARF1、AXIN1、BAX、BCL2、BCL2L1、CXCR5、BMP2、BRCA1、BTLA、C3、CASP3、CASP9、CCL1、CCL11、CCL13、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL5、CCL7、CCL8、CCNB1、CCND1、CCNE1、CCR1、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCRL2、CD154、CD19、CD1a、CD2、CD226、CD244、PDCD1LG1、CD28、CD34、CD36、CD38、CD3E、CD3G、CD3Z、CD4、CD40LG、CD5、CD54、CD6、CD68、CD69、CLIP、CD80、CD83、SLAMF5、CD86、CD8A、CDH1、CDH7、CDK2、CDK4、CDKN1A、CDKN1B、CDKN2A、CDKN2B、CEACAM1、COL4A5、CREBBP、CRLF2、CSF1、CSF2、CSF3、CTLA4、CTNNB1、CTSC、CX3CL1、CX3CR1、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL9、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CYP1A2、CYP7A1、DCC、DCN、DEFA6、DICER1、DKK1、Dok-1、Dok-2、DOK6、DVL1、E2F4、EBI3、ECE1、ECGF1、EDN1、EGF、EGFR、EIF4E、CD105、ENPEP、ERBB2、EREG、FCGR3A、、CGR3B、FN1、FOXP3、FYN、FZD1、GAPD、GLI2、GNLY、GOLPH4、GRB2、GSK3B、GSTP1、GUSB、GZMA、GZMB、GZMH、GZMK、HLA-B、HLA-C、HLA-、MA、HLA-DMB、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DPA1、HLA-DQA2、HLA-DRA、HLX1、HMOX1、HRAS、HSPB3、HUWE1、ICAM1、ICAM-2、ICOS、ID1、ifna1、ifna17、ifna2、ifna5、ifna6、ifna8、IFNAR1、IFNAR2、IFNG、IFNGR1、IFNGR2、IGF1、IHH、IKBKB、IL10、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL13、IL13RA2、IL15、IL15RA、IL17、IL17R、IL17RB、IL18、IL1A、IL1B、IL1R1、IL2、IL21、IL21R、IL23A、IL23R、IL24、IL27、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL31RA、IL4、IL4RA、IL5、IL6、IL7、IL7RA、IL8、CXCR1、CXCR2、IL9、IL9R、IRF1、ISGF3G、ITGA4、ITGA7、整合素alpha E(抗原CD103、人黏膜淋巴细胞、抗原1；α多肽)、基因hCG33203、ITGB3、JAK2、JAK3、KLRB1、KLRC4、KLRF1、KLRG1、KRAS、LAG3、LAIR2、LEF1、LGALS9、LILRB3、LRP2、LTA、SLAMF3、MADCAM1、MADH3、MADH7、MAF、MAP2K1、MDM2、MICA、MICB、MKI67、MMP12、MMP9、MTA1、MTSS1、MYC、MYD88、MYH6、NCAM1、NFATC1、NKG7、NLK、NOS2A、P2X7、PDCD1、PECAM-、、CXCL4、PGK1、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、PLAT、PML、PP1A、CXCL7、PPP2CA、PRF1、PROM1、PSMB5、PTCH、PTGS2、PTP4A3、PTPN6、PTPRC、RAB23、RAC/RHO、RAC2、RAF、RB1、RBL1、REN、Drosha、SELE、SELL、SELP、SERPINE1、SFRP1、SIRP beta 1、SKI、SLAMF1、SLAMF6、SLAMF7、SLAMF8、SMAD2、SMAD4、SMO、SMOH、SMURF1、SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS6、SOCS7、SOD1、SOD2、SOD3、SOS1、SOX17、CD43、ST14、STAM、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6、STK36、TAP1、TAP2、TBX21、TCF7、TERT、TFRC、TGFA、TGFB1、TGFBR1、TGFBR2、TIM-3、TLR1、TLR10、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TNF、TNFRSF10A、TNFRSF11A、TNFRSF18、TNFRSF1A、TNFRSF1B、OX-40、TNFRSF5、TNFRSF6、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFSF10、TNFSF6、TOB1、TP53、TSLP、VCAM1、VEGF、WIF1、WNT1、WNT4、XCL1、XCR1、ZAP70和ZIC2。

在一些实施方案中，免疫标志物是描述于WO2014023706(通过引用并入)中的那些。在该实施方案下，在本发明的方法中评估了代表人类适应性免疫应答的单个基因和代表人类免疫抑制应答的单个基因(一对基因)的表达水平EL

在一些实施方案中，代表适应性免疫应答的基因选自Th1适应性免疫、细胞毒性应答或记忆应答的共调节基因簇，并且可以编码Th1细胞表面标志物，白细胞介素(或白细胞介素受体)，或趋化因子或(趋化因子受体)。在一些实施方案中，代表适应性免疫应答的基因选自下组：

-趋化因子和趋化因子受体家族，包括：CXCL13、CXCL9、CCL5、CCR2、CXCL10、CXCL11、CXCR3、CCL2和CX3CL1，

-细胞因子家族，包括：IL15，

-TH1家族，包括：IFNG、IRF1、STAT1、STAT4和TBX21

-淋巴细胞膜受体家族，包括：ITGAE、CD3D、CD3E、CD3G、CD8A、CD247、CD69和ICOS，

-细胞毒性分子家族，包括：GNLY、GZMH、GZMA、GZMB、GZMK、GZMM和PRF1，

和激酶LTK。

在一些实施方案中，代表适应性免疫应答的基因选自下组：CCL5、CCR2、CD247、CD3E、CD3G、CD8A、CX3CL1、CXCL11、GZMA、GZMB、GZMH、GZMK、IFNG、IL15、IRF1、ITGAE、PRF1、STAT1和TBX21。

在一些实施方案中，代表适应性免疫应答的基因典型地可以选自共同调节的适应性免疫基因组，而免疫抑制基因可以代表免疫细胞(例如树突细胞)的失活并且可以有助于诱导免疫抑制应答。

在一些实施方案中，代表免疫抑制应答的基因或相应蛋白质选自下组：CD274、CTLA4、IHH、IL17A、PDCD1、PF4、PROM1、REN、TIM-3、TSLP和VEGFA。

在实施本发明的优选条件下，代表适应性免疫应答的基因选自下组：GNLY、CXCL13、CX3CL1、CXCL9、ITGAE、CCL5、GZMH、IFNG、CCR2、CD3D、CD3E、CD3G、CD8A、CXCL10、CXCL11、GZMA、GZMB、GZMK、GZMM、IL15、IRF1、LTK、PRF1、STAT1、CD69、CD247、ICOS、CXCR3、STAT4、CCL2和TBX21，并且代表免疫抑制应答的基因选自下组：PF4、REN、VEGFA、TSLP、IL17A、PROM1、IHH、CD1A、CTLA4、PDCD1、CD276、CD274、TIM-3和VTCN1(B7H4)。

因为当结合一种适应性基因和一种免疫抑制基因时，一些基因更常被发现是显著的，最优选的基因是：

-代表适应性免疫应答的基因：CD3G、CD8A、CCR2和GZMA

-代表免疫抑制应答的基因：REN、IL17A、CTLA4和PDCD1。

在实施本发明的进一步优选条件下，代表适应性免疫应答的基因和代表免疫抑制应答的基因分别选自由上表1和2的基因组成的组。

两对基因(总共4个基因)的优选组合是

-CCR2、CD3G、IL17A和REN；以及

-CD8A、CCR2、REN和PDCD1。

在一些实施方案中，指示免疫应答状态的免疫标志物是描述于WO2014009535(通过引用并入)中的那些。指示免疫应答状态的免疫标志物可以包括一种或多种选自下组的基因的表达水平：CCR2、CD3D、CD3E、CD3G、CD8A、CXCL10、CXCL11、GZMA、GZMB、GZMK、GZMM、IL15、IRF1、PRF1、STAT1、CD69、ICOS、CXCR3、STAT4、CCL2和TBX21。

在一些实施方案中，指示免疫应答状态的免疫标志物是描述于WO2012095448(通过引用并入)中的那些。指示免疫应答状态的免疫标志物可以包括一种或多种选自下组的基因的表达水平：GZMH、IFNG、CXCL13、GNLY、LAG3、ITGAE、CCL5、CXCL9、PF4、IL17A、TSLP、REN、IHH、PROM1和VEGFA。

在一些实施方案中，指示免疫应答状态的免疫标志物是描述于WO2012072750(通过引用并入)中的那些。指示免疫应答状态的免疫标志物可以包括miRNA簇的表达水平，所述miRNA簇包括：miR.609、miR.518c、miR.520f、miR.220a、miR.362、miR.29a、miR.660、miR.603、miR.558、miR519b、miR.494、miR.130a或miR.639。

在一些实施方案中，免疫应答通过输入如上所述的一种或多种免疫标志物的量化值的评分系统评估。

在一些实施方案中，评分系统是连续评分系统。在一些实施方案中，连续评分系统输入一种或多种免疫标志物的绝对量化值。在一些实施方案中，连续评分系统输入在从患者获得的肿瘤活检样本中确定的细胞密度的绝对量化值。在一些实施方案中，连续评分系统输入CD3+细胞密度的绝对量化值和CD8+细胞密度的绝对量化值。根据这些实施方案，评分系统输出连续变量(即分数)。

在一些实施方案中，免疫应答通过连续评分系统评估，所述连续评分系统包含以下步骤：a)量化从所述患者获得的肿瘤活检样本中的一种或多种免疫标志物；

b)将在步骤a)获得的所述一种或多种免疫标志物的每个值与从患有所述癌症的参考组患者中获得的所述一种或多种免疫标志物的每一个的值的分布进行比较；

c)对于在步骤a)获得的所述一种或多种免疫标志物的每个值，确定在步骤a)获得的值对应的分布的百分位数；

d)计算百分位数的算术平均值或中值。

在一些实施方案中，免疫应答通过连续评分系统评估，所述连续评分系统包含以下步骤：

a)量化从所述患者获得的肿瘤活检样本中的CD3+细胞密度和CD8+细胞密度；

b)将在步骤a)获得的每个密度值与从患有所述癌症的患者参考组中获得的值的分布进行比较；

c)对于在步骤a)获得的每个密度值，确定在步骤a)获得的值对应的分布的百分位数；

d)计算百分位数的算术平均值。

在一些实施方案中，评分系统是非连续系统。在一些实施方案中，评分系统是非连续系统，其中将一种或多种免疫标志物的绝对量化值分配给预定的区间。在一些实施方案中，评分系统是非连续系统，其中从患者获得的肿瘤活检样本中确定的细胞密度的绝对量化值被分配到“高”或“低”区间。在一些实施方案中，评分系统是非连续系统，其中从患者获得的肿瘤活检样本中确定的CD3+和CD8+细胞密度的绝对量化值被分配到“高”或“低”区间。根据这些特定实施方案，将细胞密度值与预定参考值进行比较，并因此根据细胞密度是低于或高于预定参考值而分配给“低”或“高”区间。根据这些实施方案，评分系统输出非连续变量，例如“低”、“中”和“高”。

在一些实施方案中，免疫应答通过非连续评分系统评估，所述非连续评分系统包含以下步骤：

a)量化从所述患者获得的肿瘤活检样本中的一种或多种免疫标志物；

b)将在步骤a)获得的所述一种或多种免疫标志物的每个值与从患有所述癌症的参考组患者中获得的所述一种或多种免疫标志物中的每一个的值的分布进行比较；

c)对于在步骤a)中获得的所述一种或多种免疫标志物的每个值，确定在步骤a)获得的值对应的分布的百分位数；

d)计算百分位数的算术平均值或中值；和

e)将在步骤d)获得的百分位数的算术平均值或中值与百分位数的预定参考算术平均值或预定中值进行比较，以及

f)根据百分位数的算术平均值或中值分别是否低于或高于百分位数的预定参考算术平均值或预定中值来分配“低”或“高”分数。

在一些实施方案中，免疫应答通过评分系统评估，所述评分系统包含以下步骤：

a)量化从所述患者获得的肿瘤活检样本中的CD3+细胞密度和CD8+细胞密度；

b)将在步骤a)获得的每个密度值与从患有所述癌症的患者参考组中获得的值分布进行比较；

c)对于在步骤a)获得的每个密度值，确定在步骤a)获得的值对应的分布的百分位数；

d)计算百分位数的算术平均值；和

e)将在步骤d)获得的算术平均值与百分位数的预定参考算术平均值进行比较，和

f)根据百分位数的算术平均值分别低于或高于百分位数的预定参考算术平均值，分配“低”或“高”分数。

在一些实施方案中，免疫应答通过评分系统评估，所述评分系统包含以下步骤：

a)量化从所述患者获得的肿瘤活检样本中的CD3+细胞密度和CD8+细胞密度；

b)将在步骤a)获得的每个密度值与从患有所述癌症的患者参考组中获得的值的分布进行比较；

c)对于在步骤a)获得的每个密度值，确定在步骤a)获得的值对应的分布的百分位数；

d)计算百分位数的算术平均值；和

e)将在步骤d)获得的百分位数的算术平均值与2个预定的参考算术平均值百分位数进行比较，和

f)根据算术平均值是否满足以下来分配“低”“中”或“高”分数：

-低于百分位数的最低预定参考算术平均值(“低”)

-介于百分位数的2个预定参考算术平均值之间(“中”)

-高于百分位数的最高预定参考算术平均值(“高”)。

在一些实施方案中，非连续评分系统是实施例中描述的免疫评分。

在一些实施方案中，用于评估免疫应答的评分系统涉及数字病理学，如本文下文和实施例中所述。

在一些实施方案中，评分系统是自动评分系统。

用于量化免疫标志物的方法：

任何一种本领域技术人员已知的用于量化本文涵盖的细胞类型、蛋白质类型或核酸类型免疫标志物的方法均可用于实施本发明的癌症预后方法。因此，可以容易地应用本领域众所周知的用于检测和量化样品中的蛋白质或核酸的任何一种标准和非标准(新兴)技术。

可以通过多种众所周知的任何一种用于检测转录的核酸或蛋白质的表达的方法来评估本发明的免疫标志物的表达。此类方法的非限制性实例包括用于检测分泌的、细胞表面的、细胞质的或核蛋白的免疫学方法、蛋白质纯化方法、蛋白质功能或活性测定方法、核酸杂交方法、核酸逆转录方法和核酸扩增方法。

在一些实施方案中，使用以下评估标志物的表达：抗体(例如放射性标记的、发色团标记的、荧光团标记的、聚合物-主链-抗体或酶标记的抗体)、抗体衍生物(例如与底物或与蛋白质或蛋白质-配体对(protein-ligand pair)的配体(例如生物素-链霉抗生物素蛋白)，或抗体片段(例如单链抗体，分离的抗体高变区等)，其与标记蛋白或其片段特异性结合，包括已经过其全部或部分正常翻译后修饰的标记蛋白。

在一些实施方案中，免疫标志物或一组免疫标志物可以用本领域已知的任何一种免疫组织化学方法进行定量。

典型地，为了进一步分析，首先将肿瘤的一个薄切片与针对一种目标免疫标志物的标记抗体一起孵育。洗涤后，根据标记抗体携带的标记种类，通过适当的技术显示与所述目标免疫标志物结合的标记抗体，例如放射性标记、荧光标记或酶标记。可以同时进行多个标记。

免疫组织化学典型地包括以下步骤：i)用福尔马林固定肿瘤活检样本，ii)将所述肿瘤活检样本包埋在石蜡中，iii)将所述肿瘤活检样本切成切片用于染色，iv)将所述切片与具有特异性免疫标志物的结合伴侣一起孵育，v)漂洗所述切片，vi)将所述切片与典型的生物素化的二抗一起孵育，以及vii)典型地用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物显示抗原-抗体复合物。因此，首先将肿瘤活检样本与具有免疫标志物的结合伴侣一起孵育。洗涤后，根据标记抗体携带的标记种类，通过适当的技术显示与免疫标志物结合的标记抗体，例如放射性标记、荧光标记或酶标记。可以同时进行多个标记。或者，本发明的方法可以使用与扩增系统(以加强染色信号)和酶促分子偶联的二级抗体。这种偶联的二抗是可商购的，例如来自Dako，EnVision system。可以使用复染，例如苏木精&伊红、DAPI、赫希斯特。其他染色方法可以使用本领域技术人员显而易见的任何合适的方法或系统来完成，包括自动、半自动或手动系统。

例如，一种或多种标记可以连接到抗体上，从而允许检测靶蛋白(即免疫标志物)。示例性标记包括放射性同位素、荧光团、配体、化学发光剂、酶及其组合。可以与主要和/或次要亲和配体缀合的标记的非限制性实例包括：荧光染料或金属(例如荧光素、罗丹明、藻红蛋白、荧光胺)、发色染料(例如视紫红质)、化学发光化合物(例如鲁米那、咪唑)和生物发光蛋白(如荧光素、荧光素酶)、半抗原(如生物素)。在Stryer L(1968)Science 162:526-533and Brand L and Gohlke J R(1972)Annu.Rev.Biochem.41:843-868中描述了多种其他有用的荧光剂和生色团。也可以用酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-内酰胺酶)、放射性同位素(例如

在一些实施方案中，使用观察可检测信号和获取图像的系统分别对所得染色样本进行成像，例如染色的数字图像。用于图像采集的方法是本领域技术人员众所周知的。例如，一旦样本被染色，任何光学或非光学成像装置都可用于检测染色或生物标记标记，例如正置或倒置光学显微镜、扫描共焦显微镜、照相机、扫描或隧道电子显微镜、罐头探针显微镜和成像红外探测器。在一些实例中，可以以数字方式捕获图像。获得的图像然后可用于定量或半定量确定样品中免疫检查点蛋白的量，或对目标标志物呈阳性的细胞的绝对数量，或对目标标志物呈阳性的细胞表面。适用于IHC的各种自动样品处理、扫描和分析系统在本领域是可用的。此类系统可包括自动染色和显微扫描、计算机化图像分析、连续切片比较(以控制样本方向和大小的变化)、数字报告生成以及样本存档和跟踪(例如摆放在载玻片上的组织切片)。细胞成像系统是可商购的，它将传统光学显微镜与数字图像处理系统相结合，对细胞和组织(包括免疫染色样品)进行定量分析。参见，例如，CAS-200系统(Becton，Dickinson&Co.)。特别地，可以手动或通过涉及计算机处理器和软件的图像处理技术进行检测。例如，使用此类软件，可以使用本领域技术人员已知的程序基于包括例如染色质量或染色强度的因素配置、校准、标准化和/或验证图像(参见例如美国公开的专利公开号US20100136549)。可以基于样品的染色强度对图像进行定量或半定量分析和评分。定量或半定量组织化学是指对经过组织化学处理的样品进行扫描和评分的方法，以识别和量化特定生物标志物(即免疫检查点蛋白)的存在。定量或半定量方法可以使用成像软件来检测染色密度或染色量或通过人眼检测染色的方法，其中经过训练的操作员会对结果进行数字排序。例如，可以使用像素计数算法和组织识别模式(例如Aperio Spectrum软件、自动定量分析平台(AQUA

因此，在一些实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：i)提供一张或多张组织切片的免疫染色切片，该切片通过使用能够选择性地与免疫标志物相互作用的结合伴侣通过自动载玻片染色系统获得，ii)通过高分辨率扫描捕获对步骤i)的载玻片进行数字化，iii)检测数字图片上的组织切片，iv)提供尺寸参考网格，其具有相同表面的均匀分布的单元，所述网格适应待分析的组织切片的大小，以及v)检测、量化和测量强度或每个单元中染色细胞的绝对数量。

多重组织分析技术对于量化肿瘤活检样本中的几种免疫检查点蛋白特别有用。此类技术应允许从单个肿瘤活检样本中测量至少五种、或至少十种或更多生物标志物。此外，该技术有利于保留生物标志物的定位，并能够区分癌细胞和非癌细胞中生物标志物的存在。此类方法包括分层免疫组织化学(L-IHC)、分层表达扫描(LES)或多重组织免疫印迹(MTI)的教导，例如美国专利号6,602,661、6,969,615、7,214,477和7,838,222；美国专利公开号2011/0306514(通过引用并入本文)；以及Chung&Hewitt,Meth Mol Biol,ProtBlotting Detect,Kurlen&Scofield,eds.536:139-148,2009，每篇参考文献都教导可以用在分层和印迹的膜、纸、过滤器等上制作最多8张、最多9张、最多10张、最多11张或更多的组织切片图像。用于进行L-IHC/MTI过程的涂层膜可从20/20Gene Systems,Inc.(Rockville,MD)获得。

在一些实施方案中，L-IHC方法可以对多种组织样品中的任何一种进行，无论是新鲜的还是保存的。样本包括核心针活检，其通常固定在10％的正常缓冲福尔马林中，并在病理部门进行处理。将标准的5μm厚组织切片从组织块切除，用于L-IHC的带电载玻片上。因此，L-IHC能够通过获得从组织切片转移到多个生物亲和涂层膜的分子副本来测试组织切片中的多个标志物，从本质上产生组织“图像”的副本。在石蜡切片的情况下，组织切片如本领域已知的那样被脱石蜡，例如，将切片暴露于二甲苯，或二甲苯替代品如NEO-CLEAR

在一些实施方案中，本方法利用多重组织印记(MTI)技术来测量生物标志物，其中该方法通过允许多个生物标志物(在一些情况下至少六个生物标志物)来保存宝贵的活检组织。

在一些实施方案中，存在替代的多重组织分析系统，其也可用作本发明的一部分。一种此类技术是基于质谱的选择反应监测(SRM)测定系统(“液体组织”可从OncoPlexDx(Rockville,MD)获得)。该技术描述于美国专利号7,473,532。

在一些实施方案中，本发明的方法利用由GE Global Research(Niskayuna,NY)开发的多重IHC技术。该技术描述于美国公开号2008/0118916和2008/0118934。其中涉及，对包含多个目标的生物样品进行顺序分析，包括将荧光探针与样品结合，然后进行信号检测，使探针失活，然后将探针与另一个目标结合，检测并失活，并继续这个过程直到已检测到所有目标。

在一些实施方案中，可以在使用荧光(例如荧光团或量子点)时执行多重组织成像，其中可以用多光谱成像系统测量信号。多光谱成像是一种技术，其中收集图像每个像素的光谱信息，并使用光谱图像处理软件分析所得数据。例如，该系统可以拍摄一系列不同波长的图像，这些图像是电子的且可连续选择，然后与设计用于处理此类数据的分析程序一起使用。因此，该系统能够同时从多种染料获得定量信息，即使当染料的光谱高度重叠或它们共定位时，或出现在样品中的同一点时，只要光谱曲线不同。许多生物材料在被较高能量的光激发时会自动发出荧光或发出较低能量的光。该信号可能导致图像和数据对比度较低。没有多光谱成像能力的高灵敏度相机仅随荧光信号增加自发荧光信号。多光谱成像可以从组织中分离或分离出自发荧光，从而提高可实现的信噪比。简而言之，量化可以通过以下步骤进行：i)提供从患者获得的肿瘤组织微阵列(TMA)，ii)然后用具有目标免疫检查点蛋白特异性的抗抗体对TMA样品进行染色，iii)TMA载玻片进一步用上皮细胞标志物染色，以协助肿瘤和间质的自动分割，iv)然后使用多光谱成像系统扫描TMA载玻片，v)使用自动图像分析软件处理扫描图像(例如Perkin Elmer Technology)，它允许通过强大的模式识别算法检测、量化和分割特定组织。机器学习算法之前典型地经过训练，以从基质中分割肿瘤并识别标记的细胞。

确定来自患者的肿瘤样品中基因的表达水平可以通过本领域熟知的一组技术来实施。

在一些实施方案中，基因的表达水平通过确定由该基因产生的mRNA的量来评估。

用于确定mRNA量的方法是本领域众所周知的。例如，首先根据标准方法提取样品(例如，从患者制备的细胞或组织)中包含的核酸，例如使用裂解酶，或化学溶液，或按照制造商的说明通过核酸结合树脂提取。然后，通过杂交(例如，Northern印迹分析)和/或扩增(例如，RT-PCR)检测提取的mRNA。优选定量或半定量RT-PCR。实时定量或半定量RT-PCR是特别有利的。

其他扩增方法包括连接酶链式反应(LCR)、转录介导扩增(TMA)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)、RNA定量新一代测序(NGS)。

包含至少10个核苷酸并与本文目标mRNA表现出序列互补性或同源性的核酸可用作杂交探针或扩增引物。应当理解，此类核酸不需要完全相同，但典型地与相当大小的同源区域至少约80％相同，更优选85％相同，甚至更优选90-95％相同。在一些实施方案中，将核酸与适当的手段(如可检测标记)组合用于检测杂交将是有利的。多种合适的指示剂是本领域已知的，包括荧光、放射性、酶促或其他配体(例如亲和素/生物素)。

探针典型地包含长度在10至1000个核苷酸之间，例如10至800个，更优选15至700个，典型的20至500个核苷酸的单链核酸。引物典型地是较短的单链核酸，长度在10到25个核苷酸之间，设计用于完全或几乎完全匹配待扩增的目标核酸。探针和引物对其杂交的核酸具有“特异性”，即它们优选在高严格杂交条件下杂交(对应于最高解链温度Tm，例如，50％甲酰胺、5x或6x SCC。SCC是0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠)。

在上述扩增和检测方法中可以用作引物或探针的核酸可以组装成试剂盒。这样的试剂盒包括共有引物和分子探针。优选的试剂盒还包括确定是否发生扩增所必需的成分。试剂盒还可以包括，例如，PCR缓冲液和酶；阳性对照序列、反应对照引物；以及用于扩增和检测特定序列的说明。

在一些实施方案中，可以通过用数字寡核苷酸条形码标记生物标志物(在其DNA、RNA或蛋白质中)来评估本发明的免疫标志物的表达，并测量或计算条形码的数量。

在一些实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：提供从卵丘细胞中提取的总RNA，使RNA扩增并与特异性探针杂交，更特别地通过定量或半定量RT-PCR。

使用所公开的方法制备的探针可用于核酸检测，例如原位杂交(ISH)程序(例如，荧光原位杂交(FISH)、显色原位杂交(CISH)和银原位杂交(SISH))或比较基因组杂交(CGH)。

原位杂交(ISH)涉及在中期或间期染色体制备(例如载玻片上的细胞或组织样品)的情况下，将含有目标核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)的样品与可特异性杂交或特异性针对靶核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)的标记探针接触。任选地对载玻片进行预处理，例如，以去除石蜡或可干扰均一杂交的其他材料。样品和探针都经过处理，例如通过加热使双链核酸变性。探针(在合适的杂交缓冲液中配制)和样品在一定条件下结合，并且持续足够的时间以允许杂交发生(典型地达到平衡)。洗涤染色体制品以去除多余的探针，并使用标准技术检测染色体靶标的特异性标记。

例如，可以使用荧光素标记的亲和素或亲和素-碱性磷酸酶检测生物素化探针。对于荧光染料检测，可以直接检测荧光染料，或者可以将样品与例如异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的抗生物素蛋白一起孵育。如有必要，可通过与生物素缀合的山羊抗亲和素抗体孵育、洗涤并与FITC偶联的亲和素进行第二次孵育来实现FITC信号的放大。为了通过酶活性检测，可以将样品与例如链霉亲和素一起孵育、洗涤、与生物素缀合的碱性磷酸酶一起孵育、再次洗涤并预平衡(例如，在碱性磷酸酶(AP)缓冲液中)。对于原位杂交程序的一般描述，参见，例如美国专利号4,888,278。

许多用于FISH、CISH和SISH的程序是本领域已知的。例如，执行FISH的程序在美国专利号5,447,841、5,472,842和5,427,932中；例如，在Pinkel et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.83:2934-2938,1986；Pinkel et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.85:9138-9142,1988；and Lichter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.85:9664-9668,1988中。CISH描述于例如Tanner et al.,Am.J.Pathol.157:1467-1472,2000和美国专利号6,942,970中。其他检测方法在美国专利号6,280,929中。

许多试剂和检测方案可与FISH、CISH和SISH程序结合使用，以提高灵敏度、分辨率或其他所需特性。如上所述，在执行FISH时，可以直接光学检测利用荧光团(包括荧光染料和QUANTUMDOTS

在其他实例中，探针或特异性结合剂(例如抗体，例如一抗、受体或其他结合剂)用酶标记，该酶能够将荧光或生色组合物转化为可检测的荧光、有色或其他可检测信号(例如，如SISH中可检测金属颗粒的沉积)。如上所述，酶可以直接或通过接头间接连接至相关探针或检测试剂。合适的试剂(例如，结合试剂)和化学物质(例如，接头和连接化学物质)的实例描述于美国专利公开号2006/0246524；2006/0246523和2007/0117153中。

本领域技术人员将理解，通过适当地选择标记的探针特异性结合剂对，可以产生多重检测方案以促进在一次试验中(例如，在单个细胞或组织样本上或在一个以上的细胞或组织样本上)检测多个靶核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)。例如，对应于第一靶序列的第一探针可用第一半抗原标记，例如生物素，而对应于第二靶序列的第二探针可用第二半抗原标记，例如DNP。在将样品暴露于探针之后，可以通过使样品与第一特异性结合剂(在这种情况下，用第一荧光团标记的抗生物素蛋白，例如，第一光谱不同的QUANTUM DOT

探针典型地包含长度为10至1000个核苷酸的单链核酸，例如10至800，更优选15至700，典型为20至500。引物典型地是较短的单链核酸，长度在10到25个核苷酸之间，其被设计成完全或几乎完全匹配目标核酸，以进行扩增。探针和引物对其杂交的核酸具有“特异性”，即它们优选在高严格杂交条件下杂交(对应于最高解链温度Tm，例如50％甲酰胺、5x或6x SCC。SCC是0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠)。

上述扩增和检测方法中使用的核酸引物或探针可以组装成试剂盒。这样的试剂盒包括共有引物和分子探针。优选的试剂盒还包括确定是否发生扩增所必需的成分。该试剂盒还可以包括，例如，PCR缓冲液和酶；阳性对照序列、反应对照引物；以及用于扩增和检测特定序列的说明。

在一些实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：提供从卵丘细胞中提取的总RNA，使RNA扩增并与特异性探针杂交，更特别地通过定量或半定量RT-PCR。

在另一个优选实施方案中，表达水平通过DNA芯片分析来确定。这种DNA芯片或核酸微阵列由不同的核酸探针组成，这些探针化学连接到基质上，基质可以是微芯片、载玻片或微球大小的珠子。微芯片可以由聚合物、塑料、树脂、多糖、二氧化硅或基于二氧化硅的材料、碳、金属、无机玻璃或硝化纤维素构成。探针包含核酸，例如cDNA或寡核苷酸，其可以是约10至约60个碱基对。为了确定表达水平，来自测试对象的样品，任选地首先进行逆转录，被标记并在杂交条件下与微阵列接触，导致目标核酸之间形成复合物，这些目标核酸与连接到微阵列表面的探针序列互补。然后，检测标记的杂交复合物，并可对其进行定量或半定量。标记可以通过多种方法实现，例如通过使用放射性或荧光标记。微阵列杂交技术的许多变体可供本领域技术人员使用(参见例如Hoheisel的综述，Nature Reviews,Genetics,2006,7:200-210)。

基因的表达水平可以表示为绝对表达水平或标准化表达水平。在本方法中可以使用两种类型的值。当定量PCR用作评估表达水平的方法时，基因的表达水平优选地表示为标准化表达水平，因为实验开始时的小差异可在多个循环后提供巨大差异。

在一些实施方案中，nCounter

典型地，表达水平通过以下方式标准化：通过将其表达与确定患者的癌症分期无关的基因(例如组成型表达的持家基因)的表达进行比较，来校正基因的绝对表达水平。用于标准化的合适基因包括管家基因，例如肌动蛋白基因ACTB、核糖体18S基因、GUSB、PGK1和TFRC。这种标准化允许将一个样品(例如患者样品)的表达水平与另一样品的表达水平进行比较，或比较来自不同来源的样品。

在术前辅助治疗后评估临床应答：

在一些实施方案中，在术前辅助治疗后的临床应答通过本领域任何熟知的方法评估。典型地，通过影像学(如CT扫描、MRI、IRM回波扫描)、活检、液体活检、细胞学、循环血液中测量的肿瘤生物标志物水平、ctDNA水平、循环肿瘤细胞水平和/或切除肿瘤的病理学分析来评估临床应答。

在一些实施方案中，临床应答是通过评估ctDNA的水平来确定的。用于确定ctDNA水平的方法是本领域众所周知的。例如，在WO2012/028746中描述了该方法。因此，Q-PCR是用于确定所述水平的优选方法。在一些实施方案中，该方法包括扩增和量化核靶核酸序列的步骤。根据本发明，核靶核酸序列是位于核人类基因组中的序列。技术人员因此可以容易地选择合适的核靶核酸序列。患有癌症的患者体内的无核酸细胞由肿瘤和非肿瘤来源的核酸构成。因此，在一些实施方案中，核靶核酸序列是突变靶核酸序列，即携带目标肿瘤突变的核酸。因此，重要的是选择具有肿瘤起源的突变以仅量化源自癌细胞的核酸。在一些实施方案中，突变位于KRAS基因或TP53基因中。例如，突变位于选自下组的基因：TP53(394、395、451、453、455、469、517、524、527、530、586、590、637、641、724、733、734、743、744、817、818、819、820、839、844、916)或PIK3CA(1530、1624、1633、1634、1636、1656、3140、3140、3140)。KRAS突变可以包括如上所述的任何突变。典型地，靶核酸序列的长度在160到210个碱基对之间。在一些实施方案中，靶核酸序列的长度为160、165、170、175、180、185、190、195、200、205或210个碱基对。

在一些实施方案中，临床应答是通过评估肿瘤体积的减少来确定的，该肿瘤体积已经用作实体瘤中反应评估的标准。在一些实施方案中，肿瘤体积的减少通过成像评估。

在一些实施方案中，临床应答通过放射照相评估。例如，对于患有乳腺癌的患者，通过乳房摄影术来评估肿瘤体积的减少。

在一些实施方案中，临床应答通过超声成像评估。在一些实施方案中，超声成像是三维超声成像。在一些实施方案中，超声成像涉及原色多普勒的使用。多普勒超声血管化包括对以下参数的评估：血流信号的数量、峰值流速、电阻率指数(RI)和搏动指数(PI)。它还允许对肿瘤中的异常血管结构进行无创评估，称为新血管生成。肿瘤血管化的这些变化与组织病理学应答相关，因此，血管化研究可以作为一种补充工具来评估对术前辅助治疗的应答，主要是在局部晚期乳腺癌中。

在一些实施方案中，临床应答通过磁共振评估。磁共振成像提高了放射成像在监测对术前辅助治疗的应答中评估的准确性，因此它与可能的保守手术的评估相关。

在一些实施方案中，临床应答通过闪烁扫描法评估。在一些实施方案中，螯合金属是Tc、In、Ga、Y、Lu、Re、Cu、Ac、Bi、Pb、Sm、Sc、Co、Ho、Gd、Eu、Tb或Dy。在一些实施方案中，金属是同位素，例如放射性同位素。在一些实施方案中，同位素是Tc-94m、Tc-99m、ln-111、G-67、Ga-68、Y-86、Y-90、Lu-177、Re-186、Re-188、Cu-64、Cu-67、Co-55、Co-57、Sc-47、Ac-225、Bi-213、Bi-212、Pb-212、Sm-153、Ho-166或Dy-166。在一些实施方案中，闪烁扫描法涉及使用锝(99mTc)甲氧基异丁基异腈，其是一种用于核医学成像的药剂。该药物是一种配位络合物，由与六个(sesta＝6)甲氧基异丁基异腈(MIBI)配体结合的放射性同位素锝-99m组成。99mTc-甲氧基异丁基异腈在癌中的积累和流出机制涉及对肿瘤的治疗响应很重要的细胞过程。

在一些实施方案中，临床应答通过正电子发射断层扫描/计算机断层扫描(PET/CT)来评估。正电子发射断层扫描(PET)是一种强大的技术，可以对体内的生化或生理过程进行成像。疾病的代谢和生物活动总是先于疾病的任何解剖学证据。PET是一种生物成像技术，不会像X射线、计算机断层扫描(CT)或磁共振成像(MRI)那样取代解剖成像，而是增加了对体内正常或患病组织中发生的简单分子过程的表征。正电子是电子的反粒子。当它从原子核拼写出来时，它只会移动很短的距离。在穿越几毫米的过程中，相邻的原子被电离，且正电子失去能量并减速。然后，正电子与一个电子配对并发生湮灭相互作用，产生一对511KeV的湮灭光子，这些光子沿相反方向传播，到达PET辐射探测器进行成像。PET和CT图像的融合对于解剖和生理信息的准确部位的关联非常有用。在PET肿瘤成像中，最广泛使用的放射性药物是2-[18F]-氟-2-脱氧-D-葡萄糖(18F-FDG)。生化上，18F-FDG是一种非生理性化合物，其化学结构与天然存在的葡萄糖非常相似；它作为细胞葡萄糖代谢的外部标志物。无创成像细胞葡萄糖代谢的能力在肿瘤学应用中很重要，因为许多癌细胞以更高的速率使用葡萄糖。可以测量肿瘤中放射性示踪剂的绝对定量摄取，以努力区分恶性组织和良性组织。命名为标准摄取值(SUV)，可用于测量肿瘤代谢功能。

在一些实施方案中，通过在术前辅助治疗之前和之后对准肿瘤的图像来了解肿瘤体积的减少。在一些实施方案中，对准图像允许在逐个像素或逐个体素的基础上量化变化，这用来提供了一种非常灵敏的方法来检测、量化和空间显示图像对比度的变化，并因此使用从各种成像方式获得的图像进行临床应答，例如但不限于磁共振成像(MRI)、计算机断层扫描(CT)、二维平面X-射线、正电子发射断层扫描(PET)、超声波(US)、光学成像(即荧光、近红外(NIR)和生物发光)和单光子发射计算机断层扫描(SPECT)。在给定的仪器源(例如MRI、CT、X射线、PET和SPECT)中，可以生成各种数据。例如，MRI设备可以生成扩散、灌注、渗透性、标准化和光谱图像，这些图像包括含有例如但不限于

在一些实施方案中，临床应答由评分系统评估。在一些实施方案中，临床应答由非连续评分系统评估。在一些实施方案中，临床应答由ycTNM评分系统评估。在一些实施方案中，当原始质量变得不可检测时，认为实现了完全临床应答(cCR)。在一些实施方案中，部分应答(cPR)表示二维肿瘤测量值减少50％或更多。在一些实施方案中，如果二维测量值增加20％或更多，则检测到进行性疾病(cPD)。在一些实施方案中，所有其他临床应答被归类为疾病稳定(cSD)。

算法的用途：

在一些实施方案中，本发明的方法涉及算法的使用。

在一些实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：

a)评估至少两个参数，其中第一个参数是在所述术前辅助治疗前确定的免疫应答且第二个参数是在所述术前辅助治疗后确定的临床应答

b)对包含步骤a)中评估的参数或由步骤a)中评估的参数组成的数据实施算法以获得算法输出，实施步骤由计算机实施；和

c)由在步骤b)获得的算法输出确定复发和/或死亡的风险。

算法的非限制性示例包括总和、比率和回归运算符，例如系数或指数、生物标志物值转换和标准化(包括但不限于那些基于临床参数(例如性别、年龄或种族)的标准化方案)，规则和指导方针、统计分类模型以及针对历史人群训练的神经网络。算法的非限制性示例因此包括逻辑回归、线性回归、随机森林、分类和回归树(C&RT)、提升树、神经网络(NN)、人工神经网络(ANN)、神经模糊网络(NFN)、网络结构、感知器，例如多层感知器、多层前馈网络、支持向量机(例如核方法)、多元自适应回归样条(MARS)、Levenberg-Marquardt算法、Gauss-Newton算法、混合高斯、梯度下降算法、学习矢量量化(LVQ)及其组合。在组合参数中特别有用的是线性和非线性方程以及统计分类分析，以确定所述参数的水平与对术前辅助治疗的客观应答之间的关系。特别感兴趣的是结构和句法统计分类算法，以及风险指数构建方法，利用模式识别特征，包括已建立的技术，如互相关、主成分分析(PCA)、因子旋转、逻辑回归(LogReg)、线性判别分析(LDA)、特征基因线性判别分析(ELDA)、支持向量机(SVM)、随机森林(RF)、递归分区树(RPART)以及其他相关决策树分类技术、收缩质心(SC)、StepAIC、K最近邻、提升、决策树、神经网络、贝叶斯网络、支持向量机和隐马尔可夫模型等。其他技术可用于生存和事件危险分析的时间，包括本领域技术人员熟知的Cox、Weibull、Kaplan-Meier和Greenwood模型。

在一些实施方案中，本发明的方法包括使用机器学习算法。机器学习算法可以包括监督学习算法。监督学习算法的实例可以包括平均单相关估计器(AODE)、人工神经网络(例如反向传播)、贝叶斯统计(例如朴素贝叶斯分类器、贝叶斯网络、贝叶斯知识库)、基于案例的推理、决策树、归纳逻辑编程、高斯过程回归、数据处理组方法(GMDH)、学习自动机、学习向量量化、最小消息长度(决策树、决策图等)、懒惰学习、基于实例的学习最近邻算法、类比建模、概率近似正确学习(PAC)学习、向下波动规则、知识获取方法、符号机器学习算法、子符号机器学习算法、支持向量机、随机森林、分类器集合、自举聚合(装袋)和提升方法。监督学习可以包括顺序分类，例如回归分析和信息模糊网络(IFN)。或者，监督学习方法可以包括统计分类，例如AODE、线性分类器(例如，Fisher线性判别、逻辑回归、朴素贝叶斯分类器、感知器和支持向量机)、二次分类器、k最近邻、提升方法、决策树(例如，C4.5、随机森林)、贝叶斯网络和隐马尔可夫模型。机器学习算法还可以包括无监督学习算法。无监督学习算法的示例可能包括人工神经网络、数据聚类、期望最大化算法、自组织映射、径向基函数网络、矢量量化、生成拓扑映射、信息瓶颈法和IBSEAD。无监督学习还可以包括关联规则学习算法，例如Apriori算法、Eclat算法和FP-生长算法。也可以使用层次聚类，例如单链接聚类和概念聚类。或者，无监督学习可以包括分区聚类，例如K-means算法和模糊聚类。在一些实施方案中，机器学习算法包括强化学习算法。强化学习算法的实例包括但不限于时间差分学习、Q-学习和学习自动机。或者，机器学习算法可以包括数据预处理。

在一些实施方案中，所述算法是在使用众所周知的计算机处理器、存储单元、存储设备、计算机软件和其他组件的计算机上实现的。典型地，计算机包含处理器，该处理器通过执行定义这种操作的计算机程序指令来控制计算机的整体操作。计算机程序指令可以存储在存储设备(例如，磁盘)中，并且在需要执行计算机程序指令时加载到存储器中。计算机还包括使用户能够与计算机交互的其他输入/输出设备(例如，显示器、键盘、鼠标、扬声器、按钮等)。本领域的技术人员将认识到，实际计算机的实现也可以包含其他组件。

在一些实施方案中，该算法是使用以客户端-服务器关系运行的计算机来实现的。典型地，在该系统中，客户端计算机远离服务器计算机并通过网络进行交互。客户端-服务器关系可以由在各自的客户端和服务器计算机上运行的计算机程序来定义和控制。在一些实施方案中，结果可以显示在系统上用于显示，例如用LED或LCD。因此，在一些实施方案中，该算法可以在计算系统中实现，所述计算系统包括后端组件，例如作为数据服务器，或包括中端组件，例如应用程序服务器，或包括前端组件，例如具有图形用户界面或Web浏览器的客户端计算机，用户可以通过它与实现交互，或一个或多个这样的后端、中端或前端组件的任意组合。系统的组件可以通过数字数据通信的任何形式或媒介互连，例如通信网络。通信网络的示例包括局域网(“LAN”)和广域网(“WAN”)，例如因特网。计算系统可以包括客户端和服务器。客户端和服务器通常彼此远离并且典型地通过通信网络进行交互。客户端和服务器的关系是由于计算机程序在各自的计算机上运行并且彼此具有客户端-服务器关系而产生的。

在一些实施方案中，所述算法在基于网络的云计算系统内实现。在这种基于网络的云计算系统中，连接到网络的服务器或另一处理器经由网络与一个或多个客户端计算机通信。例如，客户端计算机(例如移动设备，例如电话、平板电脑或膝上型计算机)可以经由驻留在客户端计算机上并在其上运行的网络浏览器应用程序与服务器通信。客户端计算机可以在服务器上存储数据并通过网络访问数据。客户端计算机可以通过网络向服务器发送数据请求或在线服务请求。服务器可以执行请求的服务并向客户端计算机提供数据。服务器还可以传输适合于使客户端计算机执行指定功能的数据，例如执行计算、在屏幕上显示指定数据等。例如，医生可以将参数(即输入数据)登记，然后通过远程通信链路，例如通过Internet的广域网(WAN)将数据传输到具有数据分析模块的服务器，该模块将实施算法并最终将输出(例如分数)返回给移动设备。

在一些实施方案中，输出结果可以并入临床决策支持(CDS)系统中。这些输出结果可以集成到电子病历(EMR)系统中。

换句话说，计算机程序产品和系统之间的交互使得能够执行本发明的方法。因此，本发明的方法是一种计算机实现的方法。这意味着该方法至少部分是计算机实现的。特别地，如果一些步骤是通过接收数据实现的，则每个步骤都可以由计算机实现。

该系统是台式计算机。在变体中，该系统是机架式计算机、膝上型计算机、平板计算机、个人数字助理(PDA)或智能电话。

在一些实施方案中，计算机适用于实时操作和/或者是嵌入式系统，特别是在诸如飞机的交通工具中。在当前情况下，该系统包括计算器、用户界面和通信设备。计算器是电子电路，适用于操纵和/或转换由系统X的寄存器中的电子或物理量表示的数据，和/或对应于寄存器存储器中其他类似数据中的存储器或其他种类的显示装置、传输装置或存储装置的物理数据。作为具体实例，计算器包括单核或多核处理器(例如中央处理器(CPU)、图形处理单元(GPU)、微控制器和数字信号处理器(DSP))、可编程逻辑电路(例如专用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)、可编程逻辑器件(PLD)和可编程逻辑阵列(PLA))、状态机、门控逻辑和分立硬件组件。该计算器包括适于处理数据(特别是通过执行计算)的数据处理单元、适于存储数据的存储器和适于读取计算机可读介质的读取器。用户界面包括输入设备和输出设备。输入设备是使系统的用户能够向系统输入信息或命令的设备。在当前情况下，输入设备是键盘。或者，输入设备是定点设备(例如鼠标、触摸板和数字化板)、语音识别设备、眼睛跟踪器或触觉设备(运动手势分析)。输出设备是图形用户界面，即适于向系统用户提供信息的显示单元。在当前情况下，输出设备是用于输出的视觉呈现的显示屏。在其他实施方案中，输出设备是打印机、增强和/或虚拟显示单元、扬声器或用于输出的可听呈现的另一发声设备、产生振动和/或气味的单元或适于产生电信号的单元。

在一些实施方案中，输入设备和输出设备是构成人机界面的相同部件，例如交互式屏幕。

通信设备使系统的组件之间能够进行单向或双向通信。例如，通信设备是总线通信系统或输入/输出接口。

在一些实施方案中，通信设备的存在使得计算器的组件彼此远离。

所述计算机程序产品包括计算机可读介质。计算机可读介质是可以由计算器的读取器读取的有形设备。值得注意的是，计算机可读介质本身不是瞬态信号，例如无线电波或其他自由传播的电磁波，例如光脉冲或电子信号。该计算机可读存储介质例如是电子存储设备、磁存储设备、光存储设备、电磁存储设备、半导体存储设备或其任何组合。作为更具体示例的非详尽列表，计算机可读存储介质是机械编码设备，例如凹槽中的打孔卡或凸起结构、软盘、硬盘、只读存储器(ROM)、随机存取存储器(RAM)、可擦除可编程只读存储器(EROM)、电可擦除可编程只读存储器(EEPROM)、磁光盘、静态随机存取存储器(SRAM)、光盘只读存储器(CD-ROM)、数字通用盘(DVD)、记忆棒、软盘、闪存、固态驱动盘(SSD)或PC卡，例如个人计算机存储卡国际协会(PCMCIA)。

在一些实施方案中，计算机程序存储在计算机可读存储介质中。计算机程序包括一个或多个存储的程序指令序列。这样的程序指令在由数据处理单元运行时导致执行本发明的方法的步骤。例如，程序指令的形式是源代码形式、计算机可执行形式或介于源代码和计算机可执行形式之间的任何中间形式，例如源代码通过解释器转换后的形式、汇编器、编译器、链接器或定位器。在变体中，程序指令是微码、固件指令(firmware instructions)、状态设置数据、集成电路的配置数据(例如VHDL)或目标代码。典型地，程序指令以一种或多种语言的任意组合编写，例如面向对象的编程语言(FORTRAN、C++、JAVA、HTML)、过程编程语言(例如C语言)。

在一些实施方案中，程序指令是通过网络从外部源下载的，尤其是应用程序的情况。在这种情况下，计算机程序产品包括其上存储有程序指令的计算机可读数据载体，或其上编码有程序指令的数据载体信号。在每种情况下，计算机程序产品包括可加载到数据处理单元中，并适于在由数据处理单元运行时导致执行本发明的方法的指令。根据该实施方案，执行完全或部分在系统上，即单个计算机上，或者在多个计算机之间的分布式系统中(特别是通过云计算)实现。

在一些实施方案中，上述方法以多种方式实现，特别是使用硬件、软件或其组合。特别地，每个步骤由适于实现该步骤的模块或适于通过与系统或包括该系统的特定设备的交互引起该步骤的执行的计算机指令来实现。还应当注意，取决于所考虑的实施方案，连续的两个步骤实际上可以基本上同时执行或以相反的顺序执行。

本发明方法的应用：

本发明的方法特别适用于在术前辅助治疗后的临床决策定向。

在一些实施方案中，当得出患者将具有低复发和/或死亡风险的结论时，可以决定器官保留策略。在过去的几十年里，局部晚期癌症中的术前辅助治疗、肿瘤切除和术后辅助治疗的标准使用极大地改善了肿瘤学结果。然而，这些改善伴随着显着的发病率和较差的生活质量。本发明的方法提供了识别具有特别好的临床结果同时保持生活质量的特定患者亚组的优势。在患者对保持生活质量的需求和兴趣的驱动下，本发明的方法提供了一种强有力的工具，用于实施器官保留策略以及观察和等待策略，从而可以保持反应患者的生活质量。更特别地，本发明的方法特别适用于管理围手术期发病率和死亡率的风险，特别是对于老年人。更特别地，本发明的方法特别适用于预防肛门直肠、性功能和泌尿功能的充分丧失，其最终导致患有结直肠癌的患者生活质量差。

特别地，当临床应答为ycTNM＝0-I时，免疫评分(例如百分位数的算术平均值或中值)越高，复发和/或死亡的风险越低，并且患者的生存时间越长(例如无病生存时间)，则因此可以决定器官保留策略。

特别地，当确定临床应答为ycTNM＝0-I，并且免疫评分被归类为“高”(例如百分位数的算术平均值或中值被归类为“高”)时，可以得出结论：患者复发和/或死亡的风险较低，因此患者的生存时间会更长，从而可以决定器官保留策略。

在一些实施方案中，当断定患者将具有高复发和/或死亡风险并因此生存时间短时，则决定根治性手术和辅助治疗。

因此，本发明的方法特别适用于确定患者在术前辅助治疗后是否适合根治性手术。

本发明将通过以下附图和实施例进一步说明。然而，这些实施例和附图不应以任何方式解释为限制本发明的范围。

附图说明：

图1.在A)ycTNM＝0或I和B)ycTNM＝II、III或IV的患者中，，通过新辅助治疗后的影像学确定的根据IS

图2.在Cox比例危害回归模型下，在A)ycTNM＝0或I和B)ycTNM＝II、III或IV的患者中，通过新辅助治疗后影像学确定的根据表示为连续变量(ISB平均分数，以百分位数表示)的2年和5年无病生存概率(IS

图3.在A)ycTNM＝0或I和B)ycTNM＝II、III或IV的患者中，通过新辅助治疗后影像学确定的根据IS

实施例：

患者和方法：

患者群体

对LARC患者的两个回顾性连续队列(n

临床结果

根据肿瘤对nT的应答程度，使用不同的肿瘤消退等级(TRG)评分系统比较患者：i/Dworak分类(21)定义为完全(Dworak4)、接近完全(Dworak3)、中等(Dworak2)、最小(Dworak1)和无回归(Dworak0)；ii/新辅助直肠(NAR)评分分类(5)，使用方程[5pN-3(cT-pT)+12]^2/9.61计算，并分类为低(<8)、中(8-16)和高(>16)；iii/ypTNM阶段,即术后病理T和N评估，以及iv/肿瘤下降期(4)，定义为完全(ypT0N0)、中等(ypT1-2N0)或弱/缺失(ypT3-4或N+)。对于接受手术的患者，事件是局部、全身复发和自手术之日起的无病生存期(DFS)死亡、复发至复发时间(TTR)以及任何原因导致的总生存期(OS)死亡。所有接受观察等待策略的患者都被认为具有临床完全反应(ycTNM0)，并提供了严格的监测方案。

免疫组织化学

从所有中心回收为诊断目的进行的所有患者的初始活检。两个4μm福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)肿瘤组织切片进行免疫化学处理，使用抗CD3+(2GV6，0.4μg/mL；Ventana，Tuscon，AZ，USA)和CD8+(C8/144B，3μg/mL；Dako，Glostrup，丹麦)的抗体，根据先前描述的方案(17)使用Ultraview通用DAB IHC检测试剂盒(Ventana，Tuscon，AZ，USA)显示，并用Mayer苏木精复染。

基于活检的免疫评分(IS

以20倍放大倍率和0.45μm/像素的分辨率(Nanozoomer HT,Hamamatsu,Japan)获得染色组织切片的数字图像。由经验丰富的病理学家(CL)对排除正常组织和低/高级别异型增生相关病变的肿瘤成分进行界定。肿瘤区域中CD3+和CD8+T细胞的平均密度是用Developer XD图像分析软件(Definiens,Munich,Germany)的专用IS模块确定的。监测染色强度的平均值和分布，提供内部染色质量控制。执行最终质量检查以去除由软件检测到的非特异性染色。IS

通过NanoString技术进行RNA提取和转录组学分析

使用RecoverAll

统计分析和数据可视化

统计分析和数据可视化是使用R软件3.5.1版和附加survival、survminer、ggpubr、ggplot2、rms和coin包进行的。IS

结果：

基于活检的免疫评分(IS

为诊断由nT治疗的LARC(n＝322)而进行的初始肿瘤活检中，对CD3+淋巴细胞和细胞毒性CD8+细胞进行了评估。监测免疫染色强度以确保使用图像分析软件(未显示)对染色细胞进行有效检测和计数。7名患者在生物标志物质量控制后被排除(2.8％)，4名患者在临床数据质量控制后被排除(1.2％)。肿瘤中CD3+和CD8+T细胞的平均密度分别为1363个细胞/mm

基于活检的免疫评分(IS

IS

基于活检的免疫评分(IS

我们调查了与IS

活检适应性免疫评分(IS

采用观察等待策略管理的患者中的IS

在一系列接受观察等待策略治疗的患者(n＝73)中，我们回收了初始诊断活检以评估IS

讨论：

这项工作强调了(i)由IS

IS

在目前的研究中，IS

这项研究有一些局限性。与预定义的分界点(即第25个和第70个百分位数)相关的免疫密度与研究的队列的临床特征密切相关。用作分界点的密度与手术前接受nT治疗的LARC患者相关。此外，对初始活检进行了IS

总之，我们的结果表明IS

表格：

/>

表4.根据活检适应免疫评分(IS

*多变量Cox回归模型的显著性通过Wald检验进行评估

-不适用

IS，免疫评分；PHA，比例风险假设；HR，风险比

参考文献：

在本申请中，各种参考资料描述了本发明所属领域的现状。这些参考文献的公开内容通过引用并入本公开中。

1.Araghi M,Soerjomataram I,Bardot A,Ferlay J,Cabasag CJ,Morrison DS,et al.Changes in colorectal cancer incidence in seven high-income countries:apopulation-based study.The Lancet Gastroenterology&Hepatology.2019；4:511–8.

2.Nielsen LBJ,Wille-

3.Glynne-Jones R,Wyrwicz L,Tiret E,Brown G,

4.Park IJ,You YN,Agarwal A,Skibber JM,Rodriguez-Bigas MA,Eng C,etal.Neoadjuvant Treatment Response As an Early Response Indicator for PatientsWith Rectal Cancer.J Clin Oncol.2012；30:1770–6.

5.George TJ,Allegra CJ,Yothers G.Neoadjuvant Rectal(NAR)Score:a NewSurrogate Endpoint in Rectal Cancer Clinical Trials.Curr Colorectal CancerRep.2015；11:275–80.

6.

7.Habr-Gama A,Perez RO,Nadalin W,Sabbaga J,Ribeiro U,Silva e SousaAH,et al.Operative Versus Nonoperative Treatment for Stage 0Distal RectalCancer Following Chemoradiation Therapy:Long-term Results.Transactions ofthe.Meeting of the American Surgical Association.2004；CXXII:309–16.

8.Habr-Gama A.Assessment and management of the complete clinicalresponse of rectal cancer to chemoradiotherapy.Colorectal Disease.2006；8:21–24.

9.van der Valk MJM,Hilling DE,Bastiaannet E,Meershoek-KleinKranenbarg E,Beets GL,Figueiredo NL,et al.Long-term outcomes of clinicalcomplete responders after neoadjuvant treatment for rectal cancer in theInternational Watch&Wait Database(IWWD):an international multicentre registrystudy.The Lancet.2018；391:2537–45.

10.Demaria S,Ng B,Devitt ML,Babb JS,Kawashima N,Liebes L,etal.Ionizing radiation inhibition of distant untreated tumors(abscopal effect)is immune mediated.International Journal of Radiation Oncology·Biology·Physics.2004；58:862–70.

11.Rodríguez-Ruiz ME,Vanpouille-Box C,Melero I,Formenti SC,DemariaS.Immunological Mechanisms Responsible for Radiation-Induced AbscopalEffect.Trends in Immunology.2018；39:644–55.

12.Chajon E,Castelli J,Marsiglia H,Crevoisier RD.The synergisticeffect of radiotherapy and immunotherapy:A promising but not simplepartnership.Critical Reviews in Oncology/Hematology.2017；111:124–32.

13.Fridman WH,Pagès F,Sautès-Fridman C,Galon J.The immune contexturein human tumours:impact on clinical outcome.Nat Rev Cancer.2012；12:298–306.

14.Pagès F,Berger A,Camus M,Sanchez-Cabo F,Costes A,Molidor R,etal.Effector Memory T Cells,Early Metastasis,and Survival in ColorectalCancer.New England Journal of Medicine.2005；353:2654–66.

15.Galon J.Type,Density,and Location of Immune Cells Within HumanColorectal Tumors Predict Clinical Outcome.Science.2006；313:1960–4.

16.Shinde V,Burke KE,Chakravarty A,Fleming M,McDonald AA,Berger A,etal.Applications of Pathology-Assisted Image Analysis of Immunohistochemistry-Based Biomarkers in Oncology.Vet Pathol.2014；51:292–303.

17.Pagès F,Mlecnik B,Marliot F,Bindea G,Ou F-S,Bifulco C,etal.International validation of the consensus Immunoscore for theclassification of colon cancer:a prognostic and accuracy study.TheLancet.2018；391:2128–39.

18.Anitei M-G,Zeitoun G,Mlecnik B,Marliot F,Haicheur N,Todosi A-M,etal.Prognostic and Predictive Values of the Immunoscore in Patients withRectal Cancer.Clinical Cancer Research.2014；20:1891–9.

19.Yasuda K,Nirei T,Sunami E,Nagawa H,Kitayama J.Density of CD4(+)andCD8(+)T lymphocytes in biopsy samples can be a predictor of pathologicalresponse to chemoradiotherapy(CRT)for rectal cancer.Radiat Oncol.2011；6:49.

20.Shinto E,Hase K,Hashiguchi Y,Sekizawa A,Ueno H,Shikina A,et al.CD8+and FOXP3+Tumor-Infiltrating T Cells Before and After Chemoradiotherapy forRectal Cancer.Ann Surg Oncol.2014；21:414–21.

21.Dworak O,Keilholz L,Hoffmann A.Pathological features of rectalcancer after preoperative radiochemotherapy.International journal ofcolorectal disease.1997；12:19–23.

22.Hiotis SP,Weber SM,Cohen AM,Minsky BD,Paty PB,Guillem JG,etal.Assessing the predictive value of clinical complete response toneoadjuvant therapy for rectal cancer:an analysis of 488 patients1 1Nocompeting interests declared.Journal of the American College ofSurgeons.2002；194:131–5.

23.Rullier E,Rouanet P,Tuech J-J,Valverde A,Lelong B,Rivoire M,etal.Organ preservation for rectal cancer(GRECCAR 2):a prospective,randomised,open-label,multicentre,phase 3 trial.The Lancet.2017；390:469–79.

24.The 2017 European Society of Coloproctology(ESCP)collaboratinggroup.Evaluating the incidence of pathological complete response in currentinternational rectal cancer practice:the barriers to widespread safe deferralof surgery.Colorectal Dis.2018；20:58–68.

25.Matsutani S,Shibutani M,Maeda K,Nagahara H,Fukuoka T,Nakao S,etal.Significance of tumor-infiltrating lymphocytes before and afterneoadjuvant therapy for rectal cancer.Cancer Science.2018；109:966–79.

26.Gash KJ,Chambers AC,Cotton DE,Williams AC,Thomas MG.Potentiatingthe effects of radiotherapy in rectal cancer:the role of aspirin,statins andmetformin as adjuncts to therapy.Br J Cancer.2017；117:210–9.

27.Ngwa W,Irabor OC,Schoenfeld JD,Hesser J,Demaria S,FormentiSC.Usingimmunotherapy to boost the abscopal effect.Nature Reviews Cancer.2018；18:313–22.

28.Zitvogel L,Galluzzi L,Kepp O,Smyth MJ,Kroemer G.Type I interferonsin anticancer immunity.Nat Rev Immunol.2015；15:405–14.

29.Makena MR,Ranjan A,Thirumala V,Reddy AP.Cancer stem cells:Road totherapeutic resistance and strategies to overcome resistance.Biochim BiophysActa Mol Basis Dis.2018；165339.

30.Barker HE,Paget JTE,Khan AA,Harrington KJ.The tumourmicroenvironment after radiotherapy:mechanisms of resistance andrecurrence.Nat Rev Cancer.2015；15:409–25.

31.Smith FM,Rao C,Oliva Perez R,Bujko K,Athanasiou T,Habr-Gama A,etal.Avoiding radical surgery improves early survival in elderly patients withrectal cancer,demonstrating complete clinical responseafter neoadjuvanttherapy:results of a decision-analytic model.Dis Colon Rectum.2015；58:159–71.

32.Sclafani F,Brown G,Cunningham D,Wotherspoon A,Mendes LST,Balyasnikova S,et al.Comparison between MRI and pathology in the assessmentof tumour regression grade in rectal cancer.British Journal of Cancer.2017；117:1478–85.

33.Hupkens BJP,Maas M,Martens MH,van der Sande ME,Lambregts DMJ,Breukink SO,et al.Organ Preservation in Rectal Cancer After Chemoradiation:Should We Extend the Observation Period in Patients with a Clinical Near-Complete Response？Ann Surg Oncol.2018；25:197–203.

34.Nilbert M,Planck M,Fernebro E,

35.Marliot F,Chen X,Kirilovsky A,Sbarrato T,Sissy CE,Batista L,etal.Analytical validation of the Immunoscore and its associated prognosticvalue in patients with colon cancer.J Immunother Cancer.BMJ SpecialistJournals；2020；8:e000272.